一种测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法

本发明涉及定量检测，尤其涉及一种测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法。

背景技术：

1、短链脂肪酸（shortchain fatty acids，scfa）是大肠中的肠道微生物群通过发酵食物中未吸收的成分产生，最丰富的scfa是乙酸、丙酸和丁酸，占结肠中scfa总量的90%-95%。它们主要来自于碳水化物，但一些氨基酸（特别是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）可以转化为支链scfa，例如异丁酸、异戊酸，对scfa的总量略有贡献。肠道中scfa的存在有一些优点，例如它们降低管腔ph值，有利于营养吸收并减少一些病原微生物的形成。

2、目前，有多种分析方法可以检测scfa，例如气相色谱（gc）、高效液相色谱（hplc）、毛细管电泳（ce）或核磁共振（nmr）等。其中，gc是最常用的技术，因为scfa的挥发性以及该技术和样品预处理的高灵敏度，良好的分辨率和相对较低的成本。gc可以与火焰离子化检测器（fid）偶联，此外，gc与质谱仪（ms）的耦合可以进一步提高方法的选择性和灵敏度。在scfa分析之前，样品预处理通常包括提取，在某些情况下还包括纯化和/或衍生化。例如，cn110045040a、cn116124905a等公开了测定短链脂肪酸含量的方法，但上述方法的准确性和高效性都有待提高。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法。

2、本发明提供一种测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，包括样品前处理的步骤，所述样品前处理步骤中，先采用丙酮作为提取溶剂提取肠道内容物或粪便样品中的短链脂肪酸，再通过固相萃取柱分离纯化提取得到的短链脂肪酸丙酮提取液，所述固相萃取柱的填料使用c8和sax。

3、其中，c8是硅胶键合辛烷基，sax是键合有季胺基官能团的强阴离子交换填料。

4、优选地，c8和sax的质量比为1:3~3:1，分段填充，c8填料在上，sax填料在下。也就是说，提取液经过固相萃取柱时，先经过c8填料，后经过sax填料。其中，c8和sax的质量比可以为1:3~3:1范围内的任一数值，例如1:3、1.5:2.5、2:2、2.5:1.5或3:1等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

5、本发明采用丙酮进行提取短链脂肪酸，提取后再通过特定填料的固相萃取柱纯化，可以得到纯度高、杂质少且分离度好的样品溶液，以便后续气相色谱检测，最终快速获得准确的短链脂肪酸含量。

6、在本发明的一些实施例中，所述肠道内容物或粪便样品的用量为50-150mg，例如50mg、80mg或100mg等。所述丙酮的用量为1ml。

7、在本发明的一些实施例中，所述提取包括：将50-150mg肠道内容物或粪便样品加入离心管中，加入300-400μl丙酮后进行研磨，再加入600-700μl丙酮将样品涡旋均匀，涡旋后进行高速离心，4℃下10000g- 12000 g 离心10-15min。

8、优选的，肠道内容物或粪便样品在处理前保存在-80℃，避免短链脂肪酸的挥发和损失。

9、优选的，每个样品独立使用一根电动研磨棒，用过的研磨棒浸泡在75%的乙醇中，试验结束后洗干净并用高压灭菌锅灭菌，干燥后保存备用。

10、在本发明的一些实施例中，所述分离纯化包括：先用丙酮活化固相萃取柱，并吹干残留丙酮，再将短链脂肪酸丙酮提取液加入固相萃取柱中，流出的即为短链脂肪酸样品溶液。

11、在本发明的一些实施例中，所述方法还包括：将所述样品前处理得到的样品溶液采用气相色谱法测定短链脂肪酸含量。

12、在本发明的一些实施例中，所述气相色谱法采用升温程序进行测定，所述升温程序为：色谱柱初始温度50℃，保持1 min，以15℃/min升温至120℃，保持0min，再以6℃/min升温至200℃，保持0min，共运行19 min；后升温至235℃运行3 min。

