基于羟基氧化钴纳米片和GR5DNAzyme快速检测铅离子的荧光传感器

本发明属于生物传感器，具体涉及带正电的羟基氧化钴纳米片(cooohnfs)的制备方法，建立了检测铅离子的荧光功能核酸传感器，并应用于水样品中铅离子的检测，为简便快捷检测铅离子提供一种新方法及可靠依据。

背景技术：

1、铅是一种难以被生物降解、易富集于环境及生物体中的重金属离子，通过食物链或者饮用水等进入人体，并在体内累积，严重危害人体的泌尿系统、呼吸系统和神经内分泌系统。研究表明，即使在低水平暴露的情况下，铅离子也会对人体健康造成诸多不良影响，并最终导致疾病，甚至死亡。传统的铅离子检测方法虽然具有准确度高等优势，但样品前处理复杂，并且需要昂贵的精密大型仪器和专业的检测人员，不适用现场检测。因此，迫切需要开发一种便捷、高效、低成本的铅离子检测方法。

2、脱氧核酶(dnazyme)是通过配体的系统进化在指数富集过程中分离的特异性催化dna序列，可以介导多种化学反应，如dna和rna的切割。与蛋白酶相比，脱氧核酶不仅具有理想的催化活性，而且具有可编程性高、易于合成和修饰、化学和热稳定性好、非特异性吸附少等优点。其中，gr-5dnazyme是一种对铅离子具有高选择性，高灵敏度的dnazyme，可以切割含有核糖核酸腺嘌呤(ra)的底物。

3、二维纳米材料能为材料赋予超高的比表面积，为底物催化提供更多的活性位点，从而提升材料的催化性能。coooh nfs的优点之一是可以简单便捷地在短时间内进行大规模制备。此外，cooohnfs表面具有丰富的羟基，以及良好的水分散性与生物相容性，这些特性使之在生物传感等领域的应用更具优势。coooh纳米片本身不具有荧光，将其应用于新型荧光生物传感方法时，需要引入荧光报告分子。因此，开发基于coooh纳米片的荧光纳米探针并扩展其生物学应用具有重要意义。带正电的coooh nfs与带负电的双链寡核苷酸之间具有较强的静电相互作用，而对单短链dna静电相互较弱，相应的，随着coooh nfs被强烈吸附，吸光率也逐渐增大。因此，可以利用单短链、长双链和coooh nfs之间静电相互作用的差异，将coooh nfs荧光猝灭能力和静电吸附能力相结合可开发“turn-on”型荧光传感器实现对目标物的检测。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有铅离子检测技术存在的检测仪器操作复杂，检测成本高，实际样品前处理繁琐等问题，利用6-羧基荧光素(fam)标记的gr5 dnazyme作为兼具双功能的识别元件与荧光探针，基于coooh nfs与gr5 dnazyme之间的静电相互作用，以及对fam的荧光猝灭作用，开发了一种操作简单的荧光传感器检测铅离子，实现了对铅离子的可靠、灵敏检测，为荧光传感器在重金属检测中的应用提供新方法，同时本方法前处理简单，为铅离子在实际样品中的快速检测提供一种新思路。

2、本发明的目的可通过如下技术方案实现：

3、一种基于羟基氧化钴和gr5 dnazyme检测铅离子的荧光传感器，其步骤如下：

4、a、羟基氧化钴纳米片：简称coooh nfs的制备：

5、羟基氧化钴纳米片的制备：将300μl 1m naoh加入1000μl 10mm cocl2溶液中，超声作用10min，加入50μl 0.9m naclo溶液，混匀并超声作用10min，加入650μl去离子水，以10000rpm离心10min，收集沉淀物，再用去离子水洗涤三次得到cooohnfs。最后，将其稀释至50μg/ml备用。

6、b、铅离子特异性脱氧核酶：简称gr5 dnazyme的制备：

7、gr5 dnazyme的制备：将50μl 0.25μm底物链s与50μl 0.25μm酶链e混匀，在95℃恒温金属浴中加热5min，然后缓慢降至25℃，避光反应30min。

8、c、铅离子的荧光分析：

9、在gr5 dnazyme中加入50μl不同浓度的铅离子标准溶液，在25℃避光反应30min，催化gr5 dnazyme在底物链ra处断裂，最后加入50μl 50μg/ml cooohnfs，在25℃避光反应10min，在室温下使用荧光分光光度计测定溶液的荧光发射光谱。

