一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体浓度的检测方法与流程

本发明属于活性抗体浓度检测领域，具体涉及一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体浓度的检测方法。

背景技术：

1、抗淋巴细胞球蛋白(antilymphocyte globulin，alg)是以人淋巴细胞、jurkat细胞或者人胸腺细胞作免疫抗原，使猪、马、兔等动物免疫而制得，为强效免疫控制剂。目前关于抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法报道比较多，但是关于抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体浓度的检测方法却鲜有报道。

2、中国专利cn116413436a公开了一种改进的人免疫球蛋白定量酶联免疫分析方法，所述方法设置一条或两条标准曲线，a、当设置一条标准曲线时，待测样品在标准曲线前后各加样至少1次；待测样品的检测结果取各样品检测结果的平均值；b、当设置两条标准曲线时，待测样品在两条标准曲线中间加样至少1次；待测样品的检测结果取两条标准曲线拟合结果的平均值，进一步提高了检测结果的准确性和方法的可操作性。但是，其检测的是总抗体的浓度，并非是针对活性抗体浓度进行定量检测，而具体效果却和产品中所含有的活性抗体浓度息息相关。因此，急需一种检测抗人淋巴细胞免疫球蛋白中活性抗体浓度的方法。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体浓度的检测方法。

2、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体浓度的检测方法，包括以下步骤：首先使用免疫细胞对待检测样品进行吸附，然后使用流式细胞术检测孵育吸附后活性抗体所减少的比例，再通过elisa检测总抗体所减少的浓度，最后经过计算得出待检测样品中活性抗体的浓度和占总抗体的比例。

4、进一步地，所述吸附步骤如下：将免疫细胞用pbs缓冲液稀释，离心去上清液，将待检测样品用pbs缓冲液稀释，重悬免疫细胞，4℃孵育2小时，孵育完成后1500～2500rpm离心3～8min，取上清液，再次7000～9000rpm离心1～3min，取上清液，即得吸附后的样品。

5、进一步地，所述免疫细胞为人外周血淋巴细胞、jurkat细胞中任一种。

6、在一些具体实施例中，优选的，免疫吸附时免疫细胞的用量为2～4×106个/ml。

7、在一些具体实施例中，优选的，当待检测样品为抗人淋巴细胞猪免疫球蛋白时，pbs稀释后浓度为20μg/ml-50μg/ml，当待检测样品为兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白时，pbs稀释后浓度为10μg/ml-20μg/ml。

8、进一步地，所述待检测样品包括抗人淋巴细胞猪免疫球蛋白、抗人t淋巴细胞兔免疫球蛋白、兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白中任一种。

9、在一些具体实施例中，优选的，当待检测样品为抗人淋巴细胞猪免疫球蛋白时，所述流式细胞术检测中荧光偶联二抗为羊抗猪igg偶联fitc抗体，所述elisa检测中用兔抗猪igg抗体包被酶标板，二抗为羊抗猪igg偶联hrp抗体；

10、当待检测样品为抗人t淋巴细胞兔免疫球蛋白或兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白时，所述流式细胞术检测中荧光偶联二抗为羊抗兔igg偶联fitc抗体，所述elisa检测中用羊抗兔igg抗体进行包被酶标板，二抗为鼠抗兔igg偶联hrp抗体。

11、进一步地，所述流式细胞术检测步骤如下：

12、利用抗人淋巴细胞免疫球蛋白标准品获取标准曲线ⅰ，取待检测样品稀释，加入到免疫细胞中进行孵育吸附，用流式细胞术检测吸附前后荧光值，根据上述标准曲线ⅰ，计算吸附前后样品的相对浓度，根据以下方程计算吸附后样品活性抗体减少的比例：

