一种党参基原和产地的鉴别方法

文档序号:40199569发布日期:2024-12-03 11:55阅读:23来源:国知局
一种党参基原和产地的鉴别方法

本发明涉及医药,具体涉及一种党参基原和产地的鉴别方法。


背景技术:

1、党参为桔梗科党参codonopsis pilosula(franch.)nannf.、素花党参c.pilosulanannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen或川党参c.tangshen oliv.的干燥根,是补益类大宗药材。党参主要分布在山西、甘肃、四川、重庆、湖北等地。根据不同产地和基原,目前常见的商品党参有山西产的党参基原称“潞党”,甘肃文县产的素花党参称“纹党”,甘肃产的党参基原称“白条党”等,以及分布在四川、重庆等地的川党参。其中山西的潞党参为道地药材,传统上认为其有较好的品质。根据产地和基原的不同,党参在质量和市场价格上存在显著差异,且造假现象屡禁不止。然而,来自不同基原和产地的党参在外观上较为相似,特别是在切成饮片后,利用传统的鉴别方法很难区分。这导致品种混淆、掺假以及以次充好等严重问题。因此,建立一种对党参基原和产地进行精准判别的方法尤为重要。

2、目前已报道的对党参基原或产地进行区分的方法主要包括利用红外光谱分析技术、基于多元素多离子耦合技术、基于电子鼻及电子舌技术等。然而,这些方法存在一定的局限性和缺陷。比如多元素含量的分析需要复杂的样品预处理过程,且党参中的元素并非其活性成分。近红外和电子鼻及电子舌技术也缺乏对党参有效活性成分的考虑,无法准确反映党参质量。

3、因此,亟需一种更精准和全面的区分与鉴别不同基原和产地的党参的方法。


技术实现思路

1、为了改善上述技术问题,本发明提供了一种基于党参中差异化学成分分析的党参基原和产地的鉴别方法。

2、本发明提供一种党参基原和/或党参产地的鉴别方法,所述鉴别方法包括以下步骤:

3、1)获取不同基原和/或不同产地的党参样品;

4、2)先筛选不同基原和/或不同产地的党参的差异化学成分,再测定不同基原和/或不同产地的党参的差异化学成分的含量;

5、3)将测得的不同基原和/或产地的党参的差异化学成分的含量数据导入rf模型中,进行模型参数的优化以及分类模型的验证,进而鉴别党参的基原和/或产地。

6、根据本发明的实施方案,所述步骤1)中,不同基原的党参样品包括:党参(拉丁名codonopsis pilosula(franch.)nannf.)、素花党参(拉丁名c.pilosulanannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen)、川党参(拉丁名c.tangshen oliv.)。

7、根据本发明的实施方案,所述步骤1)中,不同产地的党参样品包括:产自山西省的党参样品、产自甘肃省的党参样品、产自四川省的党参样品、产自重庆的党参样品。

8、根据本发明的实施方案,所述步骤1)中,不同基原和不同产地的党参样品包括:产自山西省的党参(拉丁名codonopsis pilosula(franch.)nannf.)、产自甘肃省的党参(拉丁名codonopsis pilosula(franch.)nannf.)、素花党参(拉丁名c.pilosulanannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen)、川党参(拉丁名c.tangshen oliv.)。

9、根据本发明的实施方案,步骤2)中,可利用uplc-q-tof-ms分析方法结合非靶向代谢组学筛选不同基原和/或不同产地的党参的差异化学成分。根据本发明的实施方案,对非靶向代谢组学数据进行多变量分析;优选地,分析方法选自主成分分析(pca)、偏最小二乘判别分析(pls-da)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)。

10、根据本发明的实施方案,所述步骤2)中,对党参样品进行uplc-q-tof-ms分析的方法为:

11、将党参样品粉碎成粉末,加入溶剂进行提取,得到供试溶液;供试溶液使用超高效液相串联q-tof质谱仪进行检测,即得到党参样本的uplc-q-tof-ms数据;

12、优选地,提取溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈等;例如70%甲醇;

13、优选地,党参样品与溶剂的质量体积比为100mg:0.5ml-10ml;例如100mg:5ml;

14、优选地,提取方法选自超声提取、浸渍提取、回流提取等;

15、优选地,分析方法具体为:将每份党参样品粉碎成粉末,每份党参样品称取100mg,加入5ml的70%甲醇溶液,超声30min进行提取,得到供试溶液,供试溶液使用超高效液相串联synapt-xs q-tof高分辨质谱仪进行检测,即得到每份党参样本的uplc-q-tof-ms数据。

