专利名称：多功能阿达玛变换显微图像分析仪的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种把阿达玛变换(Hadamard Transform)多通道空间成像技术与显微技术相结合，用一个检测器(光电倍增管)获取微小物体的三维阿达玛变换显微荧光、显微拉曼和显微光度图像的新方法及新仪器。且该图像能精确地提供许多与微小物体有关的定性及定量信息。本发明属于医学仪器技术领域、属于分析测试领域，也属于生物化学领域。它是光调制技术、仪器制造、计算机及现代仪器分析等多种技术结合的产物。
阿达玛变换光谱(Hadamard Transform Spectroscopy)是过去二十几年发展起来的类似与傅立叶变换光谱(Fourier Transform Spectroscopy)的一种光谱调制技术，阿达玛变换给分析仪器带来了高的信噪比、多通道同时检测和成像能力以及能量分布的优点[M.O.Harwit，N.J.A.Sloane，“Hadamard Transform Optics”，AcademicNew York，1980]。阿达玛变换多通道显微成像技术是目前国际上前沿研究课题之一。目前，国外已在阿达玛变换显微拉曼光谱方面取得了进展[P.J.Treado，A.Govil，M.D.Morris，K.D.Sternitxke and R.L.MccreeryAppl.Spectrosc.，441270，1990]，但迄今为止，尚未见有关阿达玛变换显微荧光图像和显微光度图像方面的报道。也未见将这三种图像技术融合一体的商品化仪器，这是因为在这三种技术中，阿达玛变换显微荧光图像技术是最复杂最难实现的，因为阿达玛变换多通道图像技术的实现，要在不同的时间内采集信号的空间调制强度，这就要求为了获得不失真的微弱荧光图像，必须保持荧光强度在一定时间内相对稳定，这种相对稳定对于拉曼及吸收光谱来说易于满足，由于受荧光寿命、荧光衰减的影响，采集荧光图像确存在一些困难。
显微镜在细胞生物学和临床医学领域中是一种最基本也是最重要的分析仪器。目前，建立在显微技术基础上用于细胞或其他微小物体定性或定量分析的仪器有显微光度计、显微荧光计及各种显微图像分析仪。前两种仪器常常被用来对细胞或其他微小物体进行定量分析，而后一类仪器则常常用于细胞或微小物体的图像分析。这些仪器在定量分析速度、分析精度及分析灵敏度等方面均存在着不足之处，而且常规仪器往往难以同时提供被分析试样的显微图像和定量分析结果。
本发明的目的在于把阿达玛变换空间成像技术与显微技术结合起来，以一个灵敏的光电转换器件(光电倍增管)作检测器，建立一种能用于显微拉曼、显微荧光和显微光度定量图像分析和光谱分析等多功能的新仪器;为细胞生物学和临床医学分析提供一种快速、准确、灵敏，能提供微小物体的显微图像和定量分析结果的新的分析方法。
本发明的目的是这样实现的本发明所制造的仪器由光源、荧光显微镜、光斑压缩光学系统、阿达玛变换二维调制模板及二维步进电机驱动系统、单色仪、光电倍增管、CCD摄像机、12位数模转换板、桢存储板及微型计算机组成。显微镜载物台上的细胞或其他微小物体在光的照射下(激发光或透射光)产生光信号(荧光信号、拉曼信号、吸收信号)，所产生的光信号由显微镜的物镜所采集，经过全反射镜反射进入水平光路进行空间调制，或直接成像于CCD摄像机的焦平面上摄取物体的图像信号。进入水平光路的光信号通过透镜组成像于二维阿达玛变换模板上，由阿达玛变换模板对图像信号进行空间调制，调制后的信号压缩后进入光栅单色仪的入射狭缝，经单色仪分光后获得某一波长的单色光，再由光电倍增管进行光电转换，电信号经放大电路放大，由计算机AD卡实现模数转换，数字信号即被储存于计算机内，完成一个采样过程，分析荧光试样时采用计算机软件对荧光衰减进行同步校正，全部采样完成后，数字信号经快速阿达玛变换解码程序被还原成试样的三维阿达码图像。通过计算机软件对图像进行分析处理获得有关的定量分析结果。