Ck-mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用
【专利摘要】本发明涉及医学检测试剂，特别是CK?MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用。用于CK?MB校准品的稀释液，是在缓冲液中加入终浓度为0.01?0.12g/ml的玉米蛋白、终浓度0.5?4mM的谷胱甘肽、终浓度3?20％V/V的胎牛血清和终浓度3?20mM的EDTA配制而得。所述稀释液最大程度地提高了CK?MB校准品的稳定性，解决了目前存在的CK?MB校准品不稳定的问题，提高临床CK检测的准确性，为临床相关疾病的诊断提供更准确的依据。
【专利说明】
CK-MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及医学检测试剂，特别是CK-MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应 用。 技术背景
[0002] 肌酸激酶(creatine kinase，CK)以二聚体的形式存在，在收缩组织高能磷酸键的 产生和应用上具有重要作用。而且，在细胞浆内，线粒体产生的ATP通过磷酸肌酸传递到使 用部位，肌酸激酶起到"穿梭运输"的作用。"穿梭假想"在一些组织得到证实，在肾脏远曲小 管，尽管它并不收缩，但是需要大量ATP供给钠钾栗维持离子梯度。CK催化的化学反应为:肌 酸(Creatine) +ATP在CK催化下生成磷酸肌酸(creatine phosphate，CP)和ADP。线粒体产生 的ATP存储在CP中，经过转用到使用部位。
[0003] CK的分子量较大(>80kd)，不能通过肾脏排泄，一些研究表明CK是由网状内皮系统 清除，如肝脏的网状内皮系统。总CK的升高可见于试验室分析的干扰、坏死组织的释放，总 CK是骨骼肌、心肌损伤的非常敏感的指标，常见于各种骨骼肌损伤，一些临床药物如镇静 药、抗抑郁药物可引起CK增高，蜜蜂叮咬等也可引起升高。杜氏肌营养不良患者早期轻度升 高，在成人神经肌肉疾病也会升高。此时，心脏肌钙蛋白可作为不同来源损伤的鉴别指标。 临床CK检查通过酶法检测，即检测CK催化磷酸肌酸转化的活性。
[0004] CK的同工酶，有四个基因编码CK亚基，Μ亚单位（19号染色体），B亚单位（14号染色 体），另外2个线粒体亚单位。还有第5个B亚单位的假基因（16号染色体）J和B亚单位结合形 成三个同工酶0(-丽、0(-88、0(-1?，分子量在86-891〇1。尽管0(活性需要二聚体存在，各亚单 位也存在催化活性。在不同组织，3种同工酶的分布是不一样的，骨骼肌组织（99%MM，1 % 冊），心脏组织（77%丽，22%1?，1%88)，脑组织（100%88)，肠道、胃、膀胱等（0-6%丽、1?， 92-96%BB)。由此可见，在不同的组织损伤产生的同工酶是不一样的。CK-MB同工酶问世后， 一度成为AMI(Acute Myocardial Infarction，急性心肌梗死)诊断的"金指标"。同时，在血 清中还存在CK的同工酶变异体，"巨大CK"1型、2型，尽管日常不检测它们，但是它们会影响 CK-MB的检测，包括免疫抑制法和电泳法。
[0005] 最早的检测CK-MB的方法是柱层析和电泳的方法，通过分离得到CK不同同工酶的 条带。免疫抑制的方法最早开发于1975年，目前在全球广泛的使用。它是将Μ亚基的多克隆 抗体抑制Μ亚基后，用传统的总CK方法检测剩余亚基的活性，由于ΒΒ亚基相对量少，可以忽 略不计，CK-MM被完全抑制，CK-MB测定值为实际活性的一半，测定值乘以2就得到CK-MB的 值。免疫抑制法的优点在于成本较低同时可以在生化分析仪上大量检测。缺点在于不特异， 如果ΒΒ亚型增高会对结果产生较大影响，巨大CK也会对结果产生较大影响，甚至造成CK-MB 超出总CK活性的情况。另外腺苷激酶(Adenylate kinase，ΑΚ)也会影响检测，ΑΚ在红细胞中 含量较大，在溶血的标本，检测时ΑΚ会影响CK-MB的值。
[0006] 由于CK-MB免疫抑制法的非特异性，临床常用它进行筛选，对于升高患者需要用其 他方法来验证，在总CK〈100U/L时，可以不用检测CK-MB，因为往往它们是正常的。这也适应 于急性心肌梗早期，酶水平还没有升高的时候。同时通过CK指数(CK同工酶活性/总CK)可以 间接判断CK来源，如CK-MB超出上限，而CK-MB/总CK〈4%，往往是由于骨骼肌释放出来的可 能性比较大；如CK-MB/总CK>25%，要考虑到CK-BB和巨大CK( 1型和2型）的存在，因为AMI患 者很少超出这个范围，如果在4%_25%，应该连续监测样本活性，诊断AMI的准确性>90%。
[0007]自从1960年以来，CK-MB成为AMI的金标准，不同的检测方法应用于临床，包括层析 法、电泳法、免疫抑制法。然而，为了提高反应的特异性，缩短检测时间，开发出质量法(CK-MBmass)，单位ug/L，最高灵敏度为lng/ml，比CK-MB特异，最小检测时间为7分钟。它使用双 位点免疫分析技术，用抗Μ亚单位抗体、抗B亚单位抗体、抗MB特异性抗体检测抗原。它检测 是抗原的量而不是活性，所以和CK总活性及CK-MB活性不同，不会受酶活力衰减的影响。 [0008] CK-MB的临床运用在于ACS(Acute Coronary Syndromes，急性冠状动脉综合征）的 判断，总CK斜率结合CK-MB浓度可以在4h准确判断AMI; CK-MB在入院8h (胸痛12-16h)的浓度 是最为有效的检测之一，计算变化的斜率更有价值。CK-MB质量法可以在一定的时间内增加 AMI的诊断率，并快速筛选出需要再通治疗的患者，结合肌钙蛋白可以提高敏感性。并且，在 经静脉溶栓、介入治疗后再通时，CK-MB质量法时间曲线达峰时间提前，可以作为再灌注的 指标。
