本发明属于生物，具体涉及一种骨关节炎早期诊断试剂盒及其构建方法。
背景技术：
1、核酸适配体是检测骨性关节炎早期生物标志物的理想工具。由于血清生物标记物检测敏感性及特异性高，临床上容易实施，因此逐渐成为被广泛用于疾病诊断的手段。研究表明，软骨酸性蛋白1（crtac1）是一种新的潜在的骨性关节炎生物标志物，可以用于骨性关节炎的疾病监测，但目前缺乏针对老年骨性关节炎的早期预警血清标记物研究。近年来，核酸适配体（aptamer）作为一种通过指数富集的配体系统进化（selex）技术筛选出来的一段单链寡核苷酸（rna/ssdna），其能够通过其三维结构借助氢键、疏水键、范德华力或离子键等作用，与目标蛋白高特异性、高稳定性、高亲和力的结合。
2、已有研究证实，核酸适配体能够成功靶标离子、小分子、多肽、蛋白质、细胞和组织等。其既能够作为检测试剂及成像工具实现对特定目标的量化和追踪，还能够用于靶向载药，甚至直接作为新型的生物药物对疾病进行治疗。鉴于核酸适配体“化学抗体”的称号，其常作为特异性识别元件应用于传感器的设计，包括荧光传感器、生物传感器和电化学传感器，从而快速检测复杂样品基质中的目标物质。
3、骨关节炎作为全球最常见的关节疾病，早期诊断对患者的生活质量及疾病进展至关重要。然而，当前诊断方法存在诸多限制，因此，我们需要更无创、准确的生物标志物来辅助诊断。软骨酸性蛋白作为一种新的潜在骨关节炎生物标志物，已被广泛用于疾病监测。研究显示，crtac1在骨关节炎患者的关节液和血清中表达显著升高，与疾病严重程度密切相关。
4、基于软骨酸性蛋白的重要性，我们开发了针对其的靶向适配体。适配体，作为“化学抗体”，具有合成简单、成本低、稳定性高等优点，能高亲和力和特异性地识别和结合靶标分子。通过selex技术，我们筛选并优化了与crtac1特异性结合的核酸适配体。
5、这些适配体在骨关节炎早期诊断中展现出巨大潜力。它们不仅提高了诊断的特异性和灵敏度，还能用于实时、定量检测软骨酸性蛋白，为疾病的早期诊断和监测提供了新方法。与传统生物标志物及影像学方法相比，适配体检测具有明显优势。基于此基础。我们开发了基于核酸适配体的血清检测试剂盒，用于测定血液中的crtac1蛋白含量。该试剂盒灵敏度高、特异性好，有助于实现早期干预，改善患者生活质量。
技术实现思路
1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种骨关节炎早期诊断试剂盒及其构建方法，用于测定血液中的crtac1蛋白含量。将辣根过氧化物酶（hrp）标记的适配体依次与被测样品反应，并将适配体的互补链（cdna）固定在微孔板上，通过基于酶催化底物的颜色变化快速测定crtac1含量。这种顺序反应避免了适配体与cdna的过度结合，从而确保了对crtac1的全覆盖识别。在测定血浆中crtac1表现出较高的灵敏度和稳定性，以及良好的加标回收率。
2、技术方案：第一方面，本发明提供一种骨关节炎早期诊断试剂盒，包括骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体、捕获探针和识别探针，所述适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述捕获探针为生物素修饰的适配体的反向互补链，其核苷酸序列如seq id no.2所示；所述识别探针为生物素修饰的适配体，其中，
3、seq id no.1：
4、5′-ataccagcttattcaattcagccgaagcacgacggggtccgcgagttcaggtcttttcagctaagccaagatagtaagtgcaatct-3′；
5、seq id no.2：
6、5′-agattgcacttactatcttggcttagctgaaaagacctgaactcgcggaccccgtcgtgcttcggctgaattgaataagctggtat-3′。
7、优选的，所述试剂盒还包括链霉素修饰的辣根过氧化物酶和链霉亲和素包被的bsa预封闭的聚苯乙烯微孔板。
8、第二方面，本发明提供一种第一方面所述的试剂盒的构建方法，包括以下步骤：
9、s1、构建捕获探针：通过向sa修饰的微孔板加入te缓冲液稀释生物素修饰的适配体互补cdna链，放置4℃的冰箱中备用；
10、s2、构建识别探针：将sa修饰的hrp稀释至所需浓度，然后以7：3的体积比与生物素标记的适配体混合，放置4℃的冰箱中备用；
11、s3、试剂盒的操作：将识别探针与血浆样本混合，加入微孔板中，与捕获探针孵育，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液显色，再加入硫酸终止，并在450 nm处测量最终吸光度。
12、第三方面，本发明提供第一方面所述的试剂盒或第二方面所述的构建方法构建的试剂盒在在监测骨关节炎发展进程中的应用。
13、优选的，所述骨关节炎为老年骨关节炎。
14、有益效果：本发明建立的骨关节炎早期诊断试剂盒，用于测定血液中的crtac1蛋白含量。将辣根过氧化物酶（hrp）标记的适配体依次与被测样品反应，并将适配体的互补链（cdna）固定在微孔板上，通过基于酶催化底物的颜色变化快速测定crtac1含量。这种顺序反应避免了适配体与cdna的过度结合，从而确保了对crtac1的全覆盖识别。
1.一种骨关节炎早期诊断试剂盒，其特征在于：包括骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体、捕获探针和识别探针，所述适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述捕获探针为生物素修饰的适配体的反向互补链，其核苷酸序列如seq id no.2所示；所述识别探针为生物素修饰的适配体。
2. 根据权利要求1所述的骨关节炎早期诊断试剂盒，其特征在于，还包括链霉素修饰的辣根过氧化物酶和链霉亲和素包被的 bsa预封闭的聚苯乙烯微孔板。
3.一种权利要求1或2所述的试剂盒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.权利要求1或2所述的试剂盒或权利要求3所述的构建方法构建的试剂盒在在监测骨关节炎发展进程中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述骨关节炎为老年骨关节炎。