本发明涉及药物筛选，尤其涉及基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法。
背景技术：
1、高通量筛选技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。药物筛选是新药研发的关键步骤，创新药物的发现需要采用适当的药物作用靶点对大量化合物样品进行筛选，在临床前实验阶段，需要对药物的安全性和有效性进行分析、检测，在一过程中涉及数以千计的样本，考量包括药物浓度、递送方式、生物微环境、细胞种类等条件因素。目前，临床抗肿瘤最有效的联合疗法，则需要筛选万甚至十万量级的药物组合方案，肿瘤细胞对于药物或化合物的敏感性通常通过细胞毒试验得到。细胞毒试验有很多方法，较为常见的是通过染色手段将细胞的活性信息转化为光学信号，经检测光学信号推导出活细胞的数量，从而判断用药物产生的细胞毒性。
2、目前，mtt、srb法是最普遍、最常用的细胞毒实验方法，已有很多研究者采用该方法进行药物筛选，但是，这些方法存在速度慢、灵敏度差、自动化程度低等缺陷，难以满足高通量药物筛选的需要。其它用于细胞毒性检测的方法包括hplc检测法、同位素标记检测法和流式细胞仪法等，这些方法存在分别存在手段繁琐、具有放射性污染和适用细胞类型有限等不足之处。
3、为此，我们提出基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法。
技术实现思路
1、本发明主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案，基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，通过以下步骤实现：s1：染色测量活细胞数法；s2：双染法评价药物诱导细胞凋亡；s3：分析药物诱导凋亡作用模式；s4：统计每个细胞的荧光强度。
3、作为优选，染色测量活细胞数法通过细胞样品用pbs清洗2次，取样品置于戊二醛中固定,吸走戊二醛,加入pbs清洗3次,用pbs配10mg/ml的bsa溶液,每个样品加1ml,加入pbs清洗3次，用pbs配一抗溶液(actin),按体积比actin:pbs＝1:50稀释,每个样品加50μl，吸走actin,加入pbs清洗3次,每个样品加50μl，于37℃下孵育30min以上吸走igg,每个样品加50μl，于37℃下孵育30min以上吸走fitc-igg,加入pbs清洗3次,每次5min用荧光显微镜拍照。
4、作为优选，双染法评价药物诱导细胞凋亡通过用绿色荧光探针yf488标记的annexin v和碘化丙啶(propidium iodide,pi)，pi可以由488,532或546nm的激光激发，呈现红色荧光；取对数生长期细胞接种于6孔板或6cm培养皿；将收集的培养基和细胞混匀,4℃ 300g离心5min,弃上清；用预冷的pbs洗涤细胞2次,每次4℃ 300g离心5min，弃上清；用预冷的pbs洗涤细胞2次,每次4℃ 300g离心5min，加入1x binding buffer,将细胞调节成相同浓度(一般为1x106/ml)，取1-2x105个细胞悬液于流式管中,加入适量标记了荧光染料的annexin v和适量pi,轻轻混匀，室温避光孵育15-20min，加入300μlpbs重悬细胞。
5、作为优选，annexin v和pi两种染料双染后，使用荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光+强蓝色荧光。
6、作为优选，分析药物诱导凋亡作用模式通过在细胞悬液中加入20μlproteinase k溶液和200μl缓冲液gb，加入一个吸附柱cb3中，12000rpm(～13400xg)离心30sec,将吸附柱cb3放回收集管中，向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd12000 rpm(～13,400x g)离心，向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm(～13,400xg)离心30sec,向吸附膜的中间部位悬空滴加50至200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min,12000r pmn(～13,400xg)离心2min，倒掉废液，吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50至200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min,12000r pmn(～13400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。
7、作为优选，统计每个细胞的荧光强度通过取对数生长期细胞，用edta-胰酶混合溶液消化后，以2×103细胞或细胞孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μl培养液，在37℃、100％湿度、含5％co2和95％空气的条件下培养24小时后，弃去培养液，分别将各种中药组分和长春新碱加入孔内，每一药物浓度设3个平行孔，每孔加入200μl培养液，孵育48小时后，弃去培养液，每孔加入含fda的细胞凋亡与坏死检测试剂50μl，4℃培养30min后采集孔内细胞图像，统计每个细胞的荧光强度。