16、根据本发明的实施方案,所述步骤2)中,筛选不同基原和/或不同产地的党参的差异化学成分的方法为:

17、获取每份党参样本的uplc-q-tof-ms数据;

18、将所有样本的uplc-q-tof-ms数据导入qi软件中进行数据处理;

19、采用pca、pls-da和opls-da等进行数据分析,筛选对组间差异贡献大的差异化学成分。

20、根据本发明的实施方案,差异化学成分选自有机酸类(例如奎宁酸、柠檬酸、5-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-2-羟基苯甲酸)、糖类物质(例如低聚糖,例如菊粉型寡糖;例如蔗果二糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖)、生物碱类(例如管花党参碱b、管花党参碱a、管花党参碱f、管花党参碱d、管花党参碱e)、苯丙素类(例如新绿原酸、党参苷i、党参苷b、分子式为c21h24o11且包含特征质谱片段[m-h-co2]-和[m-h-c6h6o3]-的苯丙素类化合物、分子式为c24h26o14且包含特征质谱片段[m-h-co2]-和[m-h-2co2]-的苯丙素类化合物)、炔苷类(例如党参炔苷宁、党参炔苷)、黄酮类(例如新苦参醇)、3-(苯甲酰氧基)-2-羟丙基β-d-吡喃葡萄糖醛酸、(e)-2-己烯-α-l-阿拉伯吡喃糖基-(1→6)-β-d-吡喃葡萄糖苷、己烯-β-槐糖苷、creosideⅳ中的一种、两种或多种。

21、根据本发明的实施方案,步骤2)中,也可根据党参包含的化学成分的含量高低、包含的化学成分所发挥药理药效大小等进行筛选差异化学成分;例如可选择主要的化学成分和关键的活性成分(例如含量高、发挥主要药效活性等)作为差异化学成分。

22、根据本发明的实施方案,差异化学成分选自色氨酸、丁香苷、党参苷i、党参炔苷宁、党参炔苷中的一种、两种或多种。

23、根据本发明的实施方案,差异化学成分选自管花党参碱b、3-(苯甲酰氧基)-2-羟丙基β-d-吡喃葡萄糖醛酸、(e)-2-己烯-α-l-阿拉伯吡喃糖基-(1→6)-β-d-吡喃葡萄糖苷、管花党参碱a、管花党参碱d、管花党参碱e、党参苷b、分子式为c21h24o11且包含特征质谱片段[m-h-co2]-和[m-h-c6h6o3]-的苯丙素类化合物、分子式为c24h26o14且包含特征质谱片段[m-h-co2]-和[m-h-2co2]-的苯丙素类化合物中的一种、两种或多种。

24、根据本发明的实施方案,分子式为c21h24o11的苯丙素类化合物包括:t3色谱柱保留时间小于党参苷a的分子式为c21h24o11的苯丙素类化合物,t3色谱柱保留时间大于党参苷a的分子式为c21h24o11的苯丙素类化合物。

25、根据本发明的实施方案,差异化学成分选自果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖、蔗果九糖、蔗果十糖中的一种、两种或多种。

26、根据本发明的实施方案,所述步骤2)中,对筛选出的差异化学成分进行含量测定的方法选自如下任一种:

27、uplc-uv法:利用超高效液相串联二极管阵列检测器(uplc-pda)进行测定,得到每份党参样品的差异化学成分的含量值;

28、相对定量法:利用不同浓度的质控溶液作标准曲线,进行相对定量,得到每份党参样品的差异化学成分的相对含量值;

29、uplc-elsd法:利用超高效液相串联蒸发光散射检测器(uplc-elsd)进行含量测定,得到每份党参样品的差异化学成分的含量值;

30、优选地,对筛选出的差异化学成分进行含量测定的方法选自如下任一种:

31、uplc-uv法:对于有对照品且有紫外吸收峰的差异化学成分,可利用超高效液相串联二极管阵列检测器(uplc-pda)进行测定,得到每份党参样品的差异化学成分的含量值;

32、相对定量法:对于没有对照品的差异化学成分,利用不同浓度的质控溶液作标准曲线,对其进行相对定量,得到每份党参样品的差异化学成分的相对含量值;

33、uplc-elsd法:对于糖类物质,可利用超高效液相串联蒸发光散射检测器(uplc-elsd)对其进行含量测定,得到每份党参样品的差异化学成分的相对含量值。

34、根据本发明的实施方案,利用uplc-uv法对筛选出的差异化学成分进行定量;优选地,利用uplc-uv法定量的差异化学成分选自色氨酸、丁香苷、党参苷i、党参炔苷宁、党参炔苷中的一种、两种或多种。

