一种检测尼古丁的酶联免疫试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种尼古丁的酶联免疫试剂盒及应用，具体涉及一种用于检测尼古丁的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测烟草制品中尼古丁的含量。属于生物化工。

背景技术：

1、尼古丁(nicotine)，俗名烟碱，是一种有机化合物，化学式c10h14n2，有剧毒，其存在于茄科植物(茄属)中，尼古丁在烟草植物中的含量较高，是烟草中的主要生物碱之一，是目前判断是否是烟草制品的主要靶标物之一。目前常用的尼古丁检测方法主要是仪器方法，如高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法，采用这些分析方法不仅需要昂贵的仪器和专业的技术人员，样品前处理过程复杂、周期长、成本高，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法可以定性、定量检测样品中的尼古丁含量。

技术实现思路

1、本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种能够检测卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟和类烟产品中尼古丁含量的酶联免疫试剂盒，并提供一种快速、简单、高效的适用于大批量样品的定性、定量检测方法。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、尼古丁标准品溶液、尼古丁特异性抗体、酶标二抗、显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为尼古丁偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的山羊抗小鼠二抗。

4、所述的本发明所采用的尼古丁半抗原是从8种尼古丁半抗原中优选而来，其筛选的原则以分子刚性结构和免疫学经验为依据，特别地对比了尼古丁5号位上不同取代基团的半抗原结构和动物免疫血清数据，同时考察了羧基半抗原和氨基半抗原的血清数据，实验结果表明5号位点的氨基半抗原免疫学结果较好，其中氨基半抗原-5(即尼古丁半抗原)为优选半抗原结构。

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6、所述尼古丁半抗原的制备方法是由尼古丁和联硼酸频那醇酯在甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体催化下进行硼化反应，制备5-四烷氧乙硼基-尼古丁(化合物3)，引入双氧水制备5-羟基-尼古丁(化合物4)，在化合物4上引入叔丁基(2-溴乙基)氨基甲酸酯，最后加入三氟乙酸制备尼古丁半抗原5-氨基-乙氧基-尼古丁，其分子结构式为：

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8、其合成路径如图2所示；

9、所述尼古丁偶联抗原是由尼古丁半抗原与载体蛋白偶联得到，所述尼古丁半抗原是经化学反应得到，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或甲状腺蛋白。

10、所述尼古丁特异性抗体是以尼古丁偶联抗原作为免疫原制备获得，所述尼古丁特异性抗体可为尼古丁单克隆抗体或尼古丁多克隆抗体，其中优选尼古丁单克隆抗体。

11、所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标二抗是由酶和山羊抗小鼠二抗偶联得到的。

12、为了更方便大量样本筛查，所述试剂盒还包括尼古丁标准品溶液、显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

13、所述尼古丁标准品溶液7瓶，浓度分别为0、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml。

14、当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色液为单组份tmb显色液或双组分tmb显色液，所述终止液为1～2mol/l的硫酸或2～4mol/l的盐酸。当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/l氢氧化钠溶液。

15、所述洗涤液优选为ph值为7.4，含有0.01％-0.5％吐温-20、0.01％-0.2％proclin300防腐剂、0.01-0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为体积百分比。

16、其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为ph值9.6、0.05mol/l的碳酸盐缓冲液，封闭液为ph值7.1～7.5、含有3％-10％脱脂奶粉、0.01-0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为体积百分比。

17、本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.1μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜，甩干孔中液体，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入100-200μl封闭液，37℃避光孵育2h，甩干孔中液体，洗涤液洗涤3次，拍干，干燥后用铝箔袋真空密封保存。

18、本发明的检测原理为：

19、本试剂盒采用竞争elisa方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中游离的尼古丁和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗尼古丁的抗体，加入酶标二抗后，用tmb底物显色，样本吸光度值与其尼古丁的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中尼古丁的含量。

20、本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测尼古丁的方法，它包括步骤：

21、1)将待测样本进行前处理，得到待测样本溶液；

22、2)用上述尼古丁酶联免疫检测试剂盒检测待测样本溶液；

23、3)分析检测结果。

24、本发明检测尼古丁的酶联免疫试剂盒主要采用酶联免疫分析方法定性或定量检测样品中尼古丁的含量；样品前处理过程简单快速，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法简单易行，具有特异性高、灵敏度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、操作简便、价格便宜、准确、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。

25、本发明应用酶联免疫法，测定卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟和类烟产品中尼古丁的含量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

技术特征：

1.一种尼古丁酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：包括包被有包被原的酶标板、尼古丁标准品溶液、尼古丁特异性抗体、酶标二抗、显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为尼古丁偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的山羊抗小鼠二抗，所述尼古丁偶联抗原为尼古丁半抗原与载体蛋白的偶联物，所述尼古丁半抗原是通过以下方法制备而成：是由尼古丁和联硼酸频那醇酯在甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体催化下进行硼化反应，制备5-四烷氧乙硼基-尼古丁(化合物3)，引入双氧水制备5-羟基-尼古丁(化合物4)，在化合物4上引入叔丁基(2-溴乙基)氨基甲酸酯，最后加入三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和二氯甲烷(dichloromethane,dcm)制备尼古丁半抗原5-氨基-乙氧基-尼古丁(氨基半抗原-5)，其分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的尼古丁酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：制备尼古丁半抗原的具体反应过程即合成路径如下：

3.根据权利要求1所述的尼古丁酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：制备尼古丁半抗原的具体步骤如下：

4.根据权利要求1所述的尼古丁酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或甲状腺蛋白。

5.根据权利要求1所述的尼古丁酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的尼古丁特异性抗体为尼古丁单克隆抗体。

6.一种应用权利要求1-5任一项所述的尼古丁酶联免疫检测试剂盒检测样本中尼古丁含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

技术总结
一种检测尼古丁的酶联免疫试剂盒及其应用，包括：包被有包被原的酶标板、尼古丁标准品溶液、尼古丁特异性抗体、酶标二抗、显色液、终止液等，包被原为尼古丁偶联抗原，酶标二抗为酶标记的山羊抗小鼠二抗。所述尼古丁半抗原是从8种尼古丁半抗原中优选而来，筛选原则以分子刚性结构和免疫学经验为依据，特别地对比了尼古丁5号位上不同取代基团的半抗原结构，氨基半抗原‑5为优选半抗原结构。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测尼古丁的方法。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟和类烟产品中尼古丁的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

技术研发人员：刘珊珊,彭云铁,唐纲岭,刘军,范子彦,欧阳晓艳,马梦柯,王颖,边照阳,杨飞,邓惠敏
受保护的技术使用者：国家烟草质量监督检验中心
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10