[0009] CK-MB质量可作为预后和危险度分层的指标，5%-20%的不稳定型心绞痛患者在 第一年进展为AMI或死亡。尸检显示患者存在频繁的小梗死。CK-MB质量法能敏感的检测小 的梗死并对患者的预后具有重要价值。对于儿科患者CK-MB的检测意义不大，因为从出生后 CK同工酶谱的改变，从CK-BB到CK-MB到CK-MM变化。
[0010] 由于CK-MB是二聚体的形态存在的，极其不稳定，大多数公司试剂盒的校准品均是 以冻干品的形式保存的，在临床应用的过程中，带来很多的不便。因此探索一种稳定的CK-MB校准品在临床中有很大的意义。
【发明内容】
[0011] 本发明根据上述领域存在的需求和空白，提供稳定性高的CK-MB校准品稀释液，可 用于CK-MB校准品的配制。以下概括本发明要求保护的技术方案：
[0012] 用于CK-MBfe准品的稀释液，其特征在于，是在缓冲液中加入终浓度为0.0 ΙΟ. 12g/ml 的玉米蛋白、 终浓度 0.5_4mM 的谷胱甘肽、 终浓度 3_20 % V/V 的胎牛血清和终浓度 3-20mM的EDTA配制而得，
[0013] 所述缓冲液指以下任意一种：
[0014] 1001111溶液中包含磷酸二氢钠0.06248、磷酸氢二钠0.7168、氯化钠0.88，？!1值7.4 的磷酸缓冲液；
[0015] 100ml溶液中包含Tr i S碱1.21 g，pH值8.0的Tr i S缓冲液；
[0016] 100ml溶液中包含柠檬酸1.92g的柠檬酸缓冲液。
[0017]优选地，所述玉米蛋白的终浓度为0.025-0. lg/ml。
[0018] 优选地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽，其终浓度为l-3mM mM。
[0019] 优选地，所述胎牛血清的终浓度为5_15%V/V。
[0020] 优选地，所述EDTA的终浓度为5-15mM。
[0021] -种肌酸激酶体外检测试剂盒，其特征在于，包含CK-MB校准品以及权利要求1-5 任一所述的CK-MB校准品稀释液。
[0022]本发明提供一种CK-MB校准品稀释液，能够显著提高CK-MB校准品的稳定性，从而 提高临床检测CK活性的准确性，有利于相关疾病的准确诊断。是在缓冲液中加入玉米蛋白、 谷胱甘肽、胎牛血清、EDTA配制而得。
[0023]其中，玉米蛋白粉也称玉米麸质粉，主要由玉米蛋白组成，含有少量的淀粉和纤 维。由于玉米蛋白氨基酸组成独特，其支链氨基酸和中性氨基酸含量相当高，系植物蛋白中 少有。在一些实施例中，添加玉米蛋白优选终浓度为0.01-0.12g/ml，进一步优选0.025-0. lg/ml，稳定性会明显提高。在另一些实施例中，玉米蛋白在稀释液中的浓度0.05g/ml时， 能够最大程度地提高CK-MB校准品的稳定性。
[0024]谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱 氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞，谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统 的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。加入终浓度〇. 5-4mM谷胱甘肽可以防止缓冲液 中成分的氧化作用，提高其稳定性，防止跳管现象的产生。在一些实施例中，还原型谷胱甘 肽在稀释液中的浓度为〇.5-3mM。在另一些实施例中，还原型谷胱甘肽的浓度为ImM时，CK-MB校准品的稳定性最高。
[0025]血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，含有各种血浆蛋白、 多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，为蛋白提供一种稳定的微环境。加入3-20%V/V胎牛血清的基质液，可以避免基质效应，同时也可以降低本底的发光值，从而间接 起到增加稳定性的作用。在一些实施例中，胎牛血清在稀释液中的浓度为5-15%。在另一些 实施例中，稀释液中加入10 %的胎牛血清能够最大程度地提高CK-MB校准品的稳定性。 [0026] EDTA是一种优良的钙、镁离子螯合剂，用作乳液聚合所用水的螯合剂，除去Ca2+、 Mg2+、Fe2+、Fe3+等金属离子。加入终浓度3-20mM的EDTA后，可以避免其他金属离子对蛋白 的干扰，从而增加了蛋白的稳定性。在一些实施例中，EDTA在稀释液中的浓度为5-15mM。在 另一些实施例中，EDTA的浓度为10mM时，CK-MB校准品的稳定性最高。
