一种N-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法与流程

本发明属于分析检测，具体涉及一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法。

背景技术：

1、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，白色至类白色结晶，用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体；n-羟基琥珀酰亚胺作为一种重要的有机合成中间体，在医药生产领域中应用非常广泛，同时也可以用于合成丁胺卡那霉素、放射性药物的标记、制造生物医学材料。此外，nhs也是一种生物相容性较好的新型交联剂，可用作胶原、明胶等三维网状结构的生成，其交联效率高，交联较为稳定，毒性低，近年来越来越受到关注。

2、交联工艺完成后，交联剂本身的残留定量检测是个亟待解决的技术难题；目前nhs残留含量的检测方法并不成熟，如反相色谱法和体积排阻色谱法，发现均不能满足检测需求；即便也有文献报道利用高效液相色谱法实现了nhs的检测，但是也往往面临操作繁琐、检测精度不高等技术问题。因此，亟需研究一种高效、精准的nhs残留检测方法。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题，提供一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，通过优化流动相、色谱柱、柱温、流速等，设计了针对n-羟基琥珀酰亚胺残留量检测的整体化方案，显著提升了检测精度，实现了nhs残留的高效、精准检测。

2、为实现上述目的，本发明的具体方案如下：

3、一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，采用色谱柱为ultimate aq-c18，色谱柱的柱温为25-35℃；流动相为0.05％-0.15％磷酸水溶液，ph为2-3；流速为0.3-0.7ml/min，检测波长为208-210nm；进样体积15μl-20μl；记录时间为20-40min；

4、优选的，所述色谱柱的直径为4.6mm，长为250mm，粒径为5μm。

5、优选的，磷酸水溶液的浓度为0.1％，ph为2.12。

6、优选的，流速为0.5ml/min。

7、优选的，色谱柱柱温为30℃。

8、优选的，进样体积15μl。

9、优选的，记录时间为20min。

10、本发明所述方案包括配制nhs的对照品溶液和供试品溶液；

11、(1)nhs的对照品(标准品)溶液的制备：

12、精密称定nhs，加水溶解，并稀释为一系列梯度浓度的稀释液，最后经微孔滤膜滤过，得到nhs的对照品溶液。

13、(2)供试品溶液的制备：

14、取供试品加入水中溶解，得到溶液记为混合溶液a；其中供试品与水的用量比为1-3g:10ml，对混合溶液a称重记为m1，再经25-50℃加热1-24小时后，冷却至室温，再次称定重量记为m2，然后用纯水补足减失的重量，即m1-m2；摇匀，经离心取上清液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

15、优选的，步骤(1)中稀释液的浓度范围为0.02μg/ml-2μg/ml(本发明取值范围0.03125μg/ml-2μg/ml)。

16、优选的，步骤(1)中微孔滤膜的孔径为0.22μm。

17、优选的，步骤(2)中，供试品与水的用量比为2g：10ml。

18、优选的，步骤(2)中，加热的温度为37℃，加热时间为2h。

19、优选的，步骤(2)中，离心的条件为：8000转，离心10-15分钟。

20、所述方案还包括如下步骤：

21、首先将nhs的对照品溶液注入色谱仪，记录色谱图，以nhs对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积作直线回归，绘制nhs的标准曲线；然后将供试品溶液按照与对照品溶液相同的条件进行hplc检测，根据标准曲线确定供试样中nhs的含量。

22、注：以nhs对照品溶液的浓度对应其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品溶液中nhs含量(μg/g)。

23、(1)供试品nhs残留量(μg/g)＝供试品溶液nhs的平均浓度×稀释倍数。

24、(2)直线回归相关系数应不低于0.99。

25、本发明具备如下有益效果：

26、(1)本发明针对小分子nhs极性大，选择色谱柱为ultimate aq-c18，直径为4.6mm，长为250mm，粒径为5μm；其系统适应性好，提高了仪器使用效率，缩短了数据采集以及数据分析时间，在很大程度上提高了实验效率，更有利于nhs的分析检测。

27、(2)本发明通过优化，创造性的选择磷酸水溶液(0.1％)为流动相，其极性大，与nhs结合能力强；而且其配制简单，在使用过程中更加稳定，洗脱更加方便，有利于仪器的维护。

28、(3)本发明合理优化了色谱柱柱温(30℃)、流速(0.5ml/min)、进样体积(15μl)等条件，使得出峰时间合适、稳定，样品峰和溶剂峰分离度好，检测精度可达10-2ng/ml。

29、(4)本发明通过优化流动相、色谱柱、柱温、流速等参数，设计了针对n-羟基琥珀酰亚胺残留量检测的整体化方案，实现了nhs残留的高效检测，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，

2.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的直径为4.6mm，长为250mm，粒径为5μm。

3.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，磷酸水溶液的浓度为0.1％，ph为2.12。

4.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，流速为0.5ml/min。

5.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，色谱柱柱温为30℃。

6.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，进样体积15μl；记录时间为20min。

7.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，步骤(1)中稀释液的浓度范围为0.02μg/ml-2μg/ml；微孔滤膜的孔径为0.22μm。

8.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，供试品与水的用量比为2g:10ml。

9.根据权利要求1所述的一种n-羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，加热的温度为37℃，加热时间为2h；离心的条件为：8000转，离心10-15分钟。

10.根据权利要求1～9任一项所述方法在检测n-羟基琥珀酰亚胺残留量中的应用。

技术总结
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种N‑羟基琥珀酰亚胺残留量的检测方法；采用色谱柱为Ultimate AQ‑C18，柱温为25‑35℃；流动相为磷酸水溶液；本发明针对小分子NHS极性大，优选了色谱柱，并结合控制柱温，提高了仪器使用效率，缩短了数据采集以及分析时间，提高了检测效率；同时创造性的选择磷酸水溶液为流动相，具备极性大、与NHS结合能力强、稳定性高的优势，而且其配制简单，洗脱更加方便。进一步结合优化流动相pH、流速、进样体积等参数，设计了针对NHS残留量检测的整体化方案，出峰时间合适、稳定，样品峰和溶剂峰分离度好，实现了高效、精准检测，检测精度可达10<supgt;‑2</supgt;ng/mL，应用前景广阔。

技术研发人员：魏雪花,储筠,翟源心,李佳佳,周林利,吴鹏,李海航,钱松
受保护的技术使用者：江苏创健医疗科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6