化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法与流程

本申请涉及免疫检测，特别是涉及一种化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术：

1、免疫分析技术经历了酶免分析技术(eia)、放射免疫分析技术(ria)、荧光免疫分析技术(fia)、时间分辨荧光免疫分析技术(trfia)和化学发光免疫分析技术(clia)几个阶段。其中，clia作为先进的免疫分析技术，不仅自动化程度高、检测速度快，而且还具有较高的灵敏度和分析特异性，在临床检测中发挥着越来越重要的作用。

2、生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，bas）是利用1分子亲和素可以结合4分子生物素的特性而建立的一种放大标记技术。其中，链霉亲和素是与亲和素有类似生物学特性的一种蛋白质，由于其与固相材料的非特异性结合远少于亲和素，因此在实际应用中多采用生物素-链霉亲和素系统。基于bas的化学发光技术结合了抗原抗体反应的特异度、化学发光反应的灵敏度以及bas的级联放大作用，具有较高的灵敏度和稳定性，且检测线性范围更宽，被广泛用于肿瘤标志物、感染性标志物、心肌损伤标志物、各种传染病、激素、药物和核酸的检测。

3、传统技术中，主要有两种利用bas标记的放大模式。第一种模式的组分有含链酶亲和素的磁珠、生物素标记的捕获抗体、化学发光物质标记的检测抗体；第二种模式的组分有磁珠包被的捕获抗体、生物素标记的检测抗体、链酶亲和素标记的化学发光物质。然而，上述两种放大模式极易使本底升高，容易形成非特异性吸附。因此，亟需一种能够降低检测本底、提高检测灵敏度的相关技术和产品。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供一种能够降低检测本底、提高检测灵敏度的化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。

2、本申请解决上述技术问题的技术方案如下：

3、本申请提供了一种化学发光免疫检测试剂盒，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；所述捕获抗体和目标蛋白的结合位点和所述检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。

4、在其中一些实施例中，所述带有生物素的多肽满足以下（a）~（c）中的至少一个条件：（a）所述多肽的结构通式为：biotin-aa1-lys-aa2-lys-aa3-lys-aa4-lys-aa5-lys-aa6-lys-aa7-lys-aa8-lys-aa9-lys-biotin；

5、（b）所述多肽序列中aa1~aa9分别由1~3个氨基酸组成；

6、（c）所述多肽序列中aa1~aa9各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸中的至少一个。

7、在其中一些实施例中，所述多肽复合物中的多肽包括氨基酸序列如seq id no:1~3所示的多肽中的至少一种。

8、在其中一些实施例中，所述发光标记物为吖啶酯；

9、可选地，所述发光标记物包括nsp-dmae-nhs、nsp-sa-nhs和nsp-dmae-heg-nhs中的一种。

10、本申请还提供一种上述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

11、获取偶联了亲和素的检测抗体，在亲和素偶联检测抗体后再标记发光物；

12、在带有生物素的多肽上标记发光物；

13、将捕获抗体连接至固相载体，获得由捕获抗体包被的固相载体。

14、在其中一些实施例中，获取偶联了亲和素的检测抗体的步骤包括：

15、将检测抗体加入第一点击化学试剂中进行活化，得到活化后的检测抗体；

16、将亲和素加入第二点击化学试剂中进行活化，得到活化后的亲和素；

17、将所述活化后的检测抗体和所述活化后的亲和素进行交联反应，得到偶联上亲和素的检测抗体；

18、所述第一点击化学试剂和所述第二点击化学试剂的种类不同。

19、在其中一些实施例中，所述第一点击化学试剂和所述第二点击化学试剂分别独立地选自四嗪-pegn-nhs和tco-pegm-nhs中至少一种，其中，n为1~20，m为1~20。

20、在其中一些实施例中，所述检测抗体与所述第一点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述亲和素与所述第二点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述活化后的检测抗体与所述活化后的亲和素的反应摩尔比为1：（1~5）。

21、在其中一些实施例中，所述反应的温度为15℃~37℃。

22、本申请还提供了一种化学发光免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

23、取待测样本，采用上述的试剂盒进行免疫反应，通过对反应产物进行发光值检测，分析检测结果。

24、与传统技术相比较，本申请的化学发光免疫检测试剂盒具有如下有益效果：

25、上述化学发光免疫检测试剂盒，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；捕获抗体和目标蛋白的结合位点和检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。化学发光免疫检测过程中，上述试剂盒检测抗体偶联亲和素后再标记发光物所形成的第一标记物与带有生物素的多肽标记发光物所形成的第二标记物反应形成检测抗体复合物，利用检测抗体与亲和素偶联物再标记发光物的一重信号放大、亲和素与生物素特异性结合的一重信号放大、多肽标记发光物的一重信号放大组合，即聚体复合物、亲和素-生物素体系和多肽的多重放大的模式组合一起可以极大地提高发光信号，从而可以提高检测体系的灵敏度，有效地解决化学发光免疫检测体系中的灵敏度不够的问题和减少非特异性吸附。

26、本申请另一实施方式公开的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，无需严格的反应条件控制，即可实现检测抗体和标记物的连接反应，使抗体复合物的制作工艺简单易控，有利于免疫检测产品的推广应用。

技术特征：

1.一种化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；所述捕获抗体和目标蛋白的结合位点和所述检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述带有生物素的多肽满足以下（a）~（c）中的至少一个条件：

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述带有生物素的多肽包括氨基酸序列如seq id no:1~3所示的多肽中的一种。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光物为吖啶酯；

5.一种如权利要求1~4任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，获取偶联了亲和素的检测抗体的步骤包括：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一点击化学试剂和所述第二点击化学试剂分别独立地选自四嗪-pegn-nhs和tco-pegm-nhs中的一种，其中，n为1~20，m为1~20。

8.根据权利要求6~7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述检测抗体与所述第一点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述亲和素与所述第二点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述活化后的检测抗体与所述活化后的亲和素的反应摩尔比为1：（1~5）。

9.根据权利要求6~7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为15℃~37℃。

10.一种化学发光免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本申请涉及一种化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。该检测试剂盒包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；所述捕获抗体和目标蛋白的结合位点和所述检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。该试剂盒利用检测抗体与亲和素偶联物再标记发光物的一重信号放大、亲和素与生物素特异性结合的一重信号放大、多肽标记发光物的一重信号放大组合，即聚体复合物、亲和素‑生物素体系和多肽的多重放大的模式组合一起可以极大地提高发光信号，从而可以提高检测体系的灵敏度，减少非特异性吸附。

技术研发人员：祝亮,谭松暖,卢昆成,何凡
受保护的技术使用者：深圳市卓润生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17