[0027]采用这些实施例所提供的稀释液配制的CK-MB校准品制作标准曲线，相关系数r = 0.96以上，校准品在0-300ng/ml之间线性良好。
[0028]在本发明的优选实施例中，所述玉米蛋白的浓度为每100ml稀释液中含有5g的玉 米蛋白；所述谷胱甘肽的浓度为ImM;所述胎牛血清的浓度为10 % V/V;所述EDTA的浓度为 1 OmM;采用所述稀释液配制的校准品制作标准曲线，相关系数r = 0.99，校准品在0-300ng/ ml之间线性良好。
[0029]综上所述，本发明CK-MB校准品稀释液中的玉米蛋白有很强的蛋白保护作用，还原 型谷胱甘肽有抗氧化的作用，胎牛血清能够提供一个稳定的微环境，EDTA可以螯合缓冲液 中的金属离子，从而最大程度地提高了CK-MB校准品的稳定性，解决了目前存在的CK-MB校 准品不稳定的问题，提高临床CK检测的准确性，为临床相关疾病的诊断提供更准确的依据。
【附图说明】
[0030] 图1各缓冲体系下校准品的稳定性比较；
[0031] 其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第 二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
[0032] 图2不同保护剂对校准品稳定性的影响；
[0033] 其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第 二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
[0034]图3不同浓度EDTA对校准品稳定性的影响；
[0035] 其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第 二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
[0036] 图4不同浓度玉米蛋白对校准品稳定性影响；
[0037] 其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第 二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
[0038] 图5不同浓度胎牛血清对校准品稳定性影响；
[0039] 其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第 二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
[0040] 图6不同浓度还原型谷胱甘肽对校准品稳定性的影响；
[0041] 其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第 二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
[0042] 图7采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线；
[0043]图8临床样本测定结果；
[0044]其中纵坐标是本发明实施例4所述检测方法测定结果，横坐标是贝克曼CK-MB试剂 盒测定结果。
【具体实施方式】
[0045]以下通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要声明的是，下述实施例仅作为 解释和说明，不以任何形式限制本发明的保护范围。
[0046]本实施例所用到的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配 制或商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0047] 实施例1. CK-MB校准品稀释液的pH值选择
[0048] 1、不同缓冲体系的CK-MB校准品稀释液的配制
[0049] (1) 100mlCK-MB 校准品缓冲液(PBS)
[0050]称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.292 8、还原型谷胱甘肽（3丨811^，64251)0.06148、胎牛血清（3丨811^，312003〇)1)101111、玉米 蛋白（国药，XW901066) 5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0051 ] (2) 100ml CK-MB 校准品缓冲液(Tr i s)
[0052]称取 Tris 碱(Amresco，ZA082601)1.21g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷 胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01) 10ml、玉米蛋白（国药， XW901066) 5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值8.0，定容至100ml。
[0053] (3) 100ml CK-MB校准品缓冲液(柠檬酸）
