专利名称：用与疾病相关的分子标记物划分自动检测细胞的光学投影成像系统及方法
技术领域：
本发明通常涉及投影成像系统和细胞分类，尤其涉及使用投影成像的高处理能力自动系统，例如流动的光学层析成像(FOT)，根据对与恶性肿瘤和疾病相关的原子核或细胞质分子标记物划分的高定量性测量，在高危个体中检测癌症。
背景技术：
在患者中诊断癌症最常用的方法是通过获取怀疑组织的样本，并在显微镜下检查明显的恶性细胞的存在。虽然当怀疑组织的解剖位置已知时，这个过程相对简单，并且能够完全取样(例如宫颈)，但是当没有易于识别的肿瘤或病变，并且要采样区域非常大时，就不这么容易了。例如，以检测肺癌作为参考，不可能对整个肺的气管都进行取样。诸如痰液这样的样本必须要使用，因为它包含从肺中的气管脱落的细胞。这产生了稀释的问题，因为与肺的整个内部表面相比，早期肺癌非常小，并且，因此从肿瘤上脱落的细胞数量相对于正常细胞来说非常少。这个问题的是复合的，因为只有一小部分痰液样本是实际上被检查的。因此，用传统的痰液细胞学检测肺癌需要在被检查的一部分样本中存在一个或更多相对稀少的癌细胞。因此，如果所述样本没有明显的和实际地反映肺部状况，那么患有肺癌的患者不能得到正确地诊断。
Palcic等人的美国专利6026174中公开了一种基于显微镜的系统和方法的例子，所述系统和方法用于检测用于诊断的细胞和具有恶性相关改变细胞。Palcic等人的系统包括自动分类器，其具有传统的显微镜，照相机，图像数字转换器，用于控制和连接这些部件的计算机系统，用于进行初始细胞分类的第一分类器，和用于进行后续细胞分类的第二分类器。该方法使用自动分类器自动检测用于诊断的细胞和具有恶性相关改变的细胞。这种方法通过检测表现恶性相关改变的细胞对传统的细胞学进行了改进，所述的恶性相关改变的细胞比癌症细胞更常见。但是，诊断结果的质量受到使用传统的显微镜的限制，这种传统的显微镜不能准确地测量染色(stain)密度。而且，Palcic等人的方法没有说明使用特异性分子探针(specific molecular probes)，也没有对分子标记物进行划分。
随着特异性分子探针的出现，例如抗体和核酸探针，新的疾病相关问题可以通过标记这些分子探针，然后测量它们在生物细胞和组织中的定位和浓度而说明。使用被标记的，特异性的分子探针能够对分子标记物间接定量和划分，所述分子标记物例如pRb、p53/p53结合蛋白1(53BP1)、Sam68、PTEN、E2F和5-甲基胞嘧啶-鸟嘌呤(甲基CpG)，它们可能提供如癌症等疾病过程的信息。(例如，参见Pasquale，D.的“Retinoblastoma Protein Tethered to Promoter DNARepresses TBP-Mediated Transcription”，Journal of CellularBiochemistry，70281-287，1998；Rappold I，的“Tumor Suppressorp53 Binding Protein 1(53BP1)Is Involved in DNA Damage-signalingPathways”，The Journal of Cell Biology，153(3)613-620.2001；Chen，T.的“A Role for the GSG Domain in Localizing Sam68 to Novel NuclearStructures in Cancer Cell Lines”，Molecular Biology of the Cell 103015-3033，1999；Perren，A.的“Mutation and Expression Analyses RevealDifferential Subcellular Compartmentalization of PTEN in EndocrinePancreatic Tumors Compared to Normal Islet Cells”American Journal ofPathology，157(4)1097-1103，2000；Gil，R.的“SubcellularCompartmentalization of E2F Family Members Is Required forMaintenance of the Postmitotic State in Teminally Differentiated Muscle”，The Journal of Cell Biology，148(6)1187-1201，2000；Rountree，M.的“DNA methylation，chromatin inheritance，and cancer，”，Oncogene，203156-3165，2001)由于迫切需要对这些探针进行更准确的定位和定量，随之而来的是需要提高用二维(2D)和三维(3D)亚微米分辨率测量探针密度的技术。传统的光学显微镜使用固定在载玻片上的细胞，只能进行近似2D密度测量，这是由于受到焦平面深度、采样角度和细胞准备问题的限制，典型的细胞准备问题是细胞重叠在图像平面上。光学显微镜的另一个缺点是光学显微镜的固有的穿过物镜的视角的限制，只有在位于狭窄的焦平面的区域才能够提供用于分析的准确数据。
