评价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学效应的方法和花粉提取液及其制备方法

评价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学效应的方法和花粉提取液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种评价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学效应的方法和花粉提取液及其制备方法，评价方法包括：分别制备转基因和同一品种非转基因植物的花粉提取液；花粉提取液的制备包括：采集植物花粉，粉碎，加入提取缓冲液进行震荡提取，提取完成后离心，上清液即为花粉提取液；提取缓冲液由一定浓度的KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl和吐温20组成；向花粉提取液中加入蔗糖，制得饲喂液；采用饲喂液喂食蜜蜂，比较蜜蜂死亡率，判断转基因植物花粉对蜜蜂的毒性。本发明能够模拟蜜蜂在自然情况下取食转基因花粉的真实情况。
【专利说明】
评价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学效应的方法和花粉提取液 及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及转基因安全性评价，尤其涉及一种评价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学 效应的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米作为世界重要的粮食作物之一，在世界范围内广泛作为人类口粮及动物饲 料，但是病虫害严重影响玉米的产量和质量。通过转基因技术将抗虫、抗病等外源基因引入 到玉米基因组中，培育抗虫、抗病转基因水稻新品种，已成为防控玉米病虫害提高玉米产量 的新方法和新途径。随着转基因作物的大规模推广，人们越来越关注于它的安全性问题。由 于我国玉米生产和消费在全球的重要地位和影响，我国政府对于转基因玉米的商业化生产 持非常谨慎和认真的态度，既考虑到转基因玉米未来商业化带来的巨大经济利益和社会影 响，同时也对转基因玉米大规模环境释放和种植可能带来的潜在生物安全问题进行科学和 认真的评价。
[0003] 蜜蜂是环境毒理学研究中的重要模式生物，广泛用于各种化学品毒性安全评价。 蜜蜂广泛分布于自然界中，一般只以花粉与花蜜为食物。据统计，在人类常用的1300多种作 物中，有超过1000种依靠蜜蜂授粉，如果转基因玉米的花粉对蜜蜂产生毒害作用，就可能导 致当地蜜蜂种群的崩溃。蜜蜂位于自然界生物链的相对底层，是连接植物和动物的桥梁，如 果在这一环节出现断裂，在生物链上处于其前后的大批生物都要遭殃。最直观的例子，蜜蜂 种群的崩溃会影响到其他作物的开花结果，从而酿成广泛的粮食危机与生态危机。因此以 蜜蜂为研究对象开展转基因玉米的环境安全评价很有实际意义。
[0004] 目前国际上较为通用的关于转基因玉米的环境安全评价主要以含有相对应的单 一纯化蛋白的蔗糖溶液为主要食物对蜜蜂进行人工培养并开展毒理学评价，具体为以大肠 杆菌(E.coli)为载体表达外源蛋白，在实验室中经过纯化，按照需要的浓度配制蔗糖溶液 饲喂蜜蜂，并观察致死效应。这种方法可适用于只表达一个外源蛋白的转基因植物的安全 性评价;如果转基因植物中同时表达2个或者2个以上的外源蛋白，则只能用这个方法分别 评价每个外源蛋白对蜜蜂的影响。这种方忽略了蜜蜂取食花粉的实际情况与实际摄入量， 而涉及到双价或者多价转基因玉米的情况则更为复杂，因为两种蛋白的表达量可能存在很 大差别，甚至可能存在相互影响，那么分别以对应蛋白的蔗糖溶液来喂养蜜蜂就无法准确 地评价转基因玉米花粉对蜜蜂的真实影响。目前这种方法的评价结果无法代表蜜蜂取食转 基因植物花粉的真实影响，原因如下:第一，不同的外源蛋白之间可能存在相互作用，多个 单一外源蛋白各自对蜜蜂的毒理学评价结果不能代表蜜蜂同时取食多个外源蛋白时的实 际影响；第二，即使是同一基因，微生物表达的外源蛋白与转基因植物中表达的外源蛋白可 能存在结构和生物学方面的差异;第三，转基因植物中同时表达的多个外源蛋白的表达量 之间存在较大差异，目前的评价方法无法模拟蜜蜂取食不同表达量的外源蛋白时受到的实 际影响。根据我们的测定，以C0030.3.5双价转基因玉米为例，BT与EPSPS两种蛋白的浓度差 别很大，用相同浓度分别饲喂并得出毒理学评价结果并不科学，而且也不能真实反映两种 蛋白被蜜蜂同时取食时可能存在的交互作用。第四，外源基因的表达不仅仅会产生外源蛋 白，还可能导致转基因植物产生一些非预期的性状变化，如花粉中其他某些化学物质含量 的变化，这些非预期效应是无法仅仅通过饲喂不同的转基因蛋白所能够评价的。