[0054]称取柠檬酸（国药，10007192)1.92g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱 甘肽（318111&，64251)0.06148、胎牛血清（3181]1&，312003〇01)101111、玉米蛋白（国药， XW901066) 5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值6.0，定容至100ml。
[0055] 2、CK-MB校准品的稳定性试验
[0056] 用步骤1配制的三种稀释液分别制备300ng/ml的CK_MB(usbiological，货号# C7910-0 ID)抗原溶液，分别于37 °C恒温培养箱中放置9天、7天、5天、3天、2天和1天，以2-8 °C 条件做对照，进行下列试验：
[0057] (1)包被:配制lyg/mL CK-MB抗体(Medix，货号#7501)10mM 1?溶液，加入微孔发光 板中，1〇〇μL7孔，4°C孵育21h;
[0058] (2)封闭：将微孔板中包被液甩干，加入5%BSA 10mM 1?溶液，200yL/孔，4°C孵育 21h；
[0059] (3)加样:将微孔板中封闭液甩干，加入待测样本，50yL/孔，37 °C孵育30min;
[0060] (4)酶标抗体:将微孔板用洗涤液(含有 0.05%(V/V)Tween-20(sigma，44112W9 10mM PBS溶液)洗涤5次并甩干，加入50yL/孔HRP标记的CK-MB抗体(Medix，7502)，37°C孵育 15min；
[00611 (5)底物:将微孔板用洗涤液洗涤5次并甩干，加入底物4和底物8(111從1110,34080)， 各50μLν孔，避光反应5min，测定发光值(厦门天众达ECLIA-π S型化学发光免疫分析仪），发 光强度以相对光单位(RLU)表示。
[0062] 3、CK_MB校准品在不同pH值条件下的稳定性分析
[0063] 本试验配制了不同缓冲体系，由此对PH6.0~8.0条件下CK-MB项目的稳定性进行 研究。用PH6.0的柠檬酸弱酸体系、pH7.4的磷酸盐弱碱体系、pH8.0的Tris碱性体系这三种 缓冲液配制校准品，分别放在37°C恒温培养箱中，进行稳定性试验。如表1_3，P点为300ng/ ml校准品，N点为校准品缓冲液。验证在不同缓冲体系之下P点相对光单位(RLU)变化，变化 越小表明校准品越稳定。结果表明，在PH7.4的弱碱条件下，P点降幅最低，在15%以下，校准 品稳定性较高。（见表1-3)。
[0064]表1磷酸盐缓冲液
[0065]
[0066] 表2Tris碱缓冲液
[0067]
[0068]表3柠檬酸缓冲液
[0069]
[0070] 实施例2. CK-MB校准品稀释液的保护剂选择
[0071] 1、含有不同保护剂的CK-MB校准品稀释液的配制 [0072] (l)lOOml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为玉米蛋白）
[0073]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白（国 药，XW901066) 5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0074] (2)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为BSA)
[0075]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（3丨 811^，64251)0.06148、胎牛血清（5丨81^，512003〇)1)101111、854(1?〇(^6， RD1073832)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0076] (3) 100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为casein)
[0077]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01) 10ml、Casein (Sigam，SC589003)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0078] (4) 100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为商品化蛋白保护剂）
[0079]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（3丨8111 &，64251)0.06148、胎牛血清（3丨8111&，312003〇)1)101111、蛋白保护剂 (国药，10758)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0080] 2、CK-MB校准品的稳定性试验
[0081]用步骤1配制的四种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB抗原溶液，分别于37°C恒温 培养箱中放置9天、7天、5天、3天2天、和1天，以2-8 °C条件做对照，测试方法同实施例1。 [0082] 3、CK_MB校准品在不同保护剂下的稳定性分析