10、本发明机理如下：

11、本发明，标记fam于铅离子特异性脱氧核酶gr5 dnazyme的底物链5’端，制备的fam-gr5 dnazyme兼具识别元件与荧光探针双重功能，同时制备二维过渡金属纳米材料coooh nfs作为吸附剂与荧光猝灭剂。在没有铅离子的情况下，gr5 dnazyme形成两端双螺旋结构，由于双链表面暴露出负电荷，通过静电作用吸附到coooh nfs上，通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,fret)，coooh nfs能够猝灭fam的荧光。当铅离子存在时，催化gr5 dnazyme的底物链在指定位点ra处断裂，由于标记fam的断裂部分底物链只有4个碱基，从coooh nfs表面释放，导致荧光强度恢复。利用金纳米棒对短单链和双链核酸之间的静电吸附差异，以及对fam荧光猝灭的作用，建立了一种快速、灵敏检测铅离子的荧光传感器，本方法能够简单快捷、灵敏高效检测水中铅含量，且对低浓度铅离子具有更为优异的信号响应。

12、本发明提供的这种基于羟基氧化钴纳米片和gr5-dnazyme之间的静电相互作用与荧光共振能量转移的荧光检测方法，为功能核酸gr5-dnazyme和羟基氧化钴纳米片猝灭材料在铅离子快速检测中的实际应用提供技术手段，该策略可通过替换相应的脱氧核酶推广到其他目标物检测中，为有效控制食品中重金属的危害和污染提供技术支撑，在环境检测、食品分析等领域展现出巨大的应用前景。

技术特征：

1.一种基于羟基氧化钴纳米片和gr5 dnazyme快速检测铅离子的荧光传感器，其特征在于，其步骤如下：

2.如权利要求1所述的一种基于羟基氧化钴纳米片和gr5 dnazyme快速检测铅离子的荧光传感器，其特征在于，步骤a所述的300μl 1m naoh，1000μl 10mm cocl2，50μl 0.9mnaclo。

3.如权利要求1所述的一种基于羟基氧化钴纳米片和gr5 dnazyme快速检测铅离子的荧光传感器，其特征在于，步骤b所述的50μl 0.25μm底物链，50μl 0.25μm酶链。

4.如权利要求1所述的一种基于羟基氧化钴纳米片和gr5 dnazyme快速检测铅离子的荧光传感器，其特征在于，步骤b所述的gr5 dnazyme酶链序列为aatcatctctgaagtagcgccgccgtagtg，底物链序列为cactaggaagagatgatt。

5.如权利要求1所述的一种基于羟基氧化钴纳米片和gr5 dnazyme快速检测铅离子的荧光传感器，其特征在于，步骤c所述的测定荧光发射光谱时，参数设置为激发波长为490nm，扫描范围为500-600nm，激发狭缝为2nm，发射狭缝为2nm，设置响应时间为0.1s。

6.如权利要求1所述的一种基于羟基氧化钴纳米片和gr5 dnazyme快速检测铅离子的荧光传感器，其特征在于，步骤c所述的该荧光法最佳发射波长为520nm。

技术总结
本发明公开了一种基于羟基氧化钴纳米片和GR5DNAzyme快速检测铅离子的荧光传感器。本发明，标记FAM于GR5DNAzyme底物链，使其兼具识别元件与荧光探针双重功能。具有双螺旋结构的DNAzyme，表面暴露负电荷，吸附到带正电的CoOOHNFs表面，通过荧光共振能量转移，FAM的荧光被猝灭。当存在铅离子时，催化GR5DNAzyme的底物链，在rA处断裂为4nt碱基且标记FAM的序列，从CoOOH NFs解吸，荧光恢复。利用FAM‑GR5DNAzyme的双功能特性，以及CoOOH NFs对单双链静电吸附的差异与对FAM的荧光猝灭作用，本方法能够灵敏特异、简单快速的检测水样品中铅离子(线性范围0.2～25nM，检出限0.2nM)。本发明可替换相应的特异性脱氧核酶推广到其他重金属检测中，对食品中有害物质的快速检测具有潜在的应用价值。

技术研发人员：张晓光,宋慧妍,孙春燕,王君旸
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25