一种检测并定量膜表面蛋白的探针及其使用方法和应用

本发明涉及生物医药，尤其是一种检测并定量膜表面蛋白的探针及其使用方法和应用。

背景技术：

1、生物体富含膜结构，细胞，细胞器，细胞分泌的细胞外囊泡、凋亡小体都具有膜结构。膜结构是由脂质双层组成的，其头部磷脂面向水性环境，尾部等疏水性物质则相互靠拢以形成内部。蛋白质和碳水化合物都是生物膜的重要组成部分且发挥重要作用。膜表面蛋白具有多种重要功能，包括介导细胞间的识别、黏附和相互作用；作为细胞外信号分子的受体触发特定的信号转导通路；形成通道或载体，调节物质的跨膜运输；与细胞骨架或者其他膜蛋白相互作用，提供细胞膜的结构支持和稳定性。膜表面蛋白的组成和丰度情况可反映细胞类型和状态，因此对表面蛋白进行检测和定量可以作为疾病诊断的一种手段。

2、目前检测膜表面蛋白的方法主要是质谱、荧光光谱检测、流式细胞术、微流控芯片、拉曼光谱以及基于抗体识别的测序，但是这些方法都有其局限性。其中质谱需要裂解待测物，实验操作和数据分析都需要专业人员执行，还需要质谱仪；荧光光谱检测得到的信号相对比较粗糙，且由于荧光波长的限制，容易发生串色而无法同时检测多种蛋白；流式细胞术需要复杂的前期处理并且受限于仪器的分辨率；微流控芯片的设计和制备通常需要精确的微加工技术，需要专门的操作和设备，并且检测方法通常基于抗体-抗原识别，特异性和灵敏度受限；拉曼光谱是一种基于分子振动的光谱技术，容易出现混杂信号，对光谱数据的解释和分析可能需要专门的技术和经验；基于抗体识别的测序技术需要在抗体上修饰dna链用于后续的pcr扩增测序，在控制一个代谢物上只修饰一条dna链上存在一定的技术难点，且价格昂贵。

3、上述的检测方法均无法做到精确定量，因此，需要设计一种检测并定量膜表面蛋白的探针及其使用方法和应用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，提供一种检测并定量膜表面蛋白的探针及其使用方法和应用。

2、本发明通过下述方案实现：

3、一种检测并定量膜表面蛋白的探针，该探针包括检测探针和计数探针；所述检测探针靶向膜特征蛋白和在肿瘤发生发展过程中发挥作用的膜表面蛋白。

4、所述检测探针包括五部分，第一部分是核酸适配体，用于识别表面蛋白；第二部分是pcr的引物结合域，用于后续的pcr扩增；第三部分是检测探针的分子编码部分，一个umi代表一个检测探针；第四部分是核酸适配体的标签，指示是何种适配体，也指示是何种表面蛋白；第五部分是5nt的互补区域，能够与计数探针的3′端互补结合，用于后续的延伸。

5、所述计数探针由三部分组成，第一部分是5′修饰的胆固醇，用于靶向膜的脂质双分子层；第二部分是pcr反应的引物结合域，同样用于后续的pcr扩增；第三部分是与检测探针的3′末端结合的互补序列。

6、一种检测并定量膜表面蛋白的探针的使用方法，该方法包括以下步骤：该探针包括检测探针和计数探针，当检测探针和计数探针同时结合到膜上，互补区域结合，在酶的作用下，两条链发生延伸，补足成双链；