流动血细胞计数法通常通过使细胞逐个地在液体流中流动而克服了细胞重叠的问题。遗憾的是，流动血细胞计数系统并没有产生与传统光学纤维镜同样质量的图像，并且，在任何情况下图像都不是三维的。对于背景技术，本领域技术人员可以参考Shapiro，HM的“实用流动血细胞计数”，第三版，Wiley-Liss，1995。
共焦显微镜提供了样本的3D成像，其通过对样品的薄层连续成像，创建了2D图像的层叠，该图像可以以三维观看。通过扫描透过载玻片上的样本的细光斑实现成像。荧光或反射光通过小孔聚焦在检测器上，小孔阻止在焦点外的光碰撞到检测器上。这样，小孔的尺寸确定了在垂直方向上的分辨率，并且光斑的尺寸确定了水平方向的分辨率。遗憾的是，共焦显微术是非常慢的方法，因为图像是通过扫描穿过样本的光栅上小的光斑建立的，并且样本必须再扫描以产生每个额外切片。另一个缺点是位于载玻片上的细胞是扁平的，造成细胞结构的扭曲。
在计算机辅助层析成像中，在1995年3月28日公开的Johnson等人的，标题为“三维显微分析系统”的美国专利5402460中公开了一种显微系统，该系统使用X线发生器和X线检测器测量透过样本的X线束的衰减，用于产生样本的高分辨率三维图像。两种投影，每种都使用不同能量的X线束，每种样本的视图都用Johnson等人的显微系统产生。在产生样本的一个视图的两个投影后，样本围绕样本支架旋转，并产生另外一组投影。对所述样本的每个投影一起分析，以提供对包括所述样本的材料的阶段百分数(phase fraction)的定量指示。对不同视图的投影进行组合以提供所述样本的三维图像。美国专利5402460包括在这里作为参考。虽然在美国专利5402460中教导的X线技术对某些应用是有效的，但它没有提供对流动血细胞计数有用的光学解决方法，这种光学解决方法能够测量生物细胞内的分子密度三维分布。
为了克服上述局限和这种系统中的其它问题，本发明的目的是将流动血细胞计数的逐个细胞表现和计算机化光学层析成像结合起来，所述计算机化光学层析成像从多点源投影，根据多个投影重构细胞内的密度信息。重构的密度信息能够对特定标记的标记物和这种标记物的划分准确定量。
这里提到的密度信息对投影成像系统是唯一的，其不需要使用透镜和聚焦板，所述透镜和聚焦板带有它们固有的不需要的模糊伪影，这种伪影是由于在狭窄的聚焦板之外的非聚焦结构而导致的。由于投影成像系统不需要透镜和聚焦板，而是产生所有结构都立即清晰聚焦的放射线透射照相，所以密度特征的测量比传统的显微系统更加定量化和准确。而且，由投影图像得到的3D重构使得特征分离，这些特征可以重叠在任何单独的2D视图中。这些密度特征与用于对染色细胞的分子探针的位置和定量直接相关。
本发明克服了现有技术的不足，其中对分子标记物的亚细胞和亚核划分的测量并不用于诊断，因为，直到现在还不存在执行这些测量的有效方法。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了一种用于在细胞样本中检测恶性相关细胞的方法，包括如下步骤获取细胞样本并将细胞悬置在溶液中；如果需要，将细胞样本的细胞固定在悬浮液中；在每个样本细胞中进行染色和/或标记该细胞用以产生与特定分子标记物或其他结构相关的光学密度；产生单细胞流体(flow stream)；在流体中用“点”光源照射每个细胞，并获得一个或多个用数字检测器穿过细胞的投影图像(即放射线透射照相)；对投影图像进行背景照明变化补偿；分析投影图像以检测和对特定标记的分子标记物划分；对至少一个分类器提供标记物划分和其它分析数据，所述分类器识别并特征化细胞样本中与恶性相关的细胞。
在另一方面，本发明提供一种自动检测分子标记物和对细胞中的分子标记物分类或定位的系统。所述优选的系统包括一种流动光学层析成像(FOT)装置，其由计算机系统控制并与计算机连接。由FOT捕获的投影图像由计算机存储和控制，以检测被标记的分子标记物的存在。通过计算机可重构多个投影图像，产生三维(3D)图像，以划分细胞或细胞核内被标记的标记物，并对这些标记物进行量化。
为了确定分子标记物划分，获取细胞样本并在悬浮液中染色，然后用FOT成像。染色或标记的探针对感兴趣的分子标记物具有特异性，这些分子标记物包括但不限于pRb，p53/53BP1，E2F，PTEN，SAM68和甲基CpG。分子探针可以用生色团、荧光染料、或能够产生生色团或荧光染料的酶。然后，计算机系统直接分析投影图像和/或计算也被分析的三维重构。针对不均匀光照射和图形采集系统的其他缺陷校正图像。在所有图像经过校正后，计算感兴趣对象的边缘、表面和体积、密度，即，用于确定哪个象素或体元属于所述感兴趣的对象或结构的边缘，哪个属于背景。这些感兴趣的对象包括标记的探针和染色的细胞结构。