[0083] 本试验在pH7.4条件下采用了不同的蛋白保护剂，5 %玉米蛋白，5 % BSA，5 % Casein，5%的蛋白保护剂分别配制成校准品稀释液，用这四种校准品稀释液配制校准品， 进行稳定性试验。如表4_7，P点为300ng/ml校准品，N点为校准品稀释液。P点相对光单位 (RLU)变化，变化越小表明校准品越稳定。结果表明，添加5 %玉米蛋白的校准品缓冲液的P 点降幅最低，稳定性最好(见表4-7)。
[0084]表4 5%玉米蛋白对校准品稳定性的影响
[0085]
[0086] 表5 5%BSA对校准品稳定性的影响
[0087]
[0088] 表6 5%Casein对校准品稳定性的影响
[0089]
[0090] 表7 5%蛋白稳保护剂对校准品稳定性的影响
[0091]
[0092] 实施例3. CK-MB校准品稀释液中各成分最适浓度的筛选
[0093] 1、含不同浓度EDTA的CK-MB校准品稀释液的配制 [0094] (l)100ml CK-MB校准品缓冲液(未加EDTA)
[0095]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251) 0.0614g、胎牛血清（51 811^，512003〇)1)101111、玉米蛋白（国药，父￥901066)58。加入601111超纯 水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0096] (2) 100ml CK-MB校准品缓冲液（5禮 EDTA)
[0097] 称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.146g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白（国 药，乂1901066)5 8。加入601111超纯水中，完全溶解后，调节?!1值7.4，定容至1001111。
[0098] 〇3) 100ml CK-MB校准品缓冲液（10mM EDTA)
[0099]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白（国 药，乂1901066)5 8。加入601111超纯水中，完全溶解后，调节?!1值7.4，定容至1001111。
[0100] (4)100ml CK-MB校准品缓冲液（ΙδπιΜ EDTA)
[0101]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.438g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白（国 药，乂1901066)5 8。加入601111超纯水中，完全溶解后，调节?!1值7.4，定容至1001111。
[0102 ] 2、含不同浓度玉米蛋白的CK-MB校准品稀释液的配制 [0103] (1) 100mlCK-MB校准品缓冲液(未加玉米蛋白）
[0104]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（3丨8!^，64251)0.06148、胎牛血清（3丨811^，312003〇)1)101111。加入601111超纯 水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0105] (2)10〇11110(-1?校准品缓冲液(2.5%玉米蛋白）
[0106]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白（国 药，XW901066) 2.5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0107] (3) 100mlCK-MB校准品缓冲液(5 %玉米蛋白）
[0108]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白（国 药，XW901066) 5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0109] (4) 100ml CK-MB校准品缓冲液（10 %玉米蛋白）
[0110]称取磷酸二氢钠(NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠(Na2HP〇4(国药， 100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、 还原型谷胱甘肽（Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清（Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白（国 药，XW901066) 10g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0111] 3、含不同浓度胎牛血清的CK-MB校准品稀释液的配制
