一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学和土壤学领域，涉及一种新的土壤内可利用氮素的测定方 法，更准确地说本发明涉及一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测 方法。
【背景技术】
[0002] 土壤养分参数（主要为氮、磷、钾及有机质含量）是土壤肥力的重要指标，反映了 土壤供给作物生长的能力；其中氮素是作物最重要的结构物质，也是酶的主要成分，所以氮 素对作物生理代谢和生长有重要作用。作物可利用的土壤内中主要氮素形式是铵态氮和硝 态氮；氮素的不同形态会对作物生理代谢过程和生长产生不同的影响。目前公认的土壤内 氮素营养诊断都是以实验室常规测试为主，取样、测定、数据分析等繁琐的过程需要耗费大 量的人力、物力，且未考虑氮素营养的多寡对其内生物的影响。
[0003] 细胞自噬（autophagy)是溶酶体（酵母中为液泡）参与的胞内物质代谢的过程， 是真核生物维持细胞稳态和保持健康的一类亚细胞降解途径，在真核生物中是保守的。目 前了解比较多的细胞自调控通路主要有两条：TOR(Targetofrapamycin)通路和磷脂酰 肌醇3-激酶（PI3K，Phosphoinositide3-kinase)通路，很多其他自途径都直接或间接 通过这两条通路发挥作用；Tor是细胞自噬的负调控因子，能特异性的响应胞内氮素水平， 在营养丰富的条件下，Tor激酶处于活性状态，此时细胞自噬受到抑制，而在营养缺乏等外 界条件下，Tor激酶失活而自噬活性上升；在可利用氮素营养缺乏的条件下，细胞内相关物 质会运往液泡进行降解，因而可以根据真核生物模式生物酿酒酵母耗尽培养基中的可利用 氮素，并且启动细胞自噬，从而将自噬相关蛋白如Atg8运往液泡的时间长短来建立模型和 检测土壤内氮素水平。
[0004] 目如国内外相关研宄还未有涉及该方面的成果，因而利用焚光标记的自相关蛋 白完全进入液泡的时长，可以有效的推测土壤内可利用氮素的水平。基于此，可以进行相关 技术方法的改进和测试设备的研制，具有重要的理论和现实意义。
【发明内容】
[0005] 为了解决土壤内氮素营养多寡未考虑其内生物的问题，基于细胞自噬与氮素营养 的关系，本发明提供了一种新颖的测试土壤内氮素营养的方法，即：在一定培养基中，一定 浓度的酿酒酵母细胞耗尽可利用氮素并启动细胞自噬，从而导致GFP-Atg8完全进入液泡， 根据这个过程的时长来推算土壤内可利用氮素的量。
[0006] 为解决上述问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] (1)酿酒酵母菌株Atg8蛋白的荧光标记和相应数量关系模型的建立：自噬相关蛋 白Atg8被GFP标记酿酒酵母菌株的特征在于，可以通过荧光显微镜方便观察到Atg8的分 布情况，当培养液中氮素营养缺乏时，GFP-Atg8会送往液泡降解；而在营养丰富的条件下， GFP-Atg8会弥散在细胞质中。在不同氮素水平下，一定浓度的酵母细胞耗尽培养液中的氮 素从而启动细胞自噬所用的时间会有所不同，据此可建立氮素水平与GFP-Atg8降解为分 离的GFP和Atg8时长之间的关系。
[0008] (2)所用菌株细胞的培养技术：酵母细胞在SD-Ura等培养基中培养至对数期 OD_~ 1. 0时，取约30mL培养液经离心、洗涤后转入不同氮素水平的培养基中，并开始记录 时间，对培养不同时长的细胞进行显微荧光拍照，根据所得结果建立氮素水平与GFP-Atg8 完全转入液泡的时长之间的关系模型；并根据土壤水萃液作为唯一氮源的培养基中酵母细 胞相应的时长，推算土壤内可利用氮素的量。
[0009] 本发明的有益效果是：一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的 检测方法，操作简单、成本低廉，可真实反映生物对土壤内可利用氮素的响应情况。
【附图说明】
[0010] 图1是在细胞转入相同氮素水平不同时长条件下GFP-Atg8分布情况的显微荧光 照片图。
[0011] 图2是不同氮素水平相同时长条件下GFP-Atg8转换为Atg8的western-blot示 意图。
【具体实施方式】
[0012] (l)Atg8蛋白的荧光标记：利用酿酒酵母基因库关于Atg8的基因信息，设计上下 游引物，对Atg8序列片段进行扩增；对扩增的产物和含GFP的载体进行酶切、纯化、连接等 分子生物学操作，然后整合至所用的酿酒酵母基因组。
[0013] (2) 土壤测试样品水萃液的获取：对所测试区域进行采样，经干燥、研磨、过筛等 步骤，取lg待测土样，与10mL去离子水在摇床上lOOrpm振荡24h得到土壤水萃液，然后高 速离心5min，取上清液，高温灭菌后备用。