然后，计算机系统计算每个对象或结构的一组一维、二维和三维特征值。对一些特征计算，通过用一个或多个象素(或体元)膨胀或腐蚀所述边界(或表面)对沿着最高梯度值的边界进行校正。这使得每个特征获得对象的类之间的较大的区分力，并因此对象具有特异性。然后这些特征值由分类器进行分析，该分类器使用所述特征值确定所述对象是伪影，或是已经过特定染色或标记的细胞或细胞核内感兴趣的对象或结构。如果该对象看上去像感兴趣的对象或结构，然后由分类器进一步分析特征值，以确定对象是否是所述类型，以及是否在指示疾病的细胞或细胞核内。只要已经识别出感兴趣的对象或结构，相关的分子探针密度赋值给特定对象，由此获得探针的划分。根据在样本中找到的表现出明显具有标记划分中的疾病相关改变的细胞的数目，可以得到获取细胞样本的患者是健康的或患有恶性病变的统计判定。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于检测细胞样本中上皮细胞的方法，和用于检测上皮细胞中具有与疾病相关的分子划分的细胞的方法。在另一个实施例中，提供了一种预测患者是否将会患有癌症的方法。
图1示意性地表示根据本发明实施方式设计的流动血流计数系统的例子；图2是示意性地表示根据本发明实施方式设计的单细胞流动过程的例子；图3A和图3B是示意性地表示根据本发明实施方式设计的重构的细胞和横断面的例子；图4是示意性地表示根据本发明实施方式设计的重构圆柱体的例子；图5是示意性地表示根据本发明实施方式设计的流动光学层析成像(FOT)的例子；图6是示意性地表示根据本发明实施方式设计的在重构圆柱体内的投影线的例子；图7是示意性地表示根据本发明实施方式设计的重构圆柱体的顶视图的例子；图8是示意性地表示根据本发明实施方式设计的用于细胞重构的源/线性阵列的几何外形的顶视图的例子；图9是示意性地表示根据本发明实施方式设计的分类方法的例子，该方法用于从投影图像和层析成像重构中分析标记物数量和划分；图10是示意性地表示根据本发明实施方式设计的分子探针划分过程的例子；图11是示意性地表示根据本发明实施方式设计的在细胞内划分的例子；图12是示意性地表示根据本发明实施方式设计的检测细胞的方法的框图的例子，所述细胞带有与恶性肿瘤和/或包括癌症的疾病相关的分子标记物划分。
具体实施例方式
这里所描述的本发明是关于涉及生物细胞的特定例子，不过，应当理解，这些例子用于说明本发明的原理，并不用于限制本发明。在一个例子中，在显微镜体积内建立的点密度和发射强度的三维分布允许在亚细胞体内的任何位置进行密度和荧光测量，并确定标记有带标记的分子探针的结构或分子标记物的位置。通过使用标记的分子探针，在显微对象中，连接到特异性结构或分子标记物上的探针的数量可以被测量，得到与该结构相关联的标记物划分的测量。出于描述的目的，如生物细胞这样的对象可以用至少一个被标记的分子探针标记，例如抗体，特定的结合蛋白，外源凝集素或核酸探针，并且所测量的这些探针的划分可以产生关于细胞疾病状态的重要信息，包括(但不限于)各种癌症，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌和卵巢癌。分子探针可以是pRb、p53、53BP1、Sam68、PTEN、E2F或甲基CpG的抗体。
生物细胞被引起流动或穿过一个装置，所述生物细胞已在悬浮液中准备并染色或被标记了对疾病诊断具有特异性的带标记的分子探针，所述装置用于采集投影图像，并允许根据与所述细胞运动向量近似垂直的光学投影线路径重构2D和3D密度信息。通过控制细胞沿轴的移动速度，重构的垂直二维平面能够沿着细胞的轴准确地定位(或层叠)，以创建整个细胞的3D图像，或细胞的3D图像可以直接根据二维光学传输或发射投影中计算。
流动血细胞计数非常适于图像重构，因为它具有如下特征·细胞以单行流过毛细管，因此减少了细胞重叠和遮蔽；·细胞流过毛细管的速度能够直接测量，并且是恒定的；·细胞趋向于沿着毛细管的中轴流过；·分析悬浮液中的细胞减少了组织变形。
本发明利用了上述特征提供了一种用于点源投影成像和层析成像重构的系统，但本发明不限于上述特征。
现在参考图1，其中示意性地显示了根据本发明实施方式设计的流动血细胞计数系统的例子。该系统参考坐标系统11定位，坐标系统11具有在x，y和z方向的坐标。在操作时，使用已知的注入装置4将细胞1注入试管3。毛细管在注入端5较宽，并包括压力罩6。在试管8处引入鞘液(sheath fluid)7以在毛细管2内产生层流。传统的流动血流计数器的特征是在悬浮液中准备的细胞1能够被移动通过毛细管2，使得它们沿着流动轴略伸长，并沿着毛细管2的中轴近似向下运动，如虚线9所表示的。细胞可以有利地沿着圆柱状毛细管的中轴轴对称地并以均匀速率10单行流过。