[0112] (l)lOOml CK-MB校准品缓冲液(未加胎牛血清）
[0113] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.292g、还原型谷胱甘肽（3丨 811^，64251)0.06148、玉米蛋白（国药，乂￥901066)58。加入601111 超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0114] (2) 100ml CK-MB校准品缓冲液(5%胎牛血清）
[0115] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.2928、还原型谷胱甘肽（3丨811^，64251)0.06148、胎牛血清（3丨811^，3120030)1)51111、玉米蛋 白（国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0116] (3) 100ml CK-MB校准品缓冲液（10%胎牛血清）
[0117] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.292 8、还原型谷胱甘肽（3丨811^，64251)0.06148、胎牛血清（3丨811^，312003〇)1)101111、玉米 蛋白（国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0118] (4) 100ml CK-MB校准品缓冲液（15%胎牛血清）
[0119] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.292 8、还原型谷胱甘肽（（3丨811^，64251)0.06148、胎牛血清（3丨811^，3120030)1)151111、玉米 蛋白（国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0120] 4、含不同浓度还原型谷胱甘肽的CK-MB校准品稀释液的配制
[0121] (l)lOOml CK-MB校准品缓冲液(未加还原型谷胱甘肽）
[0122] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.292g、胎牛血清（5丨 811^，512003〇)1)101111、玉米蛋白（国药，乂冊01066)58。加入601111超纯水 中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0123] (2) 100mlCK-MB校准品缓冲液（ImM还原型谷胱甘肽）
[0124] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.2928、还原型谷胱甘肽（3丨 811^，64251)0.03078、胎牛血清（3丨811^，312003〇)1)101111、玉米 蛋白（国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0125] (3) 100ml CK-MB校准品缓冲液(2mM还原型谷胱甘肽）
[0126] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0 · 0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.292 8、还原型谷胱甘肽（3丨811^，64251)0.06148、胎牛血清（3丨811^，312003〇)1)101111、玉米 蛋白（国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0127] (4) 100ml CK-MB校准品缓冲液(3mM还原型谷胱甘肽）
[0128] 称取磷酸二氢钠（NaH2P〇4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠（Na2HP〇4)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.292 8、还原型谷胱甘肽（3丨811^，64251)0.09218、胎牛血清（3丨811^，312003〇)1)101111、玉米 蛋白（国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0129] 5、CK-MB校准品的稳定性试验
[0130]用步骤1-4配制的16种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB抗原溶液，分别于37°C恒 温培养箱中放置9天、7天、5天、3天2天、和1天，以2-8°C条件做对照进行测试，测试方法同实 施例1。
[0131 ] 6、不同浓度的稀释液成分对CK-MB校准品稳定性的影响
[0132] (1)通过比较不同浓度EDTA (OmM、5mM、1 OmM、15mM)条件下校准品的稳定性，结果表 明，在校准品缓冲液中加入lOmM EDTA，校准品的稳定性最好(见表8)。
[0133] 表8 EDTA浓度筛选
[0134]
