一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及医学检测，特别涉及一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、血清淀粉样蛋白a（serum amyloid a protein，saa）是一种正向急性时相反应蛋白，是载脂蛋白家族中的一种异质类蛋白质，相对分子量约为12000。saa是一种急性相蛋白并与血浆高密度脂蛋白（hdl）结合。

2、saa是个灵敏的参数，它在炎性反应大约8h后开始升高，且超过参考范围上限时间早于c-反应蛋白（c-reactive protein，crp），然而crp在正常人中的中位数值与参考范围上限的差距，大约有10倍。在saa中仅有5倍。轻微感染，例如，许多病毒感染，saa升高要比crp更为常见。在感染性疾病中，saa的绝对上升要高于crp，因此saa测定，尤其对“正常”与微小急性相反应可提供更好的鉴别。通常约2/3感冒患者saa升高，但少于1/2的患者相同表现crp升高。在病毒感染病例中，saa和crp浓度升高见于腺病毒感染者。saa和crp的反应形式在急性感染的恢复阶段是平行的，这同时适用于细菌和病毒感染。

3、目前现有技术中，通常采用免疫分析技术检测saa，而标记分子的活化程度低，结合抗体的能力低，对saa的检测灵敏度低，仅能进行静脉血saa的检测，未涉及指尖血saa的检测，样本类型具有局限性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其制备方法，旨在解决无法检测指尖血saa的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提出一种荧光微球的活化方法，包括以下步骤：

3、s10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；

4、s20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；

5、其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。

6、可选地，步骤s20包括：

7、s201、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；

8、s202、将n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；

9、s203、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。

10、本发明还提出一种定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒，用于检测待测血液样本中血清淀粉样蛋白a的含量，所述定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒包括试纸条、荧光微球标记结合物垫抗体及检测垫抗体；其中，所述荧光微球标记结合物垫抗体，包被于所述试纸条，用于与血清淀粉样蛋白a结合以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白a”复合体，所述荧光微球标记结合物垫抗体中的荧光微球包括采用如上述荧光微球的活化方法获得的荧光微球；所述检测垫抗体，包被于所述试纸条，用于与“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白a”复合体结合，以形成“结合物垫抗体-血清淀粉样蛋白a-检测垫抗体”复合体。

11、本发明还提出一种定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，用于制备上述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒，包括以下步骤：

12、s100、将检测垫抗体包被在硝酸纤维素膜上，得检测垫；

13、s200、将荧光微球标记在结合物垫抗体上，得荧光微球标记的结合物垫抗体，将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上，得结合物垫；

14、s300、将样本垫、结合物垫、检测垫及吸水垫依次抵接并贴合在背板上，得试纸条；

15、其中，所述检测垫抗体包括第二检测抗体及第二质控抗体；

16、所述结合物垫抗体包括第一检测抗体及第一质控抗体；

17、所述荧光微球的活化方法包括以下步骤：

18、s10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；

19、s20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；

20、所述活化液包括碳二亚铵溶液、n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。

21、可选地，第一检测抗体包括血清淀粉样蛋白a第一抗体，第二检测抗体包括血清淀粉样蛋白a第二抗体；

22、第一质控抗体包括羊抗鸡igy抗体，第二质控抗体包括鸡igy抗体。

23、可选地，步骤s200中制备荧光微球标记的结合物垫抗体的步骤包括：

24、s210、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；

25、s220、将活化液与荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；

26、s230、将第一检测抗体及第一质控抗体分别与荧光微球活化液混合，得荧光微球偶联液；

27、s240、将封闭液与荧光微球偶联液混合，得荧光微球标记的结合物垫抗体；

28、其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。

29、可选地，步骤s220包括：

30、s221、将碳二亚铵溶液与二异丙基碳二亚胺溶液混合，得混合液一；

31、s222、将n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液与荧光微球溶液混合，得混合液二；

32、s223、将混合液一与混合液二混合，得荧光微球活化液。

33、可选地，荧光微球偶联液中，第一检测抗体及第一质控抗体的蛋白终浓度均为90~110ug/ml。

34、可选地，步骤s100包括：

35、s110、用缓冲液将第二检测抗体及第二质控抗体稀释至浓度为1.8~2.2mg/ml，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。

36、可选地，步骤s200中将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上的步骤包括：

37、s250、用蛋白保护液将荧光微球标记的结合物垫抗体稀释90~110倍，包被于硝酸纤维素膜上，烘干。

38、本发明提供的技术方案中，通过采用碳二亚铵溶液（edc溶液）、n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液（nhs溶液）及二异丙基碳二亚胺溶液（dic溶液）作为活化液，edc首先与荧光微球蛋白结合，初步活化后荧光微球蛋白上仍有多个结合位点，edc分子较大，难以与剩余的结合位点结合，而dic分子较小，可与这些结合位点结合，以形成edc-荧光微球蛋白-dic结合物，在nhs的作用下，荧光微球蛋白上的edc及dic被nhs置换，形成nhs-荧光微球蛋白结合物，即活化荧光微球；采用edc、nhs及dic作为活化液的主要成分，能够增加荧光微球蛋白分子上结合nhs分子的个数，从而提高荧光微球蛋白的活化程度，降低saa的最低检出限，进而具有更高的灵敏度。

技术特征：

1.一种荧光微球的活化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的荧光微球的活化方法，其特征在于，步骤s20包括：

3.一种定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒，用于检测待测血液样本中血清淀粉样蛋白a的含量，其特征在于，包括：

4.一种定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，用于制备如权利要求3所述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，其特征在于，第一检测抗体包括血清淀粉样蛋白a第一抗体，第二检测抗体包括血清淀粉样蛋白a第二抗体；

6.如权利要求4所述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤s200中制备荧光微球标记的结合物垫抗体的步骤包括：

7.如权利要求6所述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤s220包括：

8.如权利要求6所述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，其特征在于，荧光微球偶联液中，第一检测抗体及第一质控抗体的蛋白终浓度均为90~110ug/ml。

9.如权利要求4所述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤s100包括：

10.如权利要求4所述的定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤s200中将荧光微球标记的结合物垫抗体包被在另一硝酸纤维素膜上的步骤包括：

技术总结
本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种荧光微球的活化方法、定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法，荧光微球的活化方法包括以下步骤：S10、将荧光微球分散于缓冲液中，得荧光微球溶液；S20、将活化液与所述荧光微球溶液混合，得荧光微球活化液；其中，所述活化液包括碳二亚铵溶液、N‑羟基硫代琥珀酰亚胺钠溶液及二异丙基碳二亚胺溶液。本发明提供的技术方案中，采用EDC、NHS及DIC作为活化液的主要成分，能够增加荧光微球蛋白分子上结合NHS分子的个数，从而提高荧光微球蛋白的活化程度，降低SAA的最低检出限，进而具有更高的灵敏度。

技术研发人员：李由,林晓歌,刘莹
受保护的技术使用者：深圳市迈科龙生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15