一种红树植物根表微结构上多环芳烃空间分布的可视化方法

本发明涉及持久性有机污染物在植物组织微区微界面环境行为领域，具体涉及一种通过自建激光共聚焦荧光显微光谱分析(lcmfsa)系统中针孔孔径调节减弱秋茄根表本底荧光干扰，同时基于空间分辨率(311nm)和显微能力(0.096mm2)的显著提升可视化根表皮细胞壁及细胞表面上多环芳烃分布位点及形态。

背景技术：

1、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,pahs)是一类普遍存在于土壤/沉积物、大气和水体环境中具有生物蓄积性、半挥发性、高毒性和长距离传输等特性的持久性有机污染物(persistent organic pollutants,pops)，pahs污染问题仍是全球性的。红树林生态系统提供了固碳、沿海保护和物种栖息地等生态服务功能，然而过去60年全球约30％的红树林已消失，红树林的生态功能逐渐退化。红树林沉积物是pahs的汇，沉积物中pahs污染导致红树植物根生物量降低、叶片凋落、叶片co2交换量减少50％。苯并[a]芘在红树根组织中普遍检出，且对植物生长具有明显的抑制作用。因此，探究b[a]p在红树植物根中环境行为对理解pahs污染如何影响红树林生态功能具有重要意义。

2、现有研究通过共聚焦荧光显微技术已成功追踪pahs在小麦和玉米等作物根组织微区的吸收、迁移和代谢等行为。但区别于作物，红树植物无法通过荧光发射波段差异有效区分其根表强本底荧光与目标pahs的荧光信号，由于红树根表本底荧光干扰，现有研究仅可判定秋茄根表微区上观察到的大块状荧光亮点是b[a]p的荧光信号，由此相关研究仅能证实b[a]p在秋茄根表微区分布不均匀呈现团簇状。然而最新的研究表明红树叶表微结构是影响b[a]p分布和积累的关键控制因素。因此，亟需解决红树根表强本底荧光干扰的问题，同时提升空间分辨率和微区显微能力，进一步可视化秋茄根表微结构上b[a]p的分布位点和形态，这将有助于从微观角度深入理解典型pahs在红树植物根组织中环境行为及其效应。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种红树植物根表微结构上b[a]p分布位点及形态的可视化方法，以解决红树植物根表本底荧光干扰问题。

2、为实现上述发明目的，本发明通过调节自建lcmfsa系统中针孔孔径，减弱红树植物根表本底荧光干扰，同时依靠自建lcmfsa系统高空间分辨率(311nm)和显微能力(0.096mm2)，可视化红树植物根表微结构上b[a]p分布位点及形态。

3、本发明采用以下技术方案：

4、一种红树植物根表微结构上多环芳烃空间分布的可视化方法，包括以下步骤：

5、(1)调节针孔孔径减弱红树植物根表本底荧光干扰

6、利用lcmfsa系统对空白红树植物根表进行荧光显微成像，调节针孔孔径，空白红树植物根表微区观察不到明显的本底荧光信号情况下，记录针孔孔径数值；同时利用lcmfsa系统中光谱组件扫描不同针孔孔径下本底荧光的发射荧光光谱；

7、(2)可视化根表微结构上多环芳烃空间分布

8、样品替换为暴露多环芳烃的红树植物侧根表皮，在前期记录的针孔孔径下，利用lcmfsa系统的光谱扫描组件，获取不同针孔孔径下红树植物根表微区分布多环芳烃的发射荧光光谱，通过最大发射峰强度计算多环芳烃的信噪比，记录最大信噪比下针孔孔径数值，在该针孔孔径下观察根表微结构上多环芳烃分布位点及形态。

9、本发明步骤(1)所述调节针孔孔径减弱红树植物根表本底荧光干扰方法具体步骤如下：选择沙培4-8个月具有相似鲜重和长度的红树植物幼苗，分离新鲜侧根并使用milli-q洗净表面沙子等杂质，剥离距根尖约0.5-1.5cm处根表皮并固定为(3-5)mm×(3-5)mm大小，使用载玻片和盖玻片将其固定并置于lcmfsa系统载物台上，控制系统将入射光切换为稳态激光，选用405/488nm激发滤光片和405nm稳态激光，发射波长收集波段为410-500nm，激光强度设置为5％，选择数值孔径为1.35的40x油镜对样品进行成像，图像采集分辨率为1024×1024pixels，像素尺寸为0.311μm/pixel，图像采集速度为2.0μm/pixel，针孔孔径的设置分别为800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm和118μm条件下进行空白红树植物根表微区荧光显微成像，观察不到明显的本底荧光情况下，记录针孔孔径的数值。同时利用lcmfsa系统中光谱组件获取不同针孔孔径下同一微区的荧光信息，激光强度调整为10％，控制系统将发射荧光信号经出射光纤引入荧光光谱仪检测器，荧光光谱仪收集同一微区中本底荧光在410-500nm波段的发射荧光光谱。