参考图2，图2是示意性地表示根据本发明实施方式设计的单细胞的流动过程的例子。细胞1以速度向量10指示的恒定速度(V)移动通过毛细管2。细胞1包括细胞质膜12和细胞核膜13。在流动通过毛细管2的过程中，细胞1通过多个重构平面，出于说明的目的，所述重构平面分别表示为第一、第二和第三重构平面14a，14b和14c。第一平面切片15a穿过细胞质，位于重构平面14a内。同样地，第二平面切片15b穿过细胞质和细胞核，位于第二重构平面14b内，并且第三平面切片15c位于第三重构平面14c内。本分明的核心特征是，多个波长可选择的光学点源设置在以毛细管为中心的周围区域。光学点源与相对的光学传感器阵列结合操作，其中所述光学传感器阵列对光谱的可选择的部分敏感，因此允许获取透过细胞传输的光的投影。所获取的投影图像可以直接被分析，或使用层析成像图像重构算法处理，以提供细胞内密度和/或发射强度分布的空间映射或图像。应当理解，在实际中，重构平面的数目可在几个到几百个或更多个变化，这取决于提供给系统的对象所需的图像分辨率。重构的平行平面切片图像组可以在软件中组合或层叠，以产生细胞内密度和发射强度的三维(3D)图像。另外，通过使用平面(2D)光传感器阵列代替一维(1D)光传感器阵列，和用圆锥体照射线模式代替扇形照射线模式，可以同时采集穿过流动细胞的多个连续平面切片的投影。因此，在细胞体内的密度和发射强度的三维(3D)图像能够使用锥束重构算法直接从二维(2D)投影中计算。可选择地，能够直接分析具有无限景深的二维点源投影图像。
在生物细胞的例子中，重构平面之间的距离(d)可以是几微米或更小。在细胞1中的点与每个重构平面的时间间隔一致，其中所述时间间隔(t)可以根据下述关系描述t＝d÷V(公式1)现在一起参考图3A和图3B，在这里示意性地表示根据本发明实施方式设计的重构的横断面16的例子。由穿过细胞的光学投影得到的细胞内点密度的重构受益于流动细胞的轴对称和中心性。另外，投影采样的区域能够被模型化为由三个主要区室组成1.细胞外的流体17(即，鞘液或细胞悬浮介质)2.细胞质18，和3.细胞核19。
定量了解光学密度或分子探针在这三个区室中的分布足以说明细胞生物学和疾病诊断中的许多重要的问题。另外，如果某种分子探针优选结合在包括细胞质膜12和细胞核膜13的两个边界表面上，计算这两个边界表面是有用的。另外，可以足以将这些膜表征为在这三个不同区室之间的过渡表面。
在其他情况下，分别在细胞质和细胞核内重构和限定区室，例如高尔基体和核仁，并对将特异性的分子标记物定位到这些区室可能是有利的。
通过组合细胞的重构切片，或通过以螺旋，体积方式进行重构，能够产生三维形态和体积信息，但绝对(与相对的相反)体积依赖于细胞位置的准确信息。细胞位置是流速的函数。不过，在一些例子中，染色或分子探针的相对浓度或密度足够说明诊断问题相对于其他区室，在某种亚细胞或亚核区室中的探针的数量是多少？由在不同区室中的特异性探针的相对光学密度测量到的某些分子标记物不恰当的划分足以诊断疾病状况。亚微型空间分辨率促进了细胞质或细胞核内标记探针与特异性的亚细胞区室、结构或细胞器官的联系。
现在参考图4，图4是示意性地表示根据本发明实施方式设计的重构圆柱体的例子，所述重构圆柱体围绕流动管2容纳有流动细胞1。重构圆柱体20包括例如以预定螺距设置的点源21的螺旋线24，其螺旋角为θ。每个点源21产生光子束22，其中光子束22典型的是圆锥形或扇形。虽然图4的例子中所示的点源的设置是螺旋线形，但点源的阵列可以采用显著不同的几何模式，这部分取决于电子速度，细胞速度和获取无重叠的投影信号的传感器(检测器)上的几何形状。传感元件23设置为从点光源接收光。
当细胞1流过点源时，固定的光学点源21，结合在试管周围安装的相对设置的检测器23能够采样通过整个细胞1的多个投影角。通过对光源和衰减的传输和/或散射和/或发射的光的发射或读出定时，或对这两者都定时，每个检测信号将与沿着流动细胞的Z方向轴的特定的、已知的位置相一致。通过这种方式，以已知速率沿垂直于光源的已知轴流动的细胞1，能够被穿过细胞的投影光学地分割，其中光源以同步模式发射或检测，所述投影能够被重构以形成x-y平面上的二维切片。通过层叠或用数学方法组合连续的切片，形成细胞的三维图像。也可以将细胞移动与围绕流动轴的光源(或多个光源)的位置相结合，产生能够重构的数据，例如，以螺旋方式产生细胞的三维图像。重构可以或者通过使用锥束重构算法根据一维(1D)投影重叠邻近的平面图像来实现，或者通过直接使用锥束重构算法的平面(2D)投影来实现。所述细胞的3D图像能够产生亚细胞结构和划分或提供诊断信息的带标记的分子探针的数量和位置的定量测量。
