一种四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法与流程

本发明涉及一种四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，属于产品质量检测领域。

背景技术：

1、四氢甲基嘧啶羧酸，化学名称为1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，又叫依克多因，一种存在于微生物中的氨基酸衍生物，属于环状氨基酸。四氢甲基嘧啶羧酸对皮肤有很好的修复保护作用，提升皮肤细胞的免疫防护能力，增加细胞修复能力，使皮肤能有效对抗微生物及过敏原的入侵，是高档化妆品采用的生物工程制剂。四氢甲基嘧啶羧酸在制药、食品、化妆品、生物制剂、酶制剂、农业和化学合成药物及有机电子材料等领域具有很大的应用价值和广泛的应用前景。

2、目前对四氢甲基嘧啶羧酸的测定方法主要为高效液相色谱法，选用c18色谱柱。因四氢甲基嘧啶羧酸具有非常强的极性，在疏水性的c18柱上保留时间短，峰面积极不稳定，分离度达不到要求，无法满足定量检测要求。尤其是在长时间检测大量样品的过程中，直接影响测定结果的准确性和重现性，而且容易影响分析柱使用寿命。因此，需要寻找一种高效、准确的检测四氢甲基嘧啶羧酸含量的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，该方法检测四氢甲基嘧啶羧酸的含量稳定，测定结果准确，重现性好，回收率高，精密度高。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

3、一种四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，包括以下步骤：

4、（1）准确称取四氢甲基嘧啶羧酸标准品，用水溶解，过滤，配制成浓度为10g/l的溶液作为母液，再加水稀释，配制成标准品溶液；

5、（2）称取四氢甲基嘧啶羧酸样品，用水溶解，经过滤后定容至100ml，配制成样品溶液；

6、（3）将标准品溶液和样品溶液用高效液相色谱仪进行检测，记录标准品溶液和样品溶液的色谱图；

7、（4）根据标准品溶液的浓度与所得峰面积计算出四氢甲基嘧啶羧酸浓度与峰面积的标准回归曲线y＝a＋bx，其中，y为四氢甲基嘧啶羧酸浓度（g/l），x为四氢甲基嘧啶羧酸峰面积；

8、（5）根据样品溶液四氢甲基嘧啶羧酸的峰面积与标准回归曲线y＝a＋bx计算样品溶液中四氢甲基嘧啶羧酸的浓度；

9、（6）按下方公式计算样品中四氢甲基嘧啶羧酸含量：

10、

11、x：样品中四氢甲基嘧啶羧酸含量，单位：%；

12、c：线性方程中得样品溶液中四氢甲基嘧啶羧酸的浓度，单位：g/l；

13、10-3：毫升与升之间的换算系数；

14、x0：样品的干燥失重，单位：%；

15、m：称取样品的质量，单位：g；

16、100：稀释体积，单位：ml。

17、注：所测样品都需用烘箱干燥，测得干燥失重（水分）。

18、进一步的，所述高效液相色谱仪选用的色谱柱为氨基柱zorbax original 70anh2。

19、由于四氢甲基嘧啶羧酸具有非常强的极性，使用疏水的c18柱测定时，出峰快，c18柱与四氢甲基嘧啶羧酸性质相近，无法满足定量检出要求，而且c18柱不能多次重复使用。采用氨基柱测定四氢甲基嘧啶羧酸，将四氢甲基嘧啶羧酸在最佳色谱条件下进行分析，使用外标法进行定量分析，以标准溶液浓度和峰面积绘制曲线，得到标准回归方程，回归方程线性好，且使用氨基柱测定时，分离效果较好，重复性好，稳定性好。

20、进一步的，步骤（1）中，所述四氢甲基嘧啶羧酸标准品的纯度≥99%。

21、进一步的，步骤（1）中，所述标准品溶液的浓度为0.01-1.0g/l。

22、进一步的，步骤（1）中，所述标准品溶液的浓度为0.01g/l、0.025g/l、0.05g/l、0.10g/l、0.25g/l、0.5g/l、1.0g/l。

