一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统

本发明涉及多胺检测，尤其是指一种基于液相色谱-质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统。

背景技术：

1、多胺(包括腐胺put、精胺spm、亚精胺spd及其乙酰化代谢物等)是维持机体生长发育的重要物质，近年的研究表明，大肠癌、结直肠癌患者肠道局部的多胺浓度会显著升高，这与癌细胞需要持续的、高水平的多胺来维持其增殖有关。除此之外，在健康人群中，肠道内多胺通过肠壁吸收进入体循环，发挥改善认知能力、提高线粒体活性功能、延长预期寿命等功能。因此，分析肠内多胺的水平变化有助于评价疾病和健康状态。

2、现有技术通常使用高通量测序方法对肠道菌群组成进行深入表征，但由于多胺类物质的极性较大，高通量测序方法只能将研究停留在肠道菌群层面，无法评价肠道菌群产生多胺的代谢功能，因此涌现出许多对血液或尿液中的多胺进行定量分析的方法。xiong等人公开了一种利用高效液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)检测人血浆样品中的衍生化多胺的浓度的方法(chromatographia,2016)，该方法使用将多胺衍生化处理后，评价肿瘤患者血浆中的多胺状态。cn106381326a公开了一种用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒及其检测方法，利用乙酰多胺氧化酶催化天然底物，检测样本中乙酰多胺的含量。cn110887910a公开了一种多胺及其合成通路物质的检测方法，采用丹磺酰氯或苯甲酰氯为衍生化试剂，利用lc-ms/ms技术建立了柑橘根系中9种生物胺提取及准确定量检测的方法。

3、上述技术以血液或尿液作为样本来源，并对其进行衍生化处理或乙酰化处理，用于定量多胺的静态浓度。然而肠道微生物在人体内持续进行代谢活动，上述方法无法以动态形式评价肠道多胺的代谢水平。且血浆中的多胺浓度虽然能够反映全身器官和组织的多胺水平，但无法直观体现肠内多胺水平。此外，经过一次样本处理只能得到多胺检测的单一结果，而无法对肠道菌群多胺合成功能进行包括多胺种类和多胺浓度在内的全方位评价。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明旨在开发一种检测肠道菌群多胺代谢活性和肠内多胺定量的检测方法，通过检测人源粪便中的多胺水平，从而评价肠道内多胺。本发明所提供的检测系统简化了待测样本的多胺处理，可以一次性大批量检测代谢物中的多胺，将对肠道微生物的研究分为细胞层和培养基层，揭示细胞内外代谢物的差异，结合同位素示踪代谢组学，联用液相色谱和质谱，依次对样品进行洗脱和示踪，通过一次样本处理即可得到肠道菌群多胺定性和定量的分析结果。

2、本发明的第一个目的是提供一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，检测系统包括肠道微生物厌氧培养基、13c-菊粉溶液、衍生化试剂、缓冲液、终止液、萃取溶剂、液相色谱装置和质谱装置。

3、进一步地，检测系统的检测对象为待测者的粪便。

4、进一步地，上述检测系统采用以下步骤进行检测：

5、步骤s1：厌氧培养待测样本中的肠道微生物，加入13c-菊粉孵育，分别收集上清液和沉淀为培养基层和细胞层，细胞层进行淬灭处理；

6、步骤s2：提取培养基层和细胞层中的代谢物，分别获得含有培养基层代谢物和细胞层代谢物的待测溶液，进行衍生化处理，衍生化试剂与待测溶液的体积比为2-5:1；

7、步骤s3：终止衍生化反应，使用萃取溶剂进行液-液萃取获得衍生化产物，萃取溶剂与待萃取溶液的体积比为为2-10:1，使用液相色谱质谱联用进行分析。

8、进一步地，肠道微生物厌氧培养基包括氧气指示剂、半胱氨酸盐酸盐、酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢钾、氯化钠、二氨基硫酸、硫酸镁和二氯化钙。

9、优选地，氧气指示剂为刃天青。

10、优选地，肠道微生物培养基的组成为半胱氨酸盐酸盐300-303mg、酵母提取物250-260mg、胰蛋白胨500-550mg，磷酸二氢钾120-125mg、磷酸氢钾157-160mg、氯化钠241-243.2mg、二氨基硫酸242-244mg、硫酸镁25-26mg、二氯化钙25-27mg。

11、进一步地，衍生化试剂为芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺fmoc-osu。使用该衍生物试剂得到的衍生化产物稳定，不仅可以在常温下进行检测，还能经过长时间放置而不发生降解。