与已有技术相比，由于本发明在水平光路上采用了阿达玛变换模板对图像信号进行了空间调制，采用了图像压缩以及与单色仪光学匹配技术，采用了以理论推导校正公式编写的软件，对采样过程中的衰减进行同步校正，采用光电倍增管作光电转换器件，使该仪器能用一个检测器测得空间变换光谱信息，从而在国际上首次获得了微小试样的三维阿达玛变换微弱荧光图像以及光度图像，提高了仪器的信噪比、提高了定量分析精度。由于这种多通道检测能同时检测出多个分析信号及背景信号的强度，并从分析信号中同步扣除背景信号强度，因而使本方法在分析速度和分析准确度方面明显优于常规显微光度分析和显微荧光分析方法。同时，在垂直方向上，CCD能直接摄取微小物体的图像，起着显微图像分析仪的作用，通过CCD近摄物镜直接摄取X光片或其他物体，从而使该仪器还具备常规图像分析仪的功能，进一步拓宽了本仪器的功能和使用范围。
研制的仪器测量精度比图像分析仪高16倍(光强分度图像分析仪为256单位，本仪器为4096单位)，灵敏度比0.02 Lux的CCD摄像机高，测量信噪比较常规仪器高8-20倍，特别适于微弱光信号检测。对单个细胞的荧光强度及细胞的图像分析结果重现性好，RSD%低于10%。
下面结合附图
对本发明作进一步说明图(1)是多功能阿达玛变换显微图像分析仪的原理图(结构框图)。
图(1)中，1.溴钨灯，L1…L6透镜，2.聚焦镜，由1，L6，2.构成显微镜的透射光照明系统，3.载物台，4.物镜，5.激发光源(高压汞灯、氙灯或激光)，M双色束分光镜，P全反射镜，CCDCCD摄像机，6.阿达玛光栏，7.阿达玛变换调制模板，8.光栅单色仪，由L1，L2，6，7，L3，L4及8组成水平光路系统，9.光电倍增管，10.信号放大电路，11.12 bit AD/DA模数转换板，12.计算机，13.阿达玛变换调制模板机械传动装置及计算机接口，14.桢存储板，15.光栅单色仪扫描自动控制。
图(1)中，所分析的试样置显微镜载物台上，分析试样的图像信号(透射光、荧光或拉曼图像)由物镜(4)所采集，当用激发光照明时，物镜(4)还起到对激发光聚焦的作用。图像可直接进入CCD摄像机，由CCD摄像机摄取的图像经桢存储板(14)处理后被储存在计算机(12)内。由软件对该图像进行处理能提取直观试样的表观图像信息。由物镜采集的图像信号经全反射镜(P)反射进入水平光路系统，图像经透镜组L1L2清晰成像于阿达玛变换模板平面上，移动阿达玛变换模板对图像信号进行空间调制，阿达玛变换光栏用来限制图像空间调制范围。调制后的图像信号经透镜组L3L4压缩后，进入光栅单色仪(8)，信号经光栅单色仪分光后某一波长的单色光信号由光电倍增管(9)转换成电信号，电信号经放大电路(10)放大后进入计算机内AD卡进行模数转换，数字信号被存储在计算机(12)内，完成一个完整的采样过程。全部采样过程完毕后(n＝255时，采255次调制信号)，调制信号经快速阿达玛变换解调还原成试样的三维阿达玛变换显微图像，该图像包含两个空间维和一个光谱强度维，用软件对该图像进行处理就能获得所需的定性定量信息。
实施例1，阿达玛变换显微图像分析仪如原理图所示在荧光显微镜上安装一个带全反射镜的接口，把全反射镜插入光路，光线进入水平光路系统，把全反射镜移出光路，光线进入CCD摄像机并成像于CCD摄像机焦平面。由CCD摄像机、桢存储板、计算机及图像处理软件构成了该仪器的垂直光路系统，垂直光路系统用来获得试样的形貌图像。将由L1，L2，L3，L4组成的透镜组及阿达玛变换模板和光栏按图(1)所示组成仪器的水平光路系统。其中由L1L2组成的透镜组使试样成像于模板上，由L3L4组成的透镜组对经由模板调制的光信号进行压缩，压缩后的信号进入光栅单色仪的入射狭缝，与光栅单色仪的光学参数匹配。采取在石英玻璃基片上镀金属膜，然后采用光刻技术刻制所需的二维阿达玛变换模板及光栏，把模板及光栏按图(1)所示安装在水平光路系统中，其中光栏固定不动，模板能在二维方向上自如移动，以对光信号进行空间调制。