[0005] 为了更准确地评价转基因玉米对蜜蜂的毒理学效应，迫切需要一种可以最大限度 模拟蜜蜂在自然界取食花粉的真实情况的毒理学评价方法。

【发明内容】

[0006] 发明目的:针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于通过用破碎、溶剂提取 转基因植物花粉后制备蔗糖溶液并饲喂蜜蜂，不仅可以同时评价转基因植物花粉中所有外 源蛋白对蜜蜂的综合影响，而且可以评价转基因植物花粉可能产生的非预期变化对蜜蜂的 影响，更好地模拟蜜蜂在自然情况下取食转基因植物花粉的真实情况，解决当前技术方法 中存在的不能真实反映蜜蜂受到转基因植物花粉影响的问题。
[0007] 技术方案:一种评价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学效应的方法，包括：
[0008] (1)分别制备转基因植物和同一品种非转基因植物的花粉提取液；
[0009]所述花粉提取液的制备方法包括:米集植物的花粉，将花粉粉碎，加入提取缓冲液 进行研磨至95%以上花粉破壁后震荡提取，提取完成后离心，上清液即为所述的花粉提取 液；所述的提取缓冲液的组成为：0.0018~0.0022mol · L-^IfePOhO.Ol~0.012mol · L- 1恥2册04、0.12~0.14111〇1.厂1恥(：1、0.002~0.003111〇1.厂 11((：1、0.03~0.06%吐温20;所述 的提取缓冲液以水为溶剂；
[0010] (2)向花粉提取液中加入蔗糖，制得饲喂液；
[0011] (3)采用所述的饲喂液喂食蜜蜂，比较转基因组和非转基因组蜜蜂的死亡率，判断 转基因植物花粉对蜜蜂的毒性。
[0012] 所述植物为玉米。
[0013] 所述的转基因植物转入有多个外源基因，具体的可以有两个外源基因。
[0014] 花粉粉碎采用液氮研磨的方法，液氮研磨的时间为30~45min，以尽可能的破坏花 粉壁，释放花粉中物质。
[0015] 优选的，所述提取缓冲液的配方为：0.002mol · L-kftiPOhO.Olmol · L-^12册〇4、 0.137mol · L-iNaCl'O.OOSTmol · L-^CUO.OS^WAOTweer^O^H 7·4〇
[0016] 所述提取的温度为4~8°C，时间为0.5~2h，优选的，所述提取的温度为4°C，时间 为lh，可以充分提取花粉中物质，并保持物质活性。
[0017] 所述的花粉与提取缓冲液的质量体积比(g/ml)为0.3~4:3。
[0018] 饲喂液中，所述蔗糖的质量分数为60%。
[0019] 所述蜜蜂为意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica Spin.)。
[0020] 实验时，所述蜜蜂的饲养条件为：饲养温度为25±2°C，湿度为50-70%，光照与黑 暗时间比为12h:12h。采用所述的饲喂液喂食蜜蜂前，对蜜蜂进行饥饿处理2h。
[0021] 本发明还提供了一种花粉提取液的制备方法，包括:采集植物的花粉，将花粉粉 碎，加入提取缓冲液进行研磨至95 %以上花粉破壁后震荡提取，提取完成后离心，上清液即 为所述的花粉提取液;所述的提取缓冲液的组成为:〇.〇lmol · L-· L-SaCl、 0.0027mol · L_1KCUO.05% (V/V)Tween20,pH 7.4〇
[0022] 本发明还提供了一种所述制备方法制备得到的花粉提取液。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0024]本发明通过机械磨碎转基因玉米花粉并提取配制蔗糖溶液来喂养蜜蜂，较为真实 地模拟蜜蜂在自然情况下取食转基因玉米花粉的情况，首先，本发明用到的材料是真实的 转基因玉米花粉，而并非现有方法中常用的通过大肠杆菌表达并经过纯化的目的蛋白；其 次，本发明真实反映了多种目的蛋白在多价转基因玉米花粉中表达浓度的比例及可能存在 的相互影响，避免了分别用纯化蛋白配制蔗糖溶液饲喂蜜蜂而带来背离真实情况的问题； 再次，本方法还可以评价转基因玉米可能出现的非预期效应对蜜蜂的影响；另外，用微生物 表达多个外源蛋白并纯化，之后再分别进行毒理学评价，其步骤繁琐，耗时费力，经济成本 很高，而本方法则简单易行，大幅度降低了时间和经济成本。
[0025] 本发明在花粉提取液的制备过程中，对制备条件进行控制特别是通过选择特定的 提取缓冲液，对玉米花粉中主要营养物质的提取效率与常规方法的提取效率无显著差异， 因此以该提取方法得到的花粉提取液为基础的后续评价方法具有较高的可行性和可靠性。
[0026] 由于花粉之间相互粘连，直接用花粉喂食蜜蜂会存在取食量不可控的问题，难以 进行实验研究，而本发明采用花粉提取液，蜜蜂取食方便，取食量统计简单易行，且本发明 花粉提取液制备方法简单，可靠，保证提取物的活性。