12、优选地，进行衍生化处理时，将fmoc-osu溶解于乙腈中。

13、优选地，缓冲液由碳酸氢钠、碳酸钠和edta组成，ph值调节至10.2。

14、进一步地，液相色谱的固定相为c18色谱柱，流动相a为甲酸-水溶液，流动相b为乙腈。

15、优选地，甲酸与水的质量比为1:1000。

16、进一步地，液相色谱的梯度洗脱条件为：

17、0-10分钟，流动相b梯度从10％到90％；

18、10-14分钟，流动相b梯度保持为90％；

19、14-14.5分钟，流动相b梯度从90％到10％；

20、14.5-20分钟，流动相b梯度保持为10％。

21、进一步地，高分辨质谱装置采用正离子扫描，离子源参数设置为毛细管保持300℃，hesi探头保持325℃，鞘气流量35个单位，喷雾电压设置4000v，质荷比收集范围为75-1000。

22、优选地，步骤s1中，使用乙腈-甲酸混合液对细胞层进行淬灭。

23、优选地，步骤s2中，用于衍生化处理的试剂与待测溶液的体积比为2:1。

24、优选地，步骤s3中，使用甲酸终止衍生化反应。

25、优选地，甲酸与待测溶液的体积比为2:5。

26、优选地，步骤s3中，使用乙酸乙酯进行液-液萃取。

27、进一步地，步骤s3中，先使用液相色谱装置分离待测样本中各组分肠道多胺，再使用高分辨质谱装置对待测肠道多胺进行定量。

28、本发明的第二个目的是提供上述检测系统在制备肠癌诊断产品或肠内多胺代谢水平检测产品中的应用。

29、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

30、(1)本发明简化了对于粪便样本中的多胺处理，剔除食物残渣后，单独孵育肠道微生物，检测粪便中肠道微生物组中的多胺浓度，排除膳食代谢所产生的外源性多胺的干扰，以此评价患者体内的多胺状态，以动态形式评价肠道多胺的代谢水平；

31、(2)本发明将肠道微生物的研究分为细胞层和培养基层，以揭示细胞内和细胞外的代谢物差异。使用本发明提供的检测系统，不仅能够评价已知的多胺代谢途径(腐胺途径)，还能够评价肠道菌群新代谢通路对多胺合成的贡献(非腐胺途径)；

32、(3)本发明将液相色谱和质谱联用，与13c-菊粉标记的稳定同位素示踪代谢组学相结合，快速直接检测肠道菌群的多胺合成功能，利用本发明的检测系统分析肠道微生物中多胺生物合成过程和代谢产物的13c标记模式，通过一次样品处理即可同时得到肠道菌群多胺合成功能的定性(多胺及代谢物种类)和定量(13c同位素富集比)结果。

技术特征：

1.一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于，所述检测系统包括肠道微生物厌氧培养基、13c-菊粉溶液、衍生化试剂、缓冲液、终止液、萃取溶剂、液相色谱装置和高分辨质谱装置。

2.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于，采用以下步骤进行检测：

3.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述检测系统的检测对象为待测者的粪便。

4.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述肠道微生物厌氧培养基包括氧气指示剂、半胱氨酸盐酸盐、酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢钾、氯化钠、二氨基硫酸、硫酸镁和二氯化钙。

5.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述衍生化试剂为芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺fmoc-osu。

6.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述液相色谱的固定相为c18色谱柱，流动相a为甲酸-水溶液，流动相b为乙腈。

7.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于，所述液相色谱的梯度洗脱条件为：

8.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述高分辨质谱装置采用正离子扫描，离子源参数设置为毛细管保持300-350℃，hesi探头保持300-350℃，鞘气流量20-35个单位，喷雾电压设置3500-4500v。

9.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述高分辨质谱装置质荷比收集范围为75-1000。

10.如权利要求1-9任一项所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统在制备肠癌诊断产品或肠内多胺代谢水平检测产品中的应用。

技术总结
本发明涉及多胺检测技术领域，具体涉及一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，检测包括以下步骤：收集待测样本中的肠道微生物，与<supgt;13</supgt;C‑菊粉共同孵育，收集培养基层和细胞层，分别提取代谢物，进行衍生化处理，使用液相色谱质谱联用进行分析。本发明公开的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，包括肠道微生物厌氧培养基、衍生化试剂、<supgt;13</supgt;C‑菊粉溶液、缓冲液、终止液、萃取溶剂、液相色谱装置和质谱装置。使用本发明提供的检测系统对肠道菌群多胺进行检测，只需进行一次样本处理，即可同时得到肠道菌群多胺合成功能的定性和定量结果，检测时间短，灵敏度高，操作难度低，适合广泛运用于大规模实验和分析中。

技术研发人员：邓泮,李欣蔚,周怡璇,肖霞
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31