如上所述，重构所述横切面或体积的二维或三维密度结构需要穿过细胞横切面的多个投影。在传统的逐个切片医学X线计算的层析成像中，通过使患者保持静止，而X线源和与其相对的检测器沿着圆周产生多个穿过患者的投影角，从而得到多个投影。类似的方法，本发明的流动光学层析成像系统以预定的速度(V)移动细胞通过多个源，所述源设置在沿着毛细管的圆周的不同角度的多个源位置处，以当细胞流过点源时产生通过细胞的多个投影。所述点源发射光子，所述光子穿过细胞并由与所述点源相对的检测器阵列检测。点源可能有利地沿螺旋线24设置，或以其他合适的几何模式设置在毛细管的圆周上，使得当细胞通过点源阵列时，细胞中的每个点从多个角度被采样。为了产生优良的采样几何形状，这些点源可以覆盖至少180度圆周。更小的覆盖角度(即，采样下的角度)在某些情况下是可行的，而额外的径向覆盖将提高计算的重构的准确性和信噪比。对锥束或扇束图像重构使用传统的分析、迭代或统计算法是有利的，这取决于不同的几何外形(参见，例如，Gilbert，P.的“Iterative Methods for theThree-dimensional Reconstruction of an Object from Projection，”Journalof Theoretical Biology 36105-17，1972；Oppenheim，B.E.的“MoreAccurate Algorithms for Iterative 3 dimensional Reconstruction，”IEEETransactions on Nuclear Science NS-2172-7，1974；Singer，J.R.、Grunbaum，F.A.、Kohn，P.和Zubeli，J.P.的“Image Reconstruction ofthe Interior of Bodies that Diffuse Radiation，”Science 248(4958)990-3，1990；Mueller，K.和Yage，R.的“Rapid 3-D Cone-beam Reconstructionwith the Simultaneous Algebraic Reconstruction Technique(SART)Using2-D Texture Mapping Hardware”，IEEE Transactions on Medical imaging19(12)1227-37，2001)相关方法包括，但不限于所述技术(代数重构技术，例如参见Bellman，S.H.、Bender，R.、Gordon，R.和Rowe，J.E.的“ART is Science being A Defense of Algebraic ReconstructionTechniques for Three-Dimensional Electron Microscopy，”Journal ofTheoretical Biology 32205-16，1971)；SIRT(同步迭代重构技术，如Gilber，id.#1493的例子所述)；ML-EM(最大似然估计，例如参见Manglos，S.H.、Jaszcak，R.J.和Floyd，C.E.的“Maximum LikelihoodReconstruction for Cone beam SPECTDevelopment and Initial Tests，”Physics in Medicine and Biology 34(12)1947-57，1989，#1382)；和OSEM(有序子集最大期望值，例如参见Manglos，S.H.、Gagne、G.M.、Krol A、Thoms，F.D.和Narayanaswamy，R.的“TransmissionMaximum-likelihood Reconstruction with Ordered Subsets for Cone BeamCT”，Physics in Medicine and Biology 40(7)1225-41，1995，#4389)。
方法流动血流计数器现在参考图5，其中示意性地表示根据本发明实施方式设计的流动光学层析成像系统(FOT)的例子。所述的流动光学层析成像系统包括流动血流计数器，其带有位于毛细管2周围的重构圆柱体20。光子源25和光子传感器26与脉冲幅度分析器27协同工作，以作为触发装置工作。脉冲幅度分析器27按照已知的原理操作，以提供细胞开始的第一触发点28，和细胞结束的第二触发点29。脉冲幅度分析器27输出对应于每个细胞起点和终点的触发信号，其中所述的触发信号由重构圆柱体20接收。
计算机40与点源21、传感元件23和脉冲幅度分析器27连接，通过信号线41-43将数据，控制信号和定时信号发送到点源21、传感元件23和脉冲幅度分析器27。所述计算机可以包括已知的计算机和多个计算机和用于图像采集和图像重构处理过程的阵列处理器。
商业上的流动血细胞计数器具有三个基本流体结构即，圆柱形流动管，矩形流动管和空气系统中的流动(参见Shapiro，H.M.的“Practical Flow Cytometry”，第三版，1995)。优选的结构是圆柱形流动管，因为这对于保持用于重构算法的最佳圆柱形几何外形以减小流动硬件产生的任何对半径的依赖是重要的(见图1)。而且，圆柱形流动管可以具有相对于毛细管横截面区域均匀的壁厚度。