8、有益效果
9、本发明提供了基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法。具备以下有益效果：
10、该基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，通过染色测量活细胞数法、双染法评价药物诱导细胞凋亡、分析药物诱导凋亡作用模式以及统计每个细胞的荧光强度，根据不同荧光染料标记及测量细胞内多细胞参数变化的抗肿瘤药物筛选和评价方法可使用单个细胞的形态、结构等多方面的信息来表征细胞的生理或病理特性，因此能够快速区分出具有所需生物学效应的化合物和非特异性作用的化合物。
1.基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，其特征在于：通过以下步骤实现：
2.根据权利要求1所述的基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，其特征在于：所述染色测量活细胞数法通过细胞样品用pbs清洗2次，取样品置于戊二醛中固定,吸走戊二醛,加入pbs清洗3次,用pbs配10mg/ml的bsa溶液,每个样品加1ml,加入pbs清洗3次，用pbs配一抗溶液(actin),按体积比actin:pbs＝1:50稀释,每个样品加50μl，吸走actin,加入pbs清洗3次,每个样品加50μl，于37℃下孵育30min以上吸走igg,每个样品加50μl，于37℃下孵育30min以上吸走fitc-igg,加入pbs清洗3次,每次5min用荧光显微镜拍照。
3.根据权利要求1所述的基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，其特征在于：所述双染法评价药物诱导细胞凋亡通过用绿色荧光探针yf488标记的annexin v和碘化丙啶(propidium iodide,pi)，pi可以由488,532或546nm的激光激发，呈现红色荧光；取对数生长期细胞接种于6孔板或6cm培养皿；将收集的培养基和细胞混匀,4℃ 300g离心5min,弃上清；用预冷的pbs洗涤细胞2次,每次4℃ 300g离心5min，弃上清；用预冷的pbs洗涤细胞2次,每次4℃ 300g离心5min，加入1x binding buffer,将细胞调节成相同浓度(一般为1x106/ml)，取1-2x105个细胞悬液于流式管中,加入适量标记了荧光染料的annexin v和适量pi,轻轻混匀，室温避光孵育15-20min，加入300μlpbs重悬细胞。
4.根据权利要求3所述的基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，其特征在于：所述annexin v和pi两种染料双染后，使用荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光+强蓝色荧光。
5.根据权利要求1所述的基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，其特征在于：所述分析药物诱导凋亡作用模式通过在细胞悬液中加入20μl proteinase k溶液和200μl缓冲液gb，加入一个吸附柱cb3中，12000rpm(～13400xg)离心30sec,将吸附柱cb3放回收集管中，向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd12000 rpm(～13400x g)离心，向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm(～13400xg)离心30sec,倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中，将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm(～13400xg)离心2min，倒掉废液，吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50至200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min,12000r pmn(～13400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。
6.根据权利要求1所述的基于图像分析的肿瘤类器官模型高通量药物筛选方法，其特征在于：所述统计每个细胞的荧光强度通过取对数生长期细胞，用edta-胰酶混合溶液消化后，以2×103细胞或细胞孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μl培养液，在37℃、100％湿度、含5％co2和95％空气的条件下培养24小时后，弃去培养液，分别将各种中药组分和长春新碱加入孔内，每一药物浓度设3个平行孔，每孔加入200μl培养液，孵育48小时后，弃去培养液，每孔加入含fda的细胞凋亡与坏死检测试剂50μl，4℃培养30min后采集孔内细胞图像，统计每个细胞的荧光强度。