35、根据本发明的实施方案,利用uplc-uv法对筛选出的差异化学成分进行定量的方法为:

36、将党参样品粉碎成粉末,加入溶剂进行提取,得到供试溶液;供试溶液使用超高效液相串联二极管阵列检测器(uplc-pda)进行检测,即得到党参样本所包含的差异化学成分的含量值;

37、优选地,提取溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈等;例如70%甲醇;

38、优选地,党参样品与溶剂的质量体积比为100mg:0.5ml-10ml;例如100mg:5ml;

39、优选地,提取方法选自超声提取、浸渍提取、回流提取等;

40、优选地,测定方法具体为:

41、将每份党参样品粉碎成粉末,每份党参样品称取100mg,加入5ml的70%甲醇溶液,超声30min进行提取,得到供试溶液,供试溶液使用超高效液相串联二极管阵列检测器(uplc-pda)进行检测,即得到每份党参样本的差异化学成分的含量值。

42、根据本发明的实施方案,uplc-uv法的色谱分析条件为:

43、色谱柱:反相t3色谱柱;优选地,cortecs uplc t3超高效液相色谱柱;优选地,尺寸为2.1x 100mm,1.6μm;

44、流动相:包括a相和b相,a相为包含0-0.5%甲酸的水溶液,b相为包含0-0.5%甲酸的乙腈溶液;优选地,a相为包含0.1%甲酸的水溶液,b相为包含0.1%甲酸的乙腈溶液;

45、洗脱:梯度洗脱;优选地,梯度洗脱程序为:0~1.0min,2%-5% b;1.0~2.0min,5%-9%b;2.0~3.0min,9%-11% b;3.0~6.0min,11%-15% b;6.0~9.0min,15%-18%b;9.0~12.0min,18%-26% b;12.0~14.0min,26%-50% b;14.0~16.0min,50%-60%b;16.0~18.0min,60%-80%b;18.0~18.5min,80%-98% b;18.5~21.5min,98% b;

46、柱温:20℃-50℃;例如,40℃;

47、流速:0.3ml/min-1ml/min;例如,0.5ml/min;

48、进样量:0.5μ-2μl;例如,1μl;

49、紫外检测器波长范围:190nm~400nm;优选地,检测波长设为260nm-270nm,例如267nm。

50、根据本发明的实施方案,利用相对定量方法对筛选出的差异化学成分进行定量;优选地,利用相对定量方法定量的差异化学成分选自管花党参碱b、3-(苯甲酰氧基)-2-羟丙基β-d-吡喃葡萄糖醛酸、(e)-2-己烯-α-l-阿拉伯吡喃糖基-(1→6)-β-d-吡喃葡萄糖苷、管花党参碱a、管花党参碱d、管花党参碱e、党参苷b、分子式为c21h24o11且包含特征质谱片段[m-h-co2]-和[m-h-c6h6o3]-的苯丙素类化合物、分子式为c24h26o14且包含特征质谱片段[m-h-co2]-和[m-h-2co2]-的苯丙素类化合物中的一种、两种或多种。

51、根据本发明的实施方案,相对定量方法的色谱分析条件为:

52、色谱柱:反相t3色谱柱;优选地,cortecs uplc t3超高效液相色谱柱;优选地,尺寸为2.1x 100mm,1.6μm;

53、流动相:包括a相和b相,a相为包含0-0.5%甲酸的水溶液,b相为包含0-0.5%甲酸的乙腈溶液;优选地,a相为包含0.1%甲酸的水溶液,b相为包含0.1%甲酸的乙腈溶液;

54、洗脱:梯度洗脱;优选地,梯度洗脱程序为:0~1.0min,2%-5% b;1.0~2.0min,5%-9%b;2.0~3.0min,9%-11% b;3.0~6.0min,11%-15% b;6.0~9.0min,15%-18%b;9.0~12.0min,18%-26% b;12.0~14.0min,26%-50% b;14.0~16.0min,50%-60%b;16.0~18.0min,60%-80%b;18.0~18.5min,80%-98% b;18.5~21.5min,98% b;

55、柱温:20℃-50℃;例如,40℃;

56、流速:0.3ml/min-1.0ml/min;例如,0.5ml/min;

57、进样量:0.5μ-2μl;例如,1μl。

58、根据本发明的实施方案,相对定量方法的质谱分析条件为:

59、离子化模式为esi负离子;mse采集模式,除溶剂气体为氮气(优选地,流速900l·h-1;优选地,除溶剂温度为450℃),碰撞气体为氩气;