[0014] (3)氮素水平与GFP-Atg8转化为Atg8时长之间关系模型的建立：将自噬相 关蛋白Atg8已被GFP荧光蛋白标记的酵母细胞在50mL液体SD-Ura培养基中培养至 0D600 ~ 1. 0时，取30mL培养液经离心、无菌水洗涤后，转入不同氮素水平的液体培养基 中，通过显微荧光观察确定GFP-Atg8完全运往液泡的时间。如附图1所示，在初始阶段， 由于氮素营养丰富，GFP-Atg8分布在细胞质中（如图1①所示），未有运往液泡的迹象；随 着氮素营养的消耗，GFP-Atg8有向液泡集中的趋势（如图1②所示）；在氮素营养完全耗 尽的条件下，酿酒酵母细胞启动细胞自噬，GFP-Atg8由细胞质运往液泡（如图1③所示）； 据此可以得到氮素水平和GFP-Atg8完全运往液泡时长之间的关系模型。同样，在不同氮 素水平相同时间条件下，GFP-Atg8与分离的GFP或Atg8间的比例也有所不同（如图2所 示），图2?所示为加样对照；细胞在不同氮素水平的培养基中培养一定时间后，取样进行 western-blot，可以得到氮素水平与GFP-Atg8分布状态的示意图（如图2):在氮素营养丰 富的条件下（图2⑥所对应的一列），主要是以GFP-Atg8 (如图2⑨所对应）的形式存在， 而在氮素营养完全缺失的条件下（图2⑧所对应的一列），则主要以分离的GFP或Atg8的 形式（如图2⑩所对应）存在，在其他氮素营养梯度下（如图2⑦所对应），则分离形式的 GFP或Atg8 (即进入液泡部分）呈现一定的变化规律；因而从显微焚光及western-blot的 结果来看，培养基的氮素水平与GFP-Atg8完全降解为分离的GFP和Atg8的时长之间存在 一定的关系t吴型。
[0015] (4)测算样品的可利用氮素含量：以步骤（2)所获取的土壤水萃液作为唯一氮源， 进行细胞的培养，培养条件完全同步骤（3)，根据显微荧光观察得到GFP-Atg8完全进入液 泡内的时长；然后根据步骤（3)所建立的关系模型，计算所测试土壤样品的可利用氮素含 量。
[0016] 以上已以较佳实施公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或 等效变换所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种基于At妍完全进入液泡时长的±壤内可利用氮素的检测方法，其特征在于： 建立可利用氮素水平与酵母菌株细胞中巧光标记At妍蛋白完全进入液泡的时长之间的关 系；收集Ig待测±壤，与lOmL去离子水在摇床上1(K)巧m振荡2化得到±壤水萃液，然后高 速罔屯、5min，取上清浓，局温灭园后备用；将自瞻相关蛋白At妍已被绿色夾光蛋白柄;记的 酵母细胞在50mL液体SD-Ura培养基中培养至ODe。。^ 1. 0时，取30mL培养液经离屯、、无菌 水洗漆后转入W无菌的上清液为唯一氮源的培养基中；分不同时间点，取样观察At妍是否 完全进入液泡，检测GFP-At妍完全转为At妍的时长；并根据所建立的关系推算±壤内可利 用氮素的量。
2. 根据权利要求1所述的一种基于At妍完全进入液泡时长的±壤内可利用氮素的 检测方法，其特征在于：所述的关系是可利用氮素水平与GFP-At妍进入液泡转化为分离的 GFP和At妍时长之间的关系。
3. 根据权利要求1所述的一种基于At妍完全进入液泡时长的±壤内可利用氮素的检 测方法，其特征在于；所述的检测方法是利用所测试±壤水萃液作为唯一氮源，进行细胞培 养，根据GFP-At妍完全进入液泡降解为分离的GFP和At妍的时长推算±壤内可利用氮素 的含量。
【专利摘要】本发明的一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法，是由酿酒酵母菌株细胞自噬相关蛋白Atg8的荧光标记、土壤水萃液的获取、酿酒酵母在营养丰富培养基和不同氮素量培养基的培养、模型的建立和土壤内可利用氮素的推算等步骤组成，其特征在于：一定浓度的酿酒酵母细胞耗尽培养基中的可利用氮素，从而启动细胞自噬，并将GFP标记的Atg8完全运往液泡进行降解的时长会因氮素量的不同而不同，据此可以建立标准模型和推算未知土壤内可利用氮素的量。该方法操作简单、成本低廉、可真实反映生物对土壤内可利用氮素的响应情况。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104535551
【申请号】CN201510010159
【发明人】刘玉涛, 朱奇, 尚帅楠, 丁为民
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月5日