【附图说明】
[0027]图1为不同处理组意大利蜜蜂存活率。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0029] 实施例1
[0030] 测试物质为抗虫抗除草剂转基因玉米C0030.3.5花粉及非转基因对照DBN318玉米 花粉。其中，转基因玉米C0030.3.5转入的基因为cry lAb和epsps，转入的目标性状为抗虫、 抗除草剂，上述材料均由大北农科技集团股份有限公司生物技术中心提供。
[0031] 实施例1花粉提取液的制备
[0032] 精确称取玉米花粉0.3g，放入研钵中，缓慢加入液氮研磨30分钟以上，随后加入 3mL提取缓冲液（0.002mol · L-l^POhO.Olmol · 137mol · L-WaCl、 0.0027111〇1.1/11((：1、0.05%(￥八)了￥661120，？!17.4，水为溶剂)继续研磨至电子显微镜镜检 确认95%以上花粉成功破壁;然后转移至5mL离心管中，4°C，200rpm摇床孵育lh，4°C条件下 12000rpm离心1 Omin，取上清液，即为花粉提取液。
[0033] 用对应的试剂盒（EnvirologixQualiplate Kit for CrylAb/CrylAc，Part# 10433，EnvirologixQualiPlate Kit for CP4EPSPS Corn&Cotton，Part#10448)分别测定 玉米花粉中的CrylAb蛋白和EPSPS蛋白的含量。经测定，本次研究所使用的转基因玉米 C0030.3.5花粉中Bt蛋白含量为24. lng/g，EPSPS蛋白为118.8yg/g，非转基因玉米 DBN318Cry lAb与EPSPS蛋白含量均低于试剂盒检测极限。
[0034]我们以C0030.3.5和DBN318为材料，用常规超声方法提取测定(蛋白质采用凯式定 氮法，总糖测定采用高锰酸钾滴定法，其余各种氨基酸和维生素的测定采用高效液相色谱 法)花粉中的主要营养物质，并用本方法作为比较，测定了花粉提取液中的主要营养物质， 结果归纳为下表：
[0035]

[0037]
[0038] 结果说明，本提取方法对玉米花粉中主要营养物质的提取效率与常规方法的提取 效率无显著差异，因此以本提取方法为基础的后续评价方法具有较高的可行性和可靠性。
[0039] 实施例2
[0040] 评价双价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学效应的方法包括以下步骤：
[0041 ]参照实施例1花粉提取的制备方法，分别称取4g C0030.3.5和DBN318玉米花粉，放 入研钵中，缓慢加入液氮研磨35分钟，然后用3mL实施例1配方的提取缓冲液研磨至电子显 微镜镜检确认95%以上花粉成功破壁;然后转移至5mL离心管中，4°C，200rpm摇床孵育lh，4 °C条件下12000rpm离心10min，取上清液，超滤离心，最后定容至lmL，以此液配制鹿糖溶液， 蔗糖的质量分数为60%，Bt蛋白浓度约96.4ng/mL，EPSPS蛋白浓度约为475.2yg/mL。此浓度 约为蜜蜂正常暴露量的10-40倍。
[0042]计算依据：蜜蜂每头每天平均取食花粉约6.5mg或取食蔗糖溶液约20-90mg (Crailsheim et al.，1992;Rortais et al. ,2005)。以仅取食花粉计算，24.1ng/gX6.5mg =0.15665ng，即正常取食花粉时，每日摄取Bt毒蛋白大概0.16ng，以此作为每日的标准暴 露量。如果取食蔗糖溶液，每日20-90mg，按照60 %蔗糖溶液1.3g/mL的密度(实测)计算，最 低取食量（鹿糖溶液体积）为20mg/(l .3g/mL) =0.0154mL，0.0154mLX96ng/mL= 1.48ng。 1.48ng/0.15665ng = 9.45，即实验蜜蜂取食配制的鹿糖溶液时，按照最低取食量来计算，Bt 蛋白的暴露量约为标准暴露量的9.45倍。这个是假设每日只取食20mg蔗糖溶液计算的，如 果是按照90mg取食量，则暴露量约为标准暴露量的9.45 X (90/20) = 4.5 X 9.45 = 42.5倍。 EPSPS蛋白的暴露量计算与Bt蛋白类似，并不影响暴露剂量倍数的变化，不再另行计算。 [0043] 取120只意大利蜜蜂随机分配到蜂笼中，随机分配到12只蜂笼中，每只蜂笼10只意 大利蜜蜂在实验条件下饲养一直到实验开始，使其适应本实验的条件。随后对蜜蜂进行饥 饿处理2h，以保证在实验开始时蜜蜂腹中食物含量基本相同。实验开始时，将120只预培养 的意大利蜜蜂分为4组，即每组30只意大利蜜蜂，分别饲喂1.5mL的上述三种蔗糖溶液(蔗糖 溶液组:蔗糖质量分数为60 %，水为溶剂，空白对照组(CK); DBN318玉米花粉组;C0030.3.5 玉米花粉组;含有6.67mg/L三唑磷乳油的60%蔗糖(w/v)溶液，阳性对照组），每天饲喂2次， 每次0.75mL，每天观察记录各组蜜蜂的存活情况，在饲喂实验开始后24h、48h、72h记录死亡 率，并及时清理掉实验过程中死亡的蜜蜂个体。