13、ad＝1-fd/fn

14、其中，ad为吸附后样本活性抗体减少的比例，fn为吸附前样本活性抗体的相对浓度，fd为吸附后样本活性抗体的相对浓度；

15、所述elisa检测步骤如下：

16、利用抗人淋巴细胞免疫球蛋白标准品获取标准曲线ⅱ，对上述吸附前后的样品，用elisa检测od值，根据上述标准曲线ⅱ，计算吸附前后样品中总抗体浓度，根据以下方程计算吸附后样品活性抗体减少的比例：

17、td＝1-ed/en

18、其中，td为吸附后样品中总抗体减少的比例，en为吸附前样品中总抗体浓度，ed为吸附后样品中总抗体浓度；

19、得出ad和td后，td除以ad即为样品中活性抗体占总抗体的比例，公式如下：

20、pa＝td/ad

21、活性抗体的占比pa乘以样品中总抗体浓度即为活性抗体的浓度。

22、上所述检测方法在原料血浆、成品及用药患者血浆中的活性抗体浓度检测上的应用。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

24、(1)本发明以人外周血淋巴细胞、人t淋巴细胞系或者其他免疫细胞为材料，通过流式细胞术和酶联免疫吸附实验，定量检测抗人淋巴细胞免疫球蛋白产品中能够特异结合免疫细胞表面抗原的活性抗体浓度。

25、(2)本发明检测方法能够定量检测原料血浆或患者血浆中抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体的浓度，解决了以往抗人淋巴细胞免疫球蛋白生产过程中，无法对原料血浆中活性抗体定量检测的问题。

技术特征：

1.一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体浓度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：首先使用免疫细胞对待检测样品进行吸附，然后使用流式细胞术检测孵育吸附前后待检测样品中活性抗体所减少的比例，再通过elisa检测孵育吸附前后待检测样品中总抗体所减少的浓度，最后经过计算得出待检测样品中活性抗体的浓度和占总抗体的比例。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述吸附步骤如下：将免疫细胞用pbs缓冲液稀释，离心去上清液，将待检测样品用pbs缓冲液稀释，重悬免疫细胞，4℃孵育2小时，孵育完成后1500～2500rpm离心3～8min，取上清液，再次7000～9000rpm离心1～3min，取上清液，即得吸附后的样品。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述免疫细胞为人外周血淋巴细胞、jurkat细胞中任一种。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，免疫吸附时免疫细胞的用量为2～4×106个/ml。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，当待检测样品为抗人淋巴细胞猪免疫球蛋白时，pbs稀释后浓度为20μg/ml-50μg/ml，当待检测样品为兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白时，pbs稀释后浓度为10μg/ml-20μg/ml。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待检测样品包括抗人淋巴细胞猪免疫球蛋白、抗人t淋巴细胞兔免疫球蛋白、兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白中任一种。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，当待检测样品为抗人淋巴细胞猪免疫球蛋白时，所述流式细胞术检测中荧光偶联二抗为羊抗猪igg偶联fitc抗体，所述elisa检测中用兔抗猪igg抗体包被酶标板，二抗为羊抗猪igg偶联hrp抗体；

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流式细胞术检测步骤如下：

9.权利要求1-8任项所述检测方法在原料血浆、成品及用药患者血浆中的活性抗体浓度检测上的应用。

技术总结
本发明提供一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白活性抗体浓度的检测方法，本发明结合酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式细胞术对抗人淋巴细胞免疫球蛋白中活性抗体的浓度进行检测。首先使用免疫细胞对待检测样品进行吸附，然后使用流式细胞术检测孵育吸附前后待检测样品中活性抗体所减少的比例，再通过ELISA实验检测孵育吸附前后待检测样品中总抗体所减少的浓度，经过计算得出待检测样品中活性抗体的浓度和占总IgG抗体的比例。本发明方法可以用于检测原料血浆、成品及用药患者血浆中活性抗体的浓度。

技术研发人员：殷文曲,邹浩勇,耿鹏,聂希霖,余泽琼,王胤霖,杨金良,杨帆,余沁宇,周小璐,许宽宏
受保护的技术使用者：武汉中生毓晋生物医药有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29