二维模板固定在二维机械传动装置上，该装置是采用步进电机带动千分尺转动，通过千分尺把电机转动变成线性平动，达到推动模板移位设计的。机械传动装置由计算机软件、计算机接口及步进电机功率放大板来控制驱动，该系统能同时控制三台步进电机自如运转，其中两台电机用于控制模板二维精确移位，一台用于控制光栅单色仪光谱扫描，把水平光路系统及控制二维模板精确移位的部件按图(1)安装调试后，即可用模板对图像信号进行调制，并可通过计算机自动控制光栅单色仪进行光谱扫描，以获得试样的光谱信息。该仪器的分光系统采用商品化的光栅单色仪，检测器采用光电倍增管，模数转换采用12 bit模数/数模转换卡，数据及图像处理采用80386微型计算机完成，光电倍增管输出的电信号采用自制的两级集成运算电路，放大倍数为150-700倍。将以上各种部件按图(1)组装后即可组成为阿达玛变换显微图像分析仪。在该仪器上可进行阿达玛变换显微荧光图像及显微光度图像分析。当要进行显微拉曼图像分析时，需将球形超高压汞灯激发光源换成氩离子激光光源，即可在该仪器上进行阿达玛变换显微拉曼图像分析。该仪器调试后即可用于实际试样分析。
实施例2，人乳腺癌细胞的细胞核形貌和DNA含量定量分析表(1)-表(6)分别为湖北省肿瘤医院用该仪器分析6例人乳腺癌细胞的定量分析数据。6例人乳腺癌患者，每个患者最少分析20个细胞，每个细胞测两个定量数据DNA的含量(用Au为单位)和细胞核形貌(即面积，用pixels为单位)。表(7)为用该仪器分析洋葱细胞内DNA含量和细胞核的面积的定量分析数据，比较表(1)-表(6)和表(7)，可明显发现两者之间的差别。
权利要求
1.一种把阿达玛变换多通道空间成像技术与显微镜技术相结合，用一个检测器获取微小物体(细胞试样，组织试样，单晶矿物等)三维阿达玛变换的显微荧光、显微光度和显微拉曼图像的多功能阿达玛变换显微图像分析仪。其特征是采用阿达玛变换方法，以二维阿达玛变换模板对由显微镜物镜所采集的荧光、透射光或拉曼光信号进行空间调制(二维信号编码)，调制的信号经单色仪分光后由光电倍增管检测，采集的系列调制信号由快速阿达玛变换计算机程序进行解调还原成试样的图像，再从图像中获取精确的定量信息；
2.按权利要求1所述的多通道空间成像技术的阿达玛变换模板掩膜光刻制造技术，其特征是在石英玻璃基片上镀金属膜，然后采用光刻技术刻制所需模板;全部光学系统采用石英光学元件，因而光谱使用范围适宜于从紫外可见到红外;
3.按权利要求1和2所述的多通道空间成像技术的模板二维移动的机械传动装置及计算机控制接口和驱动电路，其特征是通过自行设计的接口及驱动电路，能用计算机自如地控制三台(两台用于二维模板移动，一台用于光谱扫描)步进电机运转;
4.按权利要求1所述的多功能阿达玛变换显微图像分析仪的水平光路系统，其特征是由全反射镜P反射的光信号，经透镜组压缩并成像于模板上。由模板对图像信号进行空间调制，调制后的信号再经与单色仪光学匹配的透镜组压缩，进入单色仪入射狭缝;
5.按权利要求1所述的快速阿达玛变换及图像处理系列软件，包括荧光衰变校正软件，其特征是可以对仪器进行自动控制、光谱扫描、图像生成、图像处理及定量分析结果统计等。
全文摘要
本发明公开了一种阿达玛变换空间多通道成像技术与显微技术相结合，并用一个检测器(光电倍增管)提供微小物体的图像和定量分析结果的新方法，依据研制出的多功能阿达玛变换显微图像分析仪可进行三维阿达玛变换显微荧光、显微拉曼和显微光度图像分析和光谱分析，并能开展常规图像分析、显微图像分析及显微光度分析。本发明比常规图像分析仪测量精度高16倍，测量信噪比高8—20倍，灵敏度比0.02Lux的CCD摄像机高，特别适于微弱光信号检测。对单个细胞的荧光强度及细胞的图像，分析结果重现性好，RSD％低于10％。
文档编号G01J3/42GK1114049SQ9410775
公开日1995年12月27日 申请日期1994年6月23日 优先权日1994年6月23日
发明者陈观铨, 梅二文 申请人:武汉大学