7、再对延伸产物进行pcr扩增，提纯回收目的条带送ngs测序；

8、获得测序结果后对数据进行生信分析，通过对原始数据筛选过滤后得到清洁数据；

9、再与参考序列比对，抓取比对上的数据提取信息，生成蛋白计数矩阵，实现多种膜表面蛋白的精确定量。

10、所述酶为t4 dna聚合酶。

11、通过page胶提纯回收目的条带。

12、所述检测探针可以靶向膜特征蛋白和在肿瘤发生发展过程中发挥作用的膜表面蛋白。

13、一种检测并定量膜表面蛋白的探针的应用，所述探针用于检测并定量膜表面蛋白。

14、所述探针用于原位检测并定量膜表面蛋白。

15、所述探针用于原位检测并定量膜特征蛋白和多种在肿瘤发生发展过程中发挥作用的膜表面蛋白。

16、本发明的有益效果为：

17、本发明可以一锅法同时检测多种膜表面蛋白，中间不需要清洗步骤，最重要的是本发明设计的表面蛋白检测方法不依赖于抗体，且能够做到精确定量。

技术特征：

1.一种检测并定量膜表面蛋白的探针，其特征在于：该探针包括检测探针和计数探针；所述检测探针靶向膜特征蛋白和在肿瘤发生发展过程中发挥作用的膜表面蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种检测并定量膜表面蛋白的探针，其特征在于：所述检测探针包括五部分，第一部分是核酸适配体，用于识别表面蛋白；第二部分是pcr的引物结合域，用于后续的pcr扩增；第三部分是检测探针的分子编码部分，一个umi代表一个检测探针；第四部分是核酸适配体的标签，指示是何种适配体，也指示是何种表面蛋白；第五部分是5nt的互补区域，能够与计数探针的3'端互补结合，用于后续的延伸。

3.根据权利要求1所述的一种检测并定量膜表面蛋白的探针，其特征在于：所述计数探针由三部分组成，第一部分是5'修饰的胆固醇，用于靶向膜的脂质双分子层；第二部分是pcr反应的引物结合域，同样用于后续的pcr扩增；第三部分是与检测探针的3'末端结合的互补序列。

4.一种检测并定量膜表面蛋白的探针的使用方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：该探针包括检测探针和计数探针，当检测探针和计数探针同时结合到膜上，互补区域结合，在酶的作用下，两条链发生延伸，补足成双链；

5.根据权利要求4所述的一种检测并定量膜表面蛋白的探针的使用方法，其特征在于：所述酶为t4 dna聚合酶。

6.根据权利要求4所述的一种检测并定量膜表面蛋白的探针的使用方法，其特征在于：通过page胶提纯回收目的条带。

7.根据权利要求4所述的一种检测并定量膜表面蛋白的探针的使用方法，其特征在于：所述检测探针可以靶向膜特征蛋白和在肿瘤发生发展过程中发挥作用的膜表面蛋白。

8.一种检测并定量膜表面蛋白的探针的应用，其特征在于：所述探针用于检测并定量膜表面蛋白。

9.根据权利要求8所述的一种检测并定量膜表面蛋白的探针的应用，其特征在于：所述探针用于原位检测并定量膜表面蛋白。

10.根据权利要求9所述的一种检测并定量膜表面蛋白的探针的应用，其特征在于：所述探针用于原位检测并定量膜特征蛋白和多种在肿瘤发生发展过程中发挥作用的膜表面蛋白。

技术总结
本发明公开了一种检测并定量膜表面蛋白的探针，该探针包括检测探针和计数探针；所述检测探针靶向膜特征蛋白和在肿瘤发生发展过程中发挥作用的膜表面蛋白。使用方法步骤：当检测探针和计数探针同时结合到膜上，互补区域结合，在酶的作用下，两条链发生延伸，补足成双链；再对延伸产物进行PCR扩增，提纯回收目的条带送NGS测序；获得测序结果后对数据进行生信分析，通过对原始数据筛选过滤后得到清洁数据；再与参考序列比对，抓取比对上的数据提取信息，生成蛋白计数矩阵，实现多种膜表面蛋白的精确定量。本发明可以一锅法同时检测多种膜表面蛋白，中间不需要清洗步骤，最重要的是本发明设计的表面蛋白检测方法不依赖于抗体，且能够做到精确定量。

技术研发人员：王鹏飞,叶晶,杨栋磊
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属仁济医院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/9