一种人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测方法与流程

本发明属于人类体外辅助生殖，具体涉及一种人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测方法。

背景技术：

1、人类体外辅助生殖技术用液是指与人类配子和/或胚胎发生直接或间接接触，以准备、培养、转移或存储人类配子和/或胚胎的液体类医疗器械产品，如：取卵液、卵子与胚胎处理液、精子洗涤液、精子密度梯度分离液、精子制动液、体外受精液、卵裂胚培养液、囊胚培养液、配子/胚胎冷冻液、配子/胚胎解冻液、培养用油等。

2、

3、硫酸庆大霉素含量现有标准检测方法具体内容如下：

4、精密称取本品适量，加灭菌水溶解并定量稀释制成每1m l中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法(通则1201)测定。可信限率不得大于7％。1000庆大霉素单位相当于1mg庆大霉素。

5、抗生素微生物检定法是通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性(效价)的方法。该方法具体含两种方法。第一法-管碟法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。第二法-浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。

6、不论是第一法管碟法还是第二法浊度法对于体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素的检验均含有以下缺点：

7、1.风险高，检验前需制备多种微生物菌悬液(如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌、啤酒酵母菌、肺炎克雷伯菌、支气管炎博德特菌等)，制备菌悬液并培养的过程中有接触菌液的风险。

8、2.操作繁琐。检定过程中除需配制多种菌悬液并还需配制10～20种培养基对菌悬液以及加以培养检定完成后需根据生物检定统计法的要求对检验结果进行统计和计算。整个检定过程操作繁琐。

9、3.人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素浓度通常为(1～10)μg/l，浓度低，现有技术定量检测难度大，现有技术检测其含量不精准。

10、4.人类体外辅助生殖技术用液通常包含无机盐、ph调节剂、能量底物等、抗生素、溶剂等组分，现有技术硫酸庆大霉素的检测受其干扰。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测方法，包括以下步骤：

2、1)仪器：液相色谱串联四极杆质谱联用仪

3、色谱条件

4、

5、洗脱梯度

6、 时间/min 流动相a(％) 流动相b(％) 0.01 30 70 1.50 30 70 2.00 70 30 6.00 70 30 7.00 30 70 10.00 30 70

7、2)溶液配置，配置下列溶液：

8、a、标准测试溶液的制备：分别准确称取约0.2g标准品溶于10ml容量瓶，本项目称硫酸庆大霉素标准品0.1932g，用水溶解定容，配制成浓度成16885.68μg/ml标准溶液。

9、b、精密移取硫酸庆大霉素标准储备液0.30ml于50ml的容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到浓度约100μg/ml的二级标准储备液。

10、c、从二级储备溶液中分别取0.08、0.10、0.12ml二级标准储备溶液至2ml样品瓶中，加入一定体积的水溶液，摇匀，得到浓度分别为8.00、10.00、12.00g/ml的标准工作溶液，标准工作溶液浓度范围为(1.00～12.00)μg/ml，具体配置见以下准曲线工作溶液配制表：

11、

12、

13、通过上述不断稀释配置，最终得到了标准工作溶液浓度范围为(1.00～12.00)μg/ml标准工作溶液，其中标准工作溶液中的组分为水和硫酸庆大霉素。

14、3)样品配置过程：

15、a、将一定体积乙醇溶液提前放置在-18℃冰箱中冷冻。

16、b、用移液器准确移取1ml样品溶液，缓慢且准确加入-18℃乙醇1.5ml，涡旋30s，用放置在-18℃冰箱中30min，5000r离心8min，取上清液过0.22μm滤膜至2ml透明螺纹口样品瓶中，得到样品测试溶液。

17、通过乙醇与样品溶液的混合，乙醇提取标准溶液中杂质，并通过提取上清液后的过滤得到去除固体杂质，组分为无机盐、ph调节剂、能量底物等、抗生素、溶剂等的样品测试溶液。

18、c、取相同体积的空白液、标准工作液和样品测试溶液依次放入液相色谱串联四极杆质谱联用仪内的进样盘内，其中空白液为纯水。

19、2.根据权利要求1所述一种人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测方法，其特征在于，样品溶液和冰乙醇体积可以同比例增加，如样品2ml+冰乙醇3ml，若样品中无蛋白，可以直接用乙醇稀释2.5倍后进行测试。

20、本发明的有益效果如下：结合液相色谱串联四极杆质谱联用仪对人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测而做的特定参数设定、以及检测方法，使本方法风险低、操作简便，硫酸庆大霉素含量检测精准，不受液中无机盐、ph调节剂、能量底物等、抗生素、溶剂等组分干扰。

技术特征：

1.一种人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测方法，其特征在于，样品溶液和冰乙醇体积可以同比例增加，如样品2ml+冰乙醇3ml，若样品中无蛋白，可以直接用乙醇稀释2.5倍后进行测试。

技术总结
本发明公开了一种人类体外辅助生殖技术用液中硫酸庆大霉素含量检测方法，属于人类体外辅助生殖技术领域，包括色谱柱2.1*100mm，1.7μm，柱温50℃，样品室温度10℃，流速0.2mL/mi n，进样量1.0μL，流动相，流动相A：甲醇，流动相B：0.1％甲酸水溶液，本发明风险低、操作简便，硫酸庆大霉素含量检测精准，不受液中无机盐、pH调节剂、能量底物等、抗生素、溶剂等组分干扰。

技术研发人员：薛松果,匡延平
受保护的技术使用者：江苏瑞辅达医疗器械有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5