一种监测青霉素G酰化酶催化合成头孢拉定的方法与流程

本发明涉及药物分析，尤其涉及一种监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法。

背景技术：

1、头孢拉定又叫头孢菌素ⅵ，属于第一代半合成头孢菌素，其对耐药性金黄色葡萄球菌及其它多种广谱抗生素耐药的杆菌等均有迅速而可靠的杀菌作用。头孢拉定的生产方法分为化学法和生物酶法，其中，化学法步骤繁琐，需要严格控制工艺条件，且成品中容易出现溶剂残留。生物酶催化效率高，具有很强的底物专一性，可以在常温常压下稳定地发挥催化作用，得到的产品杂质少，操作简便，对环境友好。相较于化学法，酶法合成大大减少了产品中杂质的种类和含量，在工业上得到了广泛的应用。

2、酶法合成是以7-adca为反应底物，双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐为侧链，在青霉素g酰化酶的催化下合成头孢拉定，合成的头孢拉定中的杂质有α-苯甘氨酸、双氢苯甘氨酸。在反应过程中需要及时判断反应条件是否合适、合成底物转化率、副产物产量，从而判断反应是否完全进行，以及及时对合成工艺进行优化，从而提高产物的收率和纯度。这就需要一种既能同时检测出各个反应组分，又能快速对各组分进行准确定量的方法。

3、中国药典2020版记载了7-adca、头孢氨苄、头孢拉定、α-苯甘氨酸和双氢苯甘氨酸的检测方法，但是，需要分多次采用不同的方法才能实现7-adca、头孢氨苄、头孢拉定、α-苯甘氨酸和双氢苯甘氨酸的检测，检测效率慢，不能适用于对反应过程的及时监测。为了更好地监控头孢拉定的合成工艺，保证头孢拉定产品质量的一致性和稳定性，有必要研发一种操作简便、可快速准确及时监测头孢拉定合成工艺的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中不能对青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定工艺进行及时、准确快速监测的问题，本发明提供一种监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

3、一种监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，包括如下步骤：

4、对照品溶液的配制：取7-adca对照品、2,5-二氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品、α-苯甘氨酸对照品和双氢苯甘氨酸对照品分别溶于磷酸盐缓冲液中，分别得到各对照品溶液；

5、采用高效液相色谱法对各对照品溶液和合成反应液进行检测，色谱条件为：

6、色谱柱：zorbax 300sb-c18，4.6mm*150mm，5μm，填料孔径

7、流动相a：磷酸二氢钠-甲酸水溶液，ph为6.3-6.7；

8、流动相b：甲醇-乙腈的混合溶液；

9、柱温：33℃-37℃；

10、uv检测器，检测波长：225nm-230nm；

11、梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

12、0min，97％-99％流动相a，3％-1％流动相b；

13、2.5min，97％-99％流动相a，3％-1％流动相b；

14、4.0min，69％-71％流动相a，31％-29％流动相b；

15、7.0min，69％-71％流动相a，31％-29％流动相b

16、11.5min，97％-99％流动相a，3％-1％流动相b。

17、在青霉素g酰化酶合成头孢拉定的过程中，需要及时得到反应底物、反应产物和反应副产物的数据，用于指导催化反应的控制条件和结束时间。现有单种物质的检测方法，通常不能满足酶催化合成反应中所产生的所有组分的检测和分离效果，且单一检测，总检测时间长，检测结果不能及时反应出合成反应的进行程度，也无法及时控制副反应的发生。

18、相对于现有技术，本发明提供的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，采用zorbax 300sb-c18，4.6mm*150mm，5μm色谱柱，通过特定的流动相，以特定的梯度洗脱方式，实现了头孢拉定合成反应液中α-苯甘氨酸、双氢苯甘氨酸两种杂质与7-adca、2,5-二氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐两种原料之间的有效分离，准确定性及定量检测合成母液中的各组分含量，进而对酶的催化能力、反应物的转化率、副产物的浓度进行准确判断，实时指导合成反应的控制条件及反应终止时间，进而提高合成的头孢拉定产品的质量和收率。