60、优选地,毛细管电压为2.5kv(-);优选地,锥孔电压为40v;优选地,离子源温度为100℃;优选地,扫描范围为m/z 50~1500da;优选地,低能量扫描时trap碰撞能量为6ev;优选地,高能量扫描时trap碰撞能量为50-80ev;优选地,准确质量数用亮氨酸脑啡肽作校正液。

61、根据本发明的实施方案,利用uplc-elsd对糖类物质进行含量测定;优选地,糖类物质选自单糖、低聚糖、菊粉型寡糖中的一种、两种或多种;进一步优选地,糖类物质选自果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖、蔗果九糖、蔗果十糖中的一种、两种或多种。

62、根据本发明的实施方案,利用uplc-elsd法对糖类物质进行含量测定的方法为:

63、将党参样品粉碎成粉末,加入溶剂进行提取,得到供试溶液;供试溶液使用超高效液相串联蒸发光散射检测器(uplc-elsd)进行检测,即得到党参样本所包含的糖类物质的含量值;

64、优选地,提取溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈等;例如70%甲醇;

65、优选地,党参样品与溶剂的质量体积比为100mg:0.5ml-10ml;例如100mg:5ml;

66、优选地,提取方法选自超声提取、浸渍提取、回流提取等;

67、优选地,测定方法具体为:

68、将每份党参样品粉碎成粉末,每份党参样品称取100mg,加入5ml的70%甲醇溶液,超声30min进行提取,得到供试溶液,供试溶液使用超高效液相串联蒸发光散射检测器(uplc-elsd)进行检测,即得到每份党参样本的糖类物质的含量值。

69、根据本发明的实施方案,uplc-elsd法色谱分析条件为

70、色谱柱:亲水作用(hilic)色谱柱;优选地,beh amide超高效液相色谱柱;优选地,尺寸为2.1x 100mm,1.7μm;

71、柱温:40℃-70℃;例如,60℃;

72、流动相:包括a相和b相,a相为包含0-0.2%氨水的水溶液,b相为包含0-0.2%氨水的乙腈溶液;优选地,流动相a为包含0.1%氨水的水溶液,流动相b为包含0.1%氨水的乙腈溶液;

73、流速:0.1ml/min-0.3ml/min;例如,0.2ml/min;

74、洗脱:梯度洗脱;优选地,测量果糖、葡萄糖、蔗糖的梯度洗脱条件:0~1.0min,98%~81%b;1.0~9.0min,81% b;9.0~10.0min,81%~55% b;10.0~15.0min,55%b;优选地,测量蔗果三糖~蔗果十糖的梯度洗脱条件:0-1min,98%-75% b;1-7min,75%-70% b;7-18min,70%-55% b;18-23min,55% b;

75、进样量:0.5μl-2μl;优选地,0.5μl、1.0μl、2μl;

76、优选地,蒸发光散射检测器(elsd)参数:漂移管温度50℃,增益500,喷雾器为冷却模式,气体压力40psi。

77、根据本发明的实施方案,步骤3)具体包括如下步骤:

78、将测得的所有党参样品的差异化学成分的含量数据整合为数据集,并导入rf模型中;

79、将所有党参样品以7:3的比例随机分为训练集和测试集;

80、利用训练集中20%的样本作为验证集,基于验证集上的识别准确率进行的k折交叉验证,对rf模型中树的数量和最大特征数进行优化。

81、对测试集样品进行预测,得到判别准确率。

82、根据本发明的实施方案,rf模型中优化后树的数量设置为120,最大特征数设为2sqrt。

83、根据本发明的实施方案,首先利用差异化学成分的含量数据分别构建rf模型,然后采用rf模型中自变量的贡献分数来识别在差异化学成分中排名前50%的化合物,创建了一个融合数据集,用于建立rf分类判别模型。

84、本发明提供了一种党参基原和/或产地的鉴别方法,与现有鉴别方法相比,具有以下有益效果:

85、(1)本发明利用不同党参中的差异化学成分作为指标,对其基原和/或产地及进行鉴别;差异化学成分(包括次生代谢产物和低聚糖成分)是党参中的重要活性成分,能在一定程度上代表党参的质量,用它们的差异来进行党参鉴别更能关联其质量,结果更为可靠和精准;

86、(2)本发明利用超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱法(uplc-q-tof-ms)筛选不同基原和/或不同产地的党参的差异化学成分,具有较高的灵敏度和高分辨率,能全面的对党参中的差异化学成分(尤其是次生代谢产物)进行表征;

87、(3)本发明利用非靶向代谢组学筛选不同基原和/或产地党参的差异代谢物,并用pca、pls-da和opls-da等进行数据分析,能够更为高效地找到对组间差异贡献大的标记物。

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