一种沙门氏菌的ELISA检测方法与流程

本发明涉及微生物检测领域，尤其涉及一种沙门氏菌的elisa检测方法。

背景技术：

1、沙门氏菌为肠杆菌科成员，是一群多寄生在动物肠道内的革兰氏阴性直杆菌，其宿主广泛，能够感染包括人类在内的多种动物，如哺乳动物、禽类、鸟类、爬行类、鱼类以及昆虫等。沙门氏菌主要引起人类的伤寒、副伤寒、急性胃肠炎和败血症等疾病，感染动物可导致败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症，解决上述问题的前提首先需要精准检测手段的支持。目前，食源性致病菌检测方法很多，大致可以分为传统的检测方法、免疫学检测方法以及现代分子生物学检测方法等。平皿培养法等传统检测方法应用较广泛，检测结果相对稳定，但操作程序繁琐、耗时长，对操作人员的要求较高，传统的检测方法已经不足以保障食品安全问题。免疫学检测方法能够更加准确，高效地检测沙门氏菌，其中，elisa检测方法敏感性高，特异性强，是检测沙门氏菌的有效手段之一。

2、目前，沙门氏菌elisa检测方法的原理是通过特异性抗体检测沙门氏菌表面的抗原，沙门氏菌表面的抗原包括菌体（o）抗原和鞭毛（h）抗原，少部分沙门氏菌会在o抗原的表面产生一种多糖，称为荚膜（vi）抗原。o抗原位于细胞膜外，主要成分为脂多糖（lps），其性质比较稳定，耐高温处理，且不易被乙醇和0.1%石碳酸等破坏。由重复排列的寡糖链组成的多糖主链和特殊的单糖组成的侧链共同决定了o抗原的特异性和抗原决定簇，能够刺激机体早期产生igm抗体；h抗原为沙门氏菌的鞭毛蛋白，与细菌的毒力相关，能够刺激机体产生igg抗体，h抗原能够耐甲醇处理，但易被乙醇破坏，且对热不稳定。vi抗原为覆盖在o抗原上的表面抗原，能够阻止抗体与o抗原结合，vi抗原主要由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸组成。pagc是沙门氏菌的外膜蛋白，除了在少部分人源血清型沙门氏菌中不存在外，广泛分布于各类猪源和禽源血清型沙门氏菌中。pagc是一个跨膜通道蛋白，属于外膜蛋白中微孔蛋白的一种，全长185个氨基酸，呈β-桶装结构。pagc的保守性最好，在属内的同源性可达到95％以上。因此，检测动物源性沙门氏菌外膜蛋白pagc是检测沙门氏菌的理想途径。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是目前的沙门氏菌的elisa检测方法准确度不足，容易产生交叉反应。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种沙门氏菌的elisa检测方法，包括以下步骤：

3、（1）用捕获抗体包被酶标板；

4、（2）用封闭液封闭酶标板；

5、（3）加入样品；

6、（4）加入检测抗体；

7、（5）加入酶标二抗；

8、（6）加入显色液显色；

9、（7）酶标检测od值；

10、所述捕获抗体包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含如seq id no：5-7所示hcdr1-3，轻链可变区包含如seq id no：12-14所示lcdr1-3；

11、所述检测抗体包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含如seq id no：23-25所示hcdr1-3，轻链可变区包含如seq id no：30-32所示lcdr1-3。

12、优选地，所述捕获抗体重链可变区的h-fr1-4如seq id no：8-11所示，轻链可变区的l-fr1-4如seq id no：15-18所示。

13、优选地，所述检测抗体重链可变区的h-fr1-4如seq id no：26-29所示，轻链可变区的l-fr1-4如seq id no：33-36所示。

14、优选地，所述捕获抗体重链可变区如seq id no：2所示，轻链可变区如seq id no：4所示。

15、优选地，所述检测抗体重链可变区如seq id no：20所示，轻链可变区如seq idno：22所示。

16、优选地，所述捕获抗体重链如seq id no：1所示，轻链如seq id no：3所示。

17、优选地，所述检测抗体重链如seq id no：19所示，轻链如seq id no：21所示。

18、优选地，所述封闭液为3%脱脂奶粉。

19、优选地，所述酶标二抗为hrp-m13。

20、优选地，所述捕获抗体和检测抗体与pagc蛋白结合。

21、优选地，所述pagc蛋白如seq id no：37所示。

22、优选地，沙门氏菌的elisa检测方法的具体步骤为：

23、（1）包被：将捕获抗体用1×pbs稀释成2μg/ml，涡旋仪混匀后，100μl/孔，4℃过夜；

24、（2）封闭：用pbst洗板三次，用3%脱脂奶粉封闭，300μl/孔，37℃封闭1h；

25、（3）加样品：弃去封闭液，用pbst洗板三次，加入适宜浓度的肠炎沙门氏菌，用pbs缓冲液作为阴性对照，100μl/孔，37℃孵育1h；

26、（4）加入检测抗体：将用生物素标记的检测抗体稀释成0.5μg/ml后，以100μl/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；

27、（5）加入酶标二抗：弃去上清液，用pbst手动洗板十次，将hrp-m13酶标二抗1:6000倍稀释后加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h；

28、（6）显色：用pbst洗板六次，每孔加入100μl的显色液，37℃显色15min，每孔加入50μl的2m h2so4终止反应，酶标仪读取od450nm处的数值。

29、在本发明的较佳实施方式中，本发明还提供了一种沙门氏菌的elisa检测试剂盒，包括：捕获抗体、检测抗体、酶标板、封闭液、洗涤液、酶标二抗和显色液。

30、本发明检测沙门氏菌的方法灵敏度高，检测限达1.05×103cfu/ml；特异性强，对其他食源性致病菌的捕获率均低于15%。

31、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

技术特征：

1.一种沙门氏菌的elisa检测方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述捕获抗体重链可变区的h-fr1-4如seq id no：8-11所示，轻链可变区的l-fr1-4如seq id no：15-18所示，所述检测抗体重链可变区的h-fr1-4如seq id no：26-29所示，轻链可变区的l-fr1-4如seq id no：33-36所示。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述捕获抗体重链可变区如seq idno：2所示，轻链可变区如seq id no：4所示，所述检测抗体重链可变区如seq id no：20所示，轻链可变区如seq id no：22所示。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述捕获抗体重链如seq id no：1所示，轻链如seq id no：3所示，所述检测抗体重链如seq id no：19所示，轻链如seq id no：21所示。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述封闭液为3%脱脂奶粉。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶标二抗为hrp-m13。

7.根据权利要求1-4任一所述的检测方法，其特征在于，所述捕获抗体和检测抗体与pagc蛋白结合。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述pagc蛋白如seq id no：37所示。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，沙门氏菌的elisa检测方法的具体步骤为：

10.一种沙门氏菌的elisa检测试剂盒，其特征在于，其包括：捕获抗体、检测抗体、酶标板、封闭液、洗涤液、酶标二抗和显色液；

技术总结
本发明涉及微生物检测领域，尤其涉及一种沙门氏菌的ELISA检测方法。所述沙门氏菌的ELISA检测方法，包括以下步骤：用捕获抗体包被酶标板；用封闭液封闭酶标板；加入样品；加入检测抗体；加入酶标二抗；加入显色液显色；酶标检测OD值。本发明检测沙门氏菌的方法灵敏度高，检测限达1.05×10<supgt;3</supgt;cfu/mL；特异性强，对其他食源性致病菌的捕获率均低于15%。

技术研发人员：李金峰,赵芳,张胜,刘宜仲,黄守民,赵婕
受保护的技术使用者：深圳市检验检疫科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15