19、且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好，能够用更为简便的方法实现对头孢拉定合成反应液中杂质和原料的定性和定量检测，从而为及时监测反应进度，提高和更好地控制头孢拉定药品的质量提供有效保障，有利于保证头孢拉定产品质量的一致性和稳定性。

20、优选的，流动相a中，磷酸二氢钠的浓度为0.049mol/l-0.051mol/l，甲酸的浓度为0.09mol/l-0.11mol/l。

21、进一步优选的，流动相a中，磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/l，甲酸的浓度为0.1mol/l。

22、优选的，流动相b中，甲醇和乙腈的体积比为1:1。

23、优选的流动相在不产生基线干扰的前提下，能够更好地分离头孢拉定合成反应液中的杂质，利于杂质的检出，并且有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。

24、优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

25、0min，98％流动相a，2％流动相b；

26、2.5min，98％流动相a，2％流动相b；

27、4.0min，70％流动相a，30％流动相b；

28、7.0min，70％流动相a，30％流动相b

29、11.5min，98％流动相a，2％流动相b。

30、优选的梯度洗脱顺序，可以提高原料与各杂质峰之间的分离度和检测的灵敏度，使检测结果定量准确，且精密度高。

31、优选的，检测波长为228nm。

32、优选的，柱温为35℃。

33、优选的，流速为0.9ml/min-1.1ml/min。

34、进一步优选的，流速为1.0ml/min。

35、优选的，进样体积为20μl。

36、优选的检测条件可使头孢拉定合成液中各原料、杂质之间达到更高的分离度，可以保证各组分的有效检出，从而有效准确监测酶的催化性能、反应进度等，进而实时指导合成反应的控制条件及反应终止时间。

37、优选的，7-adca对照品溶液的浓度为0.5mg/ml，双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品溶液的浓度为为0.5mg/ml，α-苯甘氨酸对照品溶液的浓度为1mg/ml，双氢苯甘氨酸对照品溶液的浓度为1mg/ml。

38、本发明提供的检测方法，能够实现头孢拉定合成反应液中的杂质和反应原料之间的有效分离，准确定性及定量检测头孢拉定合成反应液中原料以及杂质情况，通过一次检测可同时得到酶的催化能力、反应物的转化率以及反应副产物的浓度等信息，且检测时间短，有利于对合成工艺进行及时调控及确定反应终止时间，从而保证头孢拉定产品的质量，具有较高的实用价值。

技术特征：

1.一种监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，流动相a中，磷酸二氢钠的浓度为0.049mol/l-0.051mol/l，甲酸的浓度为0.09mol/l-0.11mol/l。

3.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，流动相b中，甲醇和乙腈的体积比为1:1。

4.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

5.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，检测波长为228nm。

6.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，柱温为35℃。

7.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，流速为0.9ml/min-1.1ml/min。

8.如权利要求7所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，流速为1.0ml/min。

9.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，进样体积为20μl。

10.如权利要求1所述的监测青霉素g酰化酶催化合成头孢拉定的方法，其特征在于，7-adca对照品溶液的浓度为0.5mg/ml，双氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品溶液的浓度为为0.5mg/ml，α-苯甘氨酸对照品溶液的浓度为1mg/ml，双氢苯甘氨酸对照品溶液的浓度为1mg/ml。

技术总结
本发明涉及药物分析技术领域，具体公开一种监测青霉素G酰化酶催化合成头孢拉定的方法。按照下述高效液相色谱条件进行检测：色谱柱：zorbax300SB‑C18，4.6mm*150mm，5μm，填料孔径流动相A：磷酸二氢钠‑甲酸水溶液；流动相B：甲醇‑乙腈的混合溶液；检测波长225‑230nm，梯度洗脱。本发明实现了头孢拉定合成反应液中α‑苯甘氨酸、双氢苯甘氨酸两种杂质与7‑ADCA、2,5‑二氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐两种原料之间的有效分离，准确定性及定量检测合成母液中的各组分含量，进而对酶的催化能力、反应物的转化率、副产物的浓度进行准确判断，进而实时指导合成反应的控制条件及反应终止时间。

技术研发人员：孙晴,陈平,王京,吴少华,姚振永,马忠青,陈晓飞,甄崇礼,薛龙,侯佳,杨利国,李向科
受保护的技术使用者：天俱时工程科技集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17