另外，触发装置可以设置在重构模块的上游，以提供用于当细胞优选地进入重构圆柱体和从圆柱体中出来时，开始数据采集和然后终止数据采集的定时信号。触发装置可以优选地包括激光二极管、CCD、PMT、光电检测器的组合、固体状态光电检测器和上述元件的组合。触发装置具有阈值设置，其感应流动细胞的出现，因此产生触发信号，结合已知的细胞速率，该触发信号能够用于计算何时下游的重构圆柱体可以开始对感兴趣的特定细胞进行数据采集。而且，对应于细胞进入重构圆柱体和从其中出来的入口和出口的第一和第二触发点之间的时间间隔可以分为相等或不等的部分，在每个部分，可以通过选通光源21和读取传感器阵列23进行采集另外的投影数据。
需要准确地控制和测量流动的速率，高端商用系统提供有这种能力，其使用的速度范围为1米/秒到10米/秒。最好的细胞速度通过考虑数据采集速度和信噪比而确定，如后面所讨论的。
重构模型参考图6，图6是示意性地表示根据本发明实施方式设计的重构圆柱体20内的扇形投影线的例子。重构圆柱体的目的是提供从多个固定点源21a-21c沿小的圆周将光投影进入圆柱形毛细管的装置。从点源发射出的光子具有已知的投影几何形，例如扇形或圆锥形，并通过毛细管被传感器元件23a，23b或23c检测，例如可以位于沿着与相应点源相对的最大圆周。出于说明的目的在这里描述了适合于扇形透射的弯曲的一维(1D)传感器阵列，应当理解也可以同样使用适合于锥束透射的直线的一维(1D)传感器阵列或平面(2D)传感器阵列。通过这种方式，能够产生一组投影线，其中投影线能够描述为连接点源和各个传感元件的直线。沿着特定投影线(例如线31)离开点源的光子数量，和在特定传感元件接收的光子数量之间的差别与光子损失或衰减相关，这种光子损失或衰减是由于细胞和相关标记分子探针和沿着投影线路径的其他流体管内容物的相互作用产生的。
不过，光散射、光子能量转换，几何形状不完美和准直不佳会导致复杂的情况，并且当多个点源同时激发时，来自不同光源的光子可能到达特定的传感元件。通过谨慎地建立重构圆柱，例如，如这里所描述的，通过明智地选择点源模式的几何形状和与它们相对的检测器，并且通过对多个点源的激发和传感器阵列的读出进行适当的定时和多路复用，能够减小但并不会消除由这些问题引起的光子污染。
光子污染能够通过校准系统进行说明，例如，在细胞不存在时校准系统。即，每个光源可以依次进行照射，它对每个传感器的作用能够被测量，从而提供用于使系统正常化的偏移数据。也可以需要额外的校准步骤，例如，其光学特性是已知的并横跨细胞成像的感兴趣的密度范围的胶乳橡胶珠或其他微球粒或扁圆球状体成像。通过在检测器上使用光谱带通滤波器，从荧光探针发出的光子可以与哪些从点源发出的光子相区别，如后面所讨论的。
光源每个光源可以具有同样的普遍特征，优选地●可以近似为小的圆形点源；●可以由已知的光谱物质点亮；●从所述光源发出的光子可以具有已知的几何形状，例如锥束或扇束。
每个光源创建用于一个投影角的数据。当细胞流过模件时，沿螺旋线设置的多个光源从多个投影角穿过每个连续平面(或重构切片)创建数据，螺旋线的轴是流体管的中心轴。依赖于传感器的几何形状，几个点源能够设置为在同一圆周上共线，使得投影在传感器上不重叠。通过沿着180度螺旋线等距离地放置点源能够获得优良的采样几何形状，虽然在某些情况下，采用较小的覆盖角度是可以容忍的，但可以采用360度的角度以提高信噪比。光源的理想数目是在每个平面重构(x-y平面)或体积重构中所需的分辨率的函数。虽然使用了点源的螺旋状布置进行描述，应当理解点源阵列可以采用各种几何模式。更进一步，光源的波长是可选择的，或者通过使用各种二极管，或者其他激光，或者通过白光或其他宽带光源的带宽滤波，例如，水银灯或氙弧灯。
现在参考图7，图7是示意性地表示根据本发明实施方式设计的，如图6所示的重构圆柱体的顶视图的例子。图中显示了第一点源21a和传感器阵列23a，其中带有原子核19的细胞在光源投影的轨迹上垂直于纸面流动，它以二维方式构成了重构圆环32，其中所有投影即使通过瞬时交错的模式采集，都显示为重叠的，并且其中整个细胞都被包含。第二点源21b和第二传感器阵列23b设置在绕螺旋线大约30°角的位置。第三点源21c和第三传感器阵列23c设置在绕螺旋线大约90度角的位置。
数据采集在“厚的”细胞平面轴横截面上与细胞速度同步选通。理想的平面厚度是在z方向上所需的分辨率的函数。典型地，轴方向(z方向)的分辨率比在平面的横断方向小。而且，可以通过投影扇形的重叠交错限定重构的最佳圆环，所述投影扇形的顶端具有点源，底部具有传感阵列同样的宽度。理想的情况是，重构圆柱形的几何形状能够确保流动细胞的横截面完全包含在重构圆环中。
