本发明涉及多倍体育种领域,具体涉及一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法。
背景技术:
1、白菜型油菜(brassicacampestrisl.)是油菜三大类型之一,又称小白菜,矮油菜,甜油菜等。属于十字花科芸薹属作物,在我国蔬菜生产中占有重要地位。多倍体与二倍体比拥有较大的营养器官和生殖器官,营养物质更为丰富,并且在生长过程中表现出更强的抗性。根据与二倍体植株在形态学、细胞学以及dna含量上的差异,目前,多倍体鉴定主要涉及三种途径。形态学:与二倍体相比,多倍体植株具有叶片增厚、花器官变大及花粉粒形态异常等特点,常用来初期筛选变异株。但是在生产实际中,植株也常因生长条件变化而表现出形态上的差异,因此利用形态学判断植株倍性准确率较低。细胞学:利用染色体制片技术,对根尖体细胞、雄蕊减数分裂细胞及雌蕊体细胞进行染色体计数,能够准确、直接地判断植株倍性,但是制片过程较为复杂,难以在短时间内实现大批量鉴定。dna含量鉴定:采用流式细胞术,对叶片细胞核dna含量进行分析,通过与二倍体dna含量相比判断植株倍性,但对所需仪器设备要求高,价格昂贵,以及需结合染色体计数才能精准确定植株倍性。
2、拟南芥和芸薹属植物萌发沟数量与花粉倍性相关。开花植物的花粉粒被外壁包围,外壁不均匀沉积在花粉粒表面,导致某些区域几乎没有外壁物质,这些区域发育成萌发沟,帮助花粉水合、改变体积和萌发。在拟南芥中,二倍体和三倍体植株的花粉粒一般为三沟萌发沟,四倍体植株的花粉粒大多为四沟或者六沟萌发沟。
技术实现思路
1、为解决上述问题,本发明提供了一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,具有高效、节约成本、准确率高的特点,能在短时间内实现对白菜型油菜同源四倍体的批量检测。
2、为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
3、一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,包括以下步骤:
4、s1、待加倍处理植株开花,形态学观察后选出四倍体疑似株;
5、s2、取四倍体疑似株的新鲜未开放花蕾置于干净的载玻片上,于带目镜测微尺的体式显微镜下观察并记录花蕾长度,去除萼片及花瓣,并取出六个花药置于清水中;
6、s3、取一个所述的花药置于另一个干净载玻片上,滴加少量清水,切断花药,用解剖针轻轻挤压花药腔释放出花粉粒,挑出杂质,滴加20μl 0.5%dapi染液并混匀,避光染色10min后盖上盖玻片,制成临时装片1;
7、s4、在正置荧光显微镜下观察临时装片1并记录小孢子发育时期,若小孢子处于单核时期,则进行下一步;若小孢子处于其他时期,则重复步骤s1-s4;
8、s5、取余下五个步骤s2所述的花药,整齐排列在干净的载玻片上,滴加清水,切断花药,用解剖针挤压花药腔释放出花粉粒,去除碎片,滴加20μl0.5%改良苯酚品红溶液并混匀,轻轻盖上盖玻片,用滤纸吸去多余染液,制成临时装片2;
9、s6、在普通光学显微镜下对临时装片2中的花粉粒形态进行观察,若视野范围内花粉粒形态为四瓣及以上,则判定为四倍体;若视野范围内花粉粒形态为三瓣,则判定为二倍体;
10、s7、在鉴定余下四倍体疑似株时,挑选在s2所记录的新鲜花蕾在单核时期的长度范围内的新鲜花蕾,直接进行步骤s5-s6。
11、进一步地,所述的步骤s2中,取出的六个花药要注意保湿,避免萎蔫。
12、进一步地,所述的步骤s4中,所选花蕾应处于单核小孢子时期,若花蕾处于减数分裂时期,四个小孢子还未释放;若花蕾处于二核及三核时期,花粉粒逐渐变大变圆,不便于判断其形态。
13、进一步地,所述的步骤s5中,需完全释放花粉粒,盖上盖玻片后避免按压,以免压碎花粉粒,破坏其形态。
14、进一步地,所述的步骤s6中,临时装片2与临时装片1应来源于同一花蕾,且每个装片至少观察三个视野。
15、进一步地,所述的步骤s7中,根据每个物种不同品种间的差异,其单核期花粉的花蕾长度不同。因此,对白菜型油菜中不同品种中的二倍体及四倍体疑似株,每个品种的单核期花蕾长度范围测定应至少选择3株二倍体或四倍体疑似株,每株至少重复5个花蕾,以确保具有生物学统计意义。
16、进一步地,所述的步骤s7中,直接鉴定同源四倍体疑似株时,每个植株至少挑选三个花序,同一花序至少挑选三个花蕾。
17、本发明具有以下有益效果:
18、1、本发明首先利用目镜测微尺测量加dapi染色法判断白菜型油菜新鲜单核小孢子时期花蕾的长度范围,之后根据此长度范围直接选取新鲜花蕾,改良苯酚品红染色法对花粉粒进行染色随之判断花粉粒形态。利用本发明技术方案,解决了现有技术中白菜型油菜同源四倍体鉴定过程复杂、周期长等问题。
19、2、相较于形态学鉴定、染色体计数鉴定及流式细胞术,本发明技术方案操作简单易行,成本低,仪器设备要求低,但准确率高,能够实现白菜型油菜同源四倍体的快速批量鉴定。
1.一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于:包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于:所述的步骤s2中,取出的六个花药要注意保湿,避免萎蔫。
3.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于:所述的步骤s4中,所选花蕾应处于单核小孢子时期,若花蕾处于减数分裂时期,四个小孢子还未释放;若花蕾处于二核及三核时期,花粉粒逐渐变大变圆,不便于判断其形态。
4.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于:所述的步骤s5中,需完全释放花粉粒,盖上盖玻片后避免按压,以免压碎花粉粒,破坏其形态。
5.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于:所述的步骤s6中,临时装片2与临时装片1应来源于同一花蕾,且每个装片至少观察三个视野。
6.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于:所述的步骤s7中,每个品种的单核期花蕾长度范围测定应至少选择3株二倍体或四倍体疑似株,每株至少重复5个花蕾。
7.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于:所述的步骤s7中,直接鉴定同源四倍体疑似株时,每个植株至少挑选三个花序,同一花序至少挑选三个花蕾。