一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法

本发明涉及代谢组学技术检测方法，更具体的说是涉及一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法。

背景技术：

1、轻木（学名：ochroma lagopus），又称百色木、巴沙木，木棉科轻木属常绿乔木。轻木的干重密度只有0.12 g/cm3，是世界上最轻的木材，同时也具有生长周期短的特点，五年即可成材，且木材特性优良，是经济效益很高的速生用材树种。轻木叶似梧桐，叶片面积大，叶片光合活性高，从能量和物质转化角度来看，木材是树木通过叶片光合作用同化二氧化碳将光能转化成化学能，并经过复杂和高效的生物合成与沉积过程而产生的。木材细胞壁生物合成中的蔗糖主要源自于韧皮部输导的叶片光合产物。因此，解析生长发育时期叶片中植物激素及代谢物的变化对挖掘轻木源叶代谢物资源与轻木木材形成具有重要意义。

2、代谢组是指参与生物体新陈代谢、维持生物体正常生长发育功能的小分子化合物的集合，主要是指相对分子量小于1000的内源性小分子。代谢组分析技术包括代谢物的分离、检测及鉴定。新型液相色谱技术——超高效液相色谱的应用能显著改善色谱分离度，与质谱联用时基质干扰减小，在提高检测灵敏度的同时大大缩短了分析周期。因此，超高效液相色谱-质谱替代传统液相色谱-质谱适用于微量复杂混合物的分离和高通量代谢组学分析，在植物代谢组学研究中得到了快速而广泛的应用。通过数据处理和分析准确找出样本间差异性代谢物，有助于解析生物样本中代谢物的重要信息。目前，尚未见基于非靶向代谢组学探究轻木叶片生长过程中植物激素的研究报道。

3、因此，提供一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，通过非靶向代谢组学方法筛选鉴定轻木生长发育过程中源叶中的植物激素，探究速生树种轻木叶片植物激素的变化规律。

2、本发明以轻木叶片为研究对象，通过非靶向代谢组学方法分析探究生长发育时期轻木叶片植物激素的变化，旨在为轻木源叶代谢物资源挖掘与利用奠定理论基础，助力轻木未来的产业发展。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，包括以下步骤：

5、（1）样品制备与提取：分别称取轻木幼苗时期、一年生、三年生、五年生的叶片样品，制备上清液；

6、（2）原始数据获得：利用超高效液相色谱质谱检测（uplc-q-exactive-ms）技术对轻木叶片进行非靶向成分测定，得到代谢组原始数据；

7、（3）原始数据处理：利用proteowizard的msconvert软件将质谱下机原始数据转换成可读数据格式—mzxml；利用xcms软件进行峰提取并进行质控，对提取到的物质利用camera进行加和离子注释；利用metax软件进行代谢物鉴定；

8、（4）数据分析：对四个时期轻木叶片的代谢物鉴定结果进行多元统计分析，筛选特征差异代谢物；

9、（5）挖掘特征物质：利用pls-da模型p value < 0.05且vip > 1的方法筛选鉴定到轻木叶片三种植物激素，使用graphpad prism软件绘制不同生长年龄轻木叶片三种激素相对含量变化。

10、进一步，步骤（1）所述样品制备与提取的具体步骤如下：分别称取轻木幼苗时期、一年生、三年生、五年生的叶片样品100 mg，样品中分别加入120 µl 50%甲醇，涡旋30 s，45hz下均化4 min，之后冰水浴中超声处理5 min，匀浆和超声循环重复3次，-20℃下静置1小时，低温离心弃沉淀；低温离心条件为12000 rpm和4 ℃下离心15 min，上清液进行超高效液相色谱质谱仪检测。

11、进一步，步骤（3）所述对代谢物进行鉴定，首先根据精确分子量进行确认，比对代谢物离子二级碎裂的信息与in-house标准品数据库进行匹配获得，候选鉴定物质利用kegg数据库进行代谢物注释，解释代谢物的物理化学性质、生物功能。

12、进一步地，步骤（4）中所述多元统计分析包括主成分分析（pca）、偏最小二乘判别分析（pls-da）。

13、进一步，步骤（5）所述三种植物激素为水杨酸、脱落酸、茉莉酸。

14、进一步，所述的方法在筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素中的应用。

15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，相比于一级代谢物离子信息的分子量比对，本发明利用代谢物离子碎裂信息的比对获得二级代谢物鉴定结果，其准确性高，对二级代谢物进行多元统计分析，根据变量重要性投影指标（vip）筛选到差异性标志物，挖掘到三种植物激素的变化规律，方法简单快捷，结果准确可靠，为轻木叶片植物激素研究提供了依据。

技术特征：

1.一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，其特征在于，步骤（1）所述样品制备与提取的具体步骤如下：分别称取轻木幼苗时期、一年生、三年生、五年生的叶片样品100 mg，样品中分别加入120 µl 50%甲醇，涡旋30s，45 hz下均化4 min，之后冰水浴中超声处理5 min，匀浆和超声循环重复3次，-20℃下静置1小时，低温离心弃沉淀；低温离心条件为12000 rpm和4 ℃下离心15 min，上清液进行超高效液相色谱质谱仪检测。

3.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，其特征在于，步骤（3）所述对代谢物进行鉴定，首先根据精确分子量进行确认，比对代谢物离子二级碎裂的信息与in-house标准品数据库进行匹配获得，候选鉴定物质利用kegg数据库进行代谢物注释，解释代谢物的物理化学性质、生物功能。

4.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，其特征在于，步骤（4）利用pls-da模型p value < 0.05且vip > 1的方法筛选鉴定到三种植物激素。

5.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，其特征在于，步骤（4）使用graphpad prism软件绘制不同年龄轻木叶片三种激素相对含量变化。

6.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，其特征在于，步骤（4）所述三种植物激素为水杨酸、脱落酸、茉莉酸。

7.权利要求1-6任一项所述的方法在筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，属于代谢组学技术检测方法技术领域。本发明公开的一种基于非靶向代谢组学筛选鉴定轻木叶片中三种植物激素的方法，包括以下步骤：样品制备与提取、数据挖掘与处理、植物激素的筛选鉴定与定量分析。通过UPLC‑Q‑Exactive‑MS的技术实现了轻木叶片中植物激素的检测，通过多组样本的多元统计分析，实现了特征代谢物的挖掘及定量分析；本发明方法准确度更高、检测结果可靠、重复性好，为轻木叶片激素检测提供了相关依据。

技术研发人员：赵媛媛,李晓旭,林金星,李洋,宋晓霞,王宁宇,李瑞丽,王晨璨
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19