13、在本发明的一些实施例中，所述气相色谱法的检测条件为：色谱柱为安捷伦db-ffap（30m，0.25mm×0.25μm），n2作为载气，流速1 ml/min，压力11.258 psi，进样口温度为280℃，fid检测器温度250℃，h2流量40 ml/min，空气流量300 ml/min，n2尾吹流量25 ml/min；进样量1 μl，清洗溶剂a为水，清洗溶剂b为丙酮。

14、优选的，气相色谱仪进样口衬管为超高惰性、分流、降压低、带玻璃毛（安捷伦，5190-3165），进50个样品左右需要检查衬管是否变脏，容易引起杂峰，此时可用尖头镊子轻轻去除脏的玻璃棉，衬管还能继续使用。

15、优选的，进50个样品左右，气相色谱仪进样口隔垫需要及时更换新的，避免仪器漏气报错和污染衬管。

16、优选的，进50个样品左右需要设置高温清洗色谱柱的方法，进2针丙酮空白，避免杂峰残留干扰结果。高温清洗色谱方法为：安捷伦7820a气相色谱仪进样口加热器为280℃，压力11.258 psi，分流比10：1；色谱柱为安捷伦db-ffap（30m，0.25mm×0.25μm），n2作为载气，流速1 ml/min，压力11.258 psi，柱温箱50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温至150 ℃，保持10min，再以5 ℃/min升温至240 ℃，保持10min，共运行59 min；fid检测器，加热250℃，h2流量40 ml/min，空气流量300 ml/min，尾吹流量（n2）25 ml/min；gc自动进样器，进样量1 μl，清洗溶剂a为水，清洗溶剂b为丙酮，进样前ab各洗两次最大体积，样品清洗2次4 μl，样品抽吸3次。

17、本发明所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸和己酸。

18、本发明还提供所述测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法在制备短链脂肪酸含量检测试剂盒中的应用。

19、本发明提供了一种测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，通过采用丙酮进行提取短链脂肪酸，提取后再通过特定填料的固相萃取柱纯化，增加了样品在气相色谱仪进样口的气化时间，该方法简单、快捷、高效，能够准确测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量。

技术特征：

1.一种测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，包括样品前处理的步骤，所述样品前处理步骤中，先采用丙酮作为提取溶剂提取肠道内容物或粪便样品中的短链脂肪酸，再通过固相萃取柱分离纯化提取得到的短链脂肪酸丙酮提取液，所述固相萃取柱的填料使用c8和sax。

2.根据权利要求1所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，c8和sax的质量比为1:3~3:1，分段填充，c8填料在上，sax填料在下。

3.根据权利要求1所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述肠道内容物或粪便样品的用量为50-150mg，所述丙酮的用量为1ml。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述提取包括：

5.根据权利要求1-3任一项所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述分离纯化包括：

6.根据权利要求1-3任一项所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述样品前处理得到的样品溶液采用气相色谱法测定短链脂肪酸含量。

7.根据权利要求6所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述气相色谱法采用升温程序进行测定，所述升温程序为：色谱柱初始温度50℃，保持1 min，以15℃/min升温至120℃，保持0min，再以6℃/min升温至200℃，保持0min，共运行19 min；后升温至235℃运行3 min。

8.根据权利要求6所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述气相色谱法的检测条件为：色谱柱为安捷伦db-ffap，n2作为载气，流速1 ml/min，压力11.258 psi，进样口温度为280℃，fid检测器温度250℃，h2流量40 ml/min，空气流量300 ml/min，n2尾吹流量25 ml/min；进样量1 μl，清洗溶剂a为水，清洗溶剂b为丙酮。

9.根据权利要求1-3任一项所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸和己酸。

10.权利要求1-9任一所述的测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法在制备短链脂肪酸含量检测试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及定量检测技术领域，提供一种测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含量的方法，所述方法包括样品前处理的步骤，该步骤中，先采用丙酮作为提取溶剂提取肠道内容物或粪便样品中的短链脂肪酸，再通过固相萃取柱分离纯化提取得到的短链脂肪酸丙酮提取液，所述固相萃取柱的填料使用C8和SAX。本发明的方法具有回收率高、检测限低和耗时短的特点。

技术研发人员：王凯,郑星,熊霞,吴黎明,彭文君
受保护的技术使用者：中国农业科学院蜜蜂研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25