10、本发明步骤(1)中所述记录下的lcmfsa系统中针孔孔径为400μm、300μm、200μm和118μm。

11、本发明步骤(2)中所述记录下的lcmfsa系统中针孔孔径为400μm。

12、本发明提供了减弱红树植物根表本底荧光干扰，可视化红树根表微结构上pahs空间分布的方法。所述红树植物和pahs种类均有很多种，红树植物例如包括银叶树、桐花树、白骨壤、秋茄、海桑和木榄等。本发明红树植物以秋茄为例，但不仅限于秋茄，同样地，pahs以苯并[a]芘为例，但不仅限于苯并[a]芘。

13、与现有技术相比，本发明的有效效益在于：

14、(1)本发明通过自建lcmfsa系统中针孔孔径的调节，有效过滤掉红树植物根表本底荧光，使得红树植物根表本底荧光不能被直接观察到，解决了红树植物根表本底荧光与多环芳烃发射荧光严重重叠，难以准确识别根表微区多环芳烃荧光信号的问题；同时依靠自建lcmfsa系统高的空间分辨率(311nm)和显微能力(0.096mm2)超越已有研究进一步追踪到多环芳烃主要赋存于红树植物根表皮细胞壁上，且在表皮细胞壁和细胞表面形成团簇。

15、(2)本发明涉及到多环芳烃在红树植物根表微结构上分布位点及形态，未见报道。

16、(3)本发明可从微观角度深入理解典型pahs在红树植物组织中环境行为及其效应。

17、(4)本发明相关操作简单。

技术特征：

1.一种红树植物根表微结构上多环芳烃空间分布的可视化方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的可视化方法，其特征在于，步骤(1)调节针孔孔径减弱红树植物根表本底荧光干扰的方法包括：选择沙培4-8个月具有相似鲜重和长度的红树植物幼苗，分离新鲜侧根并使用超纯水洗净表面杂质，剥离距根尖0.5-1.5cm处根表皮并固定为(3-5)mm×(3-5)mm大小，使用载玻片和盖玻片将其固定并置于lcmfsa系统载物台上，控制系统将入射光切换为稳态激光，选用405/488nm激发滤光片和405nm稳态激光，发射波长收集波段为410-500nm，激光强度设置为5％，选择数值孔径为1.35的40x油镜对样品进行成像，图像采集分辨率为1024×1024pixels，像素尺寸为0.311μm/pixel，图像采集速度为2.0μm/pixel，针孔孔径的设置分别为800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm和118μm条件下对空白红树植物根表皮进行荧光显微成像，观察不到明显的本底荧光情况下，记录针孔孔径的数值；同时利用lcmfsa系统中光谱组件获取不同针孔孔径下同一微区的荧光信息，激光强度调整为10％，控制系统将发射荧光信号经出射光纤引入荧光光谱仪检测器，荧光光谱仪收集同一微区中本底荧光在410-500nm波段的发射荧光光谱。

3.根据权利要求1所述的可视化方法，其特征在于，步骤(1)中，记录下的lcmfsa系统中针孔孔径为400μm、300μm、200μm和118μm。

4.根据权利要求1所述的可视化方法，其特征在于，步骤(2)中所述记录下的lcmfsa系统中针孔孔径为400μm。

5.根据权利要求1～4任一项所述的可视化方法，其特征在于，所述的红树植物为秋茄。

6.根据权利要求1～4任一项所述的可视化方法，其特征在于，所述的多环芳烃为苯并[a]芘。

7.根据权利要求6所述的可视化方法，其特征在于，可减弱秋茄根表本底荧光干扰，在311nm空间分辨率和0.096mm2微观尺度下定位根表微结构上苯并[a]芘空间分布。

技术总结
本发明公开一种红树植物根表微结构上多环芳烃空间分布的可视化方法。本发明通过调节自建激光共聚焦荧光显微光谱分析(LCMFSA)系统中针孔孔径减弱秋茄根表本底荧光干扰，同时基于空间分辨率(311nm)和显微能力(0.096mm2)的显著提升，继而观察秋茄根表微结构上苯并[a]芘空间分布。本发明方法可用于从微观角度深入观察典型PAHs在红树植物根组织中环境行为及其效应。

技术研发人员：雷冰漫,万永杰,魏超贤,郭帅,吴芳,朱亚先,张勇
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31