创建光学点源可以有几种选择，例如●位于激光器或其他高强度光子源前面的针孔；●具有小的横截面的光纤；●在光子源前面的短焦距透镜；●在荧光物质表面发射点的电子束(一种形式的CRT)；和●上述各种组合。
几何形状是这样的，光源距离感兴趣的对象(细胞)越近，由于对着靠近光源的对象的几何角度较大，几何体的尺寸越大。相反地，如果所需的分辨率在系统设计前是已知的，那么几何形状可以对该特定的分辨率进行优化。对于背景技术，本领域技术人员可以直接参考Blass，M.主编的“Handbook of OpticsFiber Optics and NonlinearOptics”，第二版，第四卷，McgrawHill，2001。
现在参考图8，图8是示意性地表示根据本发明实施方式设计的用于细胞重构的直线性阵列23的例子。例如，给定包含在30微米直径的重构圆环内的细胞横截面12和细胞核19，和0.5微米的理想分辨率，然后Nyquist(尼奎斯特)采样(即，通过两因子过采样)要求每个点源21至少需要120个传感元件33。在顶端的点源21和在底部的线性阵列长度34形成三角形35，使得示例的30微米直径的细胞适合固定在三角形35中离点源21足够近的位置。在这个例子中，如果所述阵列的每个元件(例如CCD)是20微米宽，并且阵列的长度是2400微米，那么细胞的中心可以设置在从点源大约100微米(毛细管直径的一半)的位置，当点源和线性阵列之间的距离是8毫米时，提供80倍的放大倍数。
作为第二个例子，考虑30微米直径的重构圆环和互补金属氧化物半导体(CMOS)传感阵列，其中象素元件大小是4微米，在这个例子中，所述阵列可以包含120个元件，宽度是480微米，并且当在点源和细胞之间的距离是100微米时，可以设置在距离点源1.6mm处，提供16倍的放大倍数。
传感元件每个点源应当具有相应的传感元件阵列，例如在一些与点源相对的直线或曲线几何结构的CCD，以接收穿过重构圆环发射的光子射线。典型地，所述线性阵列可以使其传感元件阵列以点源和中心流体轴之间的线为中心，并且可以垂直于流动轴排成一行。可以使用二维阵列，只有在二维阵列元件内的每行元件的子部分被读取，用于作为重构的输入。在二维阵列中，阵列元件的每个连续的子部分可以被适当数量的元件间隔，以沿着点源的螺旋结构与每个不同点源适当对准。
对于逐切片扇束重构，使用30微米重构圆环，每个扇具有120个传感元件，以获得0.5微米的分辨率，具有2000×2000个20微米元件的二维阵列足够用于传感136个，设置在1径向角度增量(radial degreeincrements)的点源，其中在连续视图之间的平均偏移是300微米，等于15个传感元件。(在阵列的中心，偏移可能是140微米，或7个元件，而在所述阵列的边缘，视图间的1径向度扫描可以产生相当大的偏移)。如果15行传感器阵列构成的组平均提供用于一个切片的投影数据，在细胞图像内的z分辨率可能是3.75微米，但是如果每个投影平均两行，对象区域的轴分辨率可能是0.5微米，等于横向分辨率。
在本发明优选的实施例中，2D阵列沿着以重构圆柱体为中心的柱形圆周弯曲，因此射线路径在长度相等。对于30微米重构圆环的情况，对于上面的例子，一个弯曲的2D阵列，其只拥有需要与点源的螺旋轨迹相对的元件，可以是具有120个元件宽乘以136个元件高度(长度)的螺旋带120。
虽然上面为了说明而描述了平面或“厚的”扇形照射，应当理解实际的、未校准的锥束照射可以与2D平面检测器一起使用，使用锥束算法提供3D重构。所述的2D投影图像可以被直接分析，以获得例如关于疾病状态或细胞变形状态的信息。对于直接的，测定体积的锥束重构，来自多个点源的照射以如下方式多路复用给定点源和检测器的几何结构，来自不同点源的锥束照射不会重叠在传感器阵列上。
而且，如果细胞以1米/秒的速度流动(或1,000,000微米/秒)，并且在2D阵列中的每个元件是20微米宽，那么在0.25微米细胞切片中，每20微秒读出一行可以容易地捕获数据。对于在15个传感器行被平均以提供3.75微米切片的数据的情况，读出将不得不每300毫秒进行一次，使用较大的2D阵列可以获得图像质量的显著提高。
本发明的一个上述方式特别适合于多个传输或发射波长带的多光谱成像，该实施例可有利地包括两个或多个连续设置的重构模块。这种多个重构圆柱体可以由毛细管插入部分分隔，并且每个模块提供足够产生在其中流过的对象的完整的重构图像的投影数据。对这几个重构模块的每一个的点源和/或传感器阵列可以对特定光谱带优化。例如，第一重构模块可以使用强烈的白光照射和无过滤的检测，以提供完全的投影数据集，从而重构对象光学密度、吸收和散射系数的映射，而第二重构模块可以使用以495nm为中心的窄光谱带的照射，例如氩离子激光器(488nm)，以激发用于荧光免疫检测研究的荧光探针标记蛋白，与对520nm发射光敏感的滤波传感器阵列相结合，提供第二弯曲投影数据集，所述第二弯曲投影数据集通过使用后面所述的发射重构算法足够标记蛋白的浓度分布。虽然第三重构模块可以使用以大约535和/或342nm为中心的窄带照射，以激发碘化丙啶结合DNA化学计量，和用滤波传感器阵列最佳地检测红光(617-nm)发射，用于倍性(ploide)研究。应当理解，前面的例子是出于说明的目的，并且所使用的方法普遍适用于任何进行照射和传感的波长组合。