[0044] 实验在饲养温度为25 ± 2 °C，湿度50-70 %的培养箱中进行，光照与黑暗时间比为 12h:12h〇
[0045]统计方法
[0046]使用SPSS17.0软件中的AN0VA程序对各组意大利蜜蜂的存活率指标进行显著性差 异分析(α = 0·05)。
[0047] 图1显示的是不同饲喂处理条件下各组意大利蜜蜂的存活情况。由图1可知，本实 验中作为阳性对照的三唑磷乳油组意大利蜜蜂在24h内平均死亡率达到68.75%，在48h内 全部死亡，而空白对照组意大利蜜蜂在24h内没有死亡现象，表明本实验的测试系统既能够 保证意大利蜜蜂的正常生长，也可以测定出有毒物质对意大利蜂的急性毒杀效应，说明本 实验的测试系统是可信的。在这种情况下，DBN318花粉处理组和C0030.3.5花粉处理组意大 利蜜蜂在24h、48h和72h的死亡率之间都没有显著性差异，它们与无花粉的空白对照组意大 利蜂在死亡率方面也没有显著性差异，这说明高剂量的转Bt+EPSPS基因抗虫抗除草剂玉米 花粉对意大利蜂没有急性毒杀效应。同时，根据实验期间的观察，各实验组意大利蜂个体在 活动能力和振翅音方面也未见显著差异。因此，本试验结果说明，转Bt+EPSPS基因抗虫抗除 草剂玉米花粉对意大利蜂没有急性毒性效应。说明抗虫抗除草剂转基因玉米C0030.3.5花 粉对意大利蜜蜂生长没有显著影响。
[0048] 结论:通过对以上有效、可靠的试验，经过对所得数据分析，得出结论:取食10倍日 摄食量的抗虫抗除草剂转基因玉米C0030.3.5玉米花粉没有引起意大利蜜蜂在生长方面的 不良反应，表明C0030.3.5转基因玉米对非靶标生物意大利蜜蜂没有显著的不利影响。
【主权项】
1. 一种评价转基因植物花粉对蜜蜂毒理学效应的方法，其特征在于，包括： (1) 分别制备转基因植物和同一品种非转基因植物的花粉提取液； 所述花粉提取液的制备方法包括:米集植物的花粉，将花粉粉碎，加入提取缓冲液进行 研磨至95%以上花粉破壁后震荡提取，提取完成后离心，上清液即为所述的花粉提取液;所 述的提取缓冲液的组成为：0.0018~0.0022mol · L-kifePOhO.Ol~0.012mol · L- 0.12~0.14111〇1*1/1似(：1、0.002~0.003111〇1*1/11((：1、0.03~0.06%吐温20 ;所述的提取缓 冲液以水为溶剂； (2) 向花粉提取液中加入蔗糖，制得饲喂液； (3) 采用所述的饲喂液喂食蜜蜂，比较转基因组和非转基因组蜜蜂的死亡率，判断转基 因植物花粉对蜜蜂的毒性。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，植物为玉米。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转基因植物转入有两个外源基因。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，花粉粉碎采用液氮研磨的方法，液氮研磨 的时间为30~45min。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取的温度为4~8°C，时间为0.5~ 2h〇6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的花粉与提取缓冲液的质量体积比为 0.3 ~4:3〇7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，饲喂液中，所述蔗糖的质量分数为60 %。8. -种花粉提取液的制备方法，其特征在于，包括:采集植物的花粉，将花粉粉碎，加入 提取缓冲液进行研磨至95%以上花粉破壁后震荡提取，提取完成后离心，上清液即为所述 的花粉提取液；所述的提取缓冲液的组成为：〇.〇lmol · · LlaCl、 0.0027mol · L_1KCU0.05% (V/V)Tween20,pH 7.4〇9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述提取的温度为4~8°C，时间为0.5 ~2h〇10. 根据权利要求8或9制备方法制备得到的花粉提取液。
【文档编号】G01N1/28GK105866352SQ201610402633
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】刘标, 郭汝清, 方志翔
【申请人】环境保护部南京环境科学研究所