[0135] (2)通过比较不同浓度玉米蛋白（0 %、2.5 %、5 %、10 % )条件下校准品的稳定性， 结果表明，在校准品缓冲液中加入5%玉米蛋白，校准品的稳定性最好(见表9)。
[0136] 表9玉米蛋白浓度筛选
[0137]
[0138] (3)通过比较不同浓度胎牛血清(0%、5%、10%、20%)条件下校准品的稳定性，结 果表明，在校准品缓冲液中加入10%胎牛血清，校准品的稳定性最好(见表10)。
[0139] 表10胎牛血清浓度筛选
[0140]
[0141 ] (4)通过比较同浓度还原型谷胱甘肽(〇1111、111^[、21111、31111)条件下校准品的稳定性， 结果表明，在校准品缓冲液中加入ImM还原型谷胱甘肽，校准品的稳定性最好(见表11)。
[0142] 表11还原型谷胱甘肽浓度筛选
[0143] Lm 45」 买施例4 · CK-MB杈准品临床检测应用
[0146] 收集84例临床样本，选用贝克曼CK-MB体外诊断试剂盒(化学发光法）（注册号国食 药监械(进)字2005第3400485号)进行方法学比较。
[0147] 测定步骤：
[0148] (1)按照下列配方配制最佳稀释液：
[0149] 称取磷酸二氢钠(NaH2P04)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HP04)(国 药，100203008)0.716g、氯化钠（NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402) 0.2928、还原型谷胱甘肽（3丨 811^，64251)0.03078、胎牛血清（3丨811^，312003〇)1)101111、玉米 蛋白（国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
[0150] (2)用上述步骤（1)得到的稀释液配制300ng/ml、100ng/ml、30ng/ml、10ng/ml、 3ng/ml的合成校准品（CK-MB抗原(usbiological，货号#C7910-01D)，作标准曲线；
[0151] (3)测定方法：
[0152] a.包被:配制lyg/mL CK-MB抗体10mM 1?溶液，加入微孔发光板中，lOOyL/孔，4°C 孵育21h;
[0153] b.封闭：将微孔板中包被液甩干，加入5%BSA 10mM PB溶液，200yL/孔，4°C孵育 21h；
[0154] c.抗原:将微孔板中封闭液甩干，加入待测样本，50yL/孔，37 °C孵育30min;
[0155] (1.酶标抗体：将微孔板用洗涤液（含有0.05%(￥八)1'?时11-20(以8111 &，44112)的 1 OmM PBS溶液)洗涤3次并甩干，加入50yL/孔HRP标记的CK-MB抗体，37°C孵育15min;
[0156] e .底物:将微孔板用洗涤液洗涤3次并甩干，加入底物A和底物B(Thermo，34080)， 各50yL/孔，避光反应5min，测定发光值(厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪），发 光强度以相对光单位(RLU)表示。
[0?57] 1.测定结果
[0158]采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线（logX-logY)如图7所示，相关系 数r = 0.99，表明校准品在0-300ng/ml之间线性良好。
[0159]将本发明稀释液配制的校准品的测定结果与贝克曼CK-MB体外诊断试剂盒(磁颗 粒化学发光法)进行方法学比较，结果如图8所示，相关系数r = 0.96,表明本发明稀释液配 制的校准品的测定结果与贝克曼CK-MB试剂盒测定结果高度相关，一致性较高。
【主权项】
1. 用于CK-MB校准品的稀释液，其特征在于，是在缓冲液中加入终浓度为Ο . 01-0.12g/ ml的玉米蛋白、终浓度0.5-4mM的谷胱甘肽、终浓度3-20%V/V的胎牛血清和终浓度3-20mM 的EDTA配制而得， 所述缓冲液指以下任意一种： 1001111溶液中包含磷酸二氢钠0.06248、磷酸氢二钠0.7168、氯化钠0.88，？!1值7.4的磷 酸缓冲液； 1 〇〇ml溶液中包含Tr i s碱1.21 g，pH值8.0的Tr i s缓冲液； 100ml溶液中包含柠檬酸1.92g的柠檬酸缓冲液。2. 根据权利要求1所述的稀释液，其中所述玉米蛋白的终浓度为0.025-0. lg/ml。3. 根据权利要求1所述的稀释液，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽，其终浓度为l_3mM。4. 根据权利要求1所述的稀释液，所述胎牛血清的终浓度为5-15%V/V。5. 根据权利要求1所述的稀释液，所述EDTA的终浓度为5-15mM。6. -种肌酸激酶体外检测试剂盒，其特征在于，包含CK-MB校准品以及权利要求1-5任 一所述的CK-MB校准品稀释液。
【文档编号】G01N33/573GK105974117SQ201610289544
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】肖智, 李全, 焦守恕
【申请人】同昕生物技术（北京）有限公司