23、进一步的，步骤（2）中，所述四氢甲基嘧啶羧酸样品中四氢甲基嘧啶羧酸的含量为25-100%。

24、进一步的，步骤（2）中，所述四氢甲基嘧啶羧酸样品中四氢甲基嘧啶羧酸的含量为90-100%。

25、进一步的，步骤（1）和步骤（2）中，所述过滤均使用过滤膜，滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

26、进一步的，步骤（3）中，所述标准品溶液与样品溶液的浓度为0.25g/l时，理论塔板数≥10000。理论塔板数衡量色谱柱效，理论塔板数大的色谱柱效率高。塔板数越高，说明色谱柱的分离性能越好，越符合要求。

27、进一步的，步骤（3）中，所述高效液相色谱仪的检测条件为：色谱柱：zorbaxoriginal 70a nh2，5um，4.6*250mm；柱温：30℃；流动相：按质量计，70%乙腈，30%水；流速：1ml/min；检测波长：210nm。

28、进一步的，步骤（3）中，所述高效液相色谱仪的进样量为10μl。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

30、1、本发明方法采用液相色谱仪检测，选用氨基柱，具有回收率高、重现性好、精密度高、专属性较强等优点。而传统方法测定四氢甲基嘧啶羧酸含量时选用c18色谱柱，具有出峰快、重复性差、精密度低等缺点，本发明克服了这些缺点。

31、2、本发明选用的氨基柱可以多次重复使用，多次使用后检测效果依然较好，主峰与杂峰的分离度好，而c18柱不能多次重复使用，重复使用后主峰与杂峰的分离度差，影响检测结果。使用氨基柱有利于节约成本，增加经济效益。

32、3、四氢甲基嘧啶羧酸具有非常强的极性，在疏水性的c18柱上保留时间短，峰面积极不稳定，分离度达不到要求，而本发明检测方法分离度好，适合不同纯度四氢甲基嘧啶羧酸的样品检验。

技术特征：

1.一种四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪选用的色谱柱为氨基柱zorbax original 70a nh2。

3.根据权利要求1或2所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（1）中，所述四氢甲基嘧啶羧酸标准品的纯度≥99%。

4.根据权利要求3所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（1）中，所述标准品溶液的浓度为0.01-1.0g/l。

5.根据权利要求4所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（2）中，所述标准品溶液的浓度为0.01g/l、0.025g/l、0.05g/l、0.10g/l、0.25g/l、0.5g/l、1.0g/l。

6.根据权利要求5所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（2）中，所述四氢甲基嘧啶羧酸样品中四氢甲基嘧啶羧酸的含量为25-100%。

7.根据权利要求1所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）中，所述过滤均使用过滤膜，滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

8.根据权利要求4-7任一所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（3）中，所述标准品溶液与样品溶液的浓度为0.25g/l时，理论塔板数≥10000。

9.根据权利要求8所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（3）中，所述高效液相色谱仪的检测条件为：色谱柱：zorbax original 70a nh2，5um，4.6*250mm；柱温：30℃；流动相：按质量计，70%乙腈，30%水；流速：1ml/min；检测波长：210nm。

10.根据权利要求1所述的四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，其特征在于：步骤（3）中，所述高效液相色谱仪的进样量为10μl。

技术总结
本发明公开了一种四氢甲基嘧啶羧酸含量的测定方法，属于产品质量检测领域。包括以下步骤：（1）准确称取四氢甲基嘧啶羧酸标准品，溶解，过滤，配制成标准品溶液；（2）称取四氢甲基嘧啶羧酸样品，溶解、过滤、定容，配制成样品溶液；（3）将标准品溶液和样品溶液进行检测，记录色谱图；（4）根据标准品溶液的浓度与所得峰面积计算出四氢甲基嘧啶羧酸浓度与峰面积的标准回归曲线y＝a＋bx；（5）根据样品溶液四氢甲基嘧啶羧酸的峰面积与标准回归曲线计算样品溶液中四氢甲基嘧啶羧酸的浓度；（6）计算样品中四氢甲基嘧啶羧酸含量。本发明测定方法检测四氢甲基嘧啶羧酸的含量稳定，测定结果准确，重现性好，回收率高，精密度高。

技术研发人员：袁伟娜,李海军,曾冬明,王兆兰,刘爱凤,邱雅亭,吴欢欢,陈继美,高宁
受保护的技术使用者：山东福瑞达生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7