图像重构众所周知，最普通和容易实现的重构算法是滤波背投影方法，上述算法是从使用锥束和扇束几何学的计算机X线层析成像(CT)的相似范例中衍生的(参见下面的参考文献，例如，Kak，A.C.和Slaney，M.的“Principles of Computerized Tomographic Imaging”，IEEE Press，New York，1988和Herman，G.的“Image Reconstruction from ProjectionsThe Fundamentals of Computerized Tomography”，Academic Press，NewYork，1980)。这些方法根据原理氡形态的变换反映出源/检测器结构的特殊几何形态和放射线的射线路径。但是，就临床x线CT而言，为了逐切片获取，通常将患者固定不动，同时x线源和检测器阵列可以围绕患者沿一条弧线运动，从位于给定切片内的多个投影角度采集数据。然后沿z轴将患者重新定位并采集另一切片的数据，等等。或者，在更新型的临床螺旋CT中，可以在z轴连续传送患者同时源-检测器组件连续旋转以提供螺旋投影数据，然后通过对上述投影数据进行内插以提供与患者z轴正交的投影。在流动光学层析成像中，相对于静止源和检测器阵列以恒定速度移动对象(细胞)，其中多个源/检测器系统以产生位于给定切片或体积内多投影角度数据的方式，获取与细胞速度向量上特定门控时间点同步的数据。对于逐切片扫描，重构算法将计算运动轴正交平面的2D图像并且多切片连续层叠将产生对象的3D图片，对于CT或流动光学层析成像，图片中的对比度分别是对象内x线衰减系数或光密度变化的函数。对于体积测量，锥束扫描重构算法直接根据位于成像对象内的平面传输或发射光投影计算细胞或其他对象内的体积3D图像，图像中对比度分别是光密度和/或荧光标记探针密度分布的函数。
对产生细胞密度重构的传输数据或对重构荧光标记探针分布的发射数据，或对上述两种数据，执行滤波背投影以外的图像重构算法是合乎需要的。称作迭代重构算法的通用类在某些情况下更加有效，对于发射层析成像或当它有可能将先验信息，例如在本发明的实例中已知对象具有轴对称和三角分割特性，合并到重构算法以改善重构质量时尤为明显(例如，参见Gilbert，P.的“Iterative Methods for theThree-dimensional Reconstruction of an Object from Projections”，Journalof Theoretical Biology 36105-17，1972和其他上面提到的参考文献)。
同样，一种方法可以有利地使用基于有限元模型(FEM)，静态重构算法。FEM算法从线性传输理论中衍生而来，在该算法中针对全部元素边界求解光扩散/迁移方程以产生吸收、散射、折射率和成像对象各项异性因数属性的某些组合的二维或三维映像。在Paulsen，K.D.和Jiang，H.的“Spatially Varying Optical Property Reconstruction Using aFinite Element Diffusion Equation Approximation”，Medical Physics 22(691-701)1995，Hampel，U.和Freyer，R.的“Fast Image Reconstructionfor Optical Absorption Tomography in Media with Radially SymmetricBoundaries”，Medical Physics 25(1)92-101，1998；Jiang，H.、Paulsen，K.D.和Osterberg，U.L.的“Frequency-domain Near-infrared PhotoDiffusion ImagingInitial Evaluation in Multitarget Tissuelike Phantoms”，Medical Physics 25(2)183-93，1998。
染色分离如果使用多色点源(例如，白光)，然后能够使用不同颜色的染色剂(例如，发色团)以辨别给定细胞内多个分子探针和结构特征。这种情况下，在源或传感器阵列(或两者皆有)上的串行带通滤波器分离波长数据并允许对单独被染色的分子进行重构和空间定位。一个用于多探针成像的更健壮的方法涉及强白光源和在传感器阵列上多滤波带宽同时采集，因而允许图像重构算法计算每一个发色团的空间图像层。这些可以用彩色图像进行显示。
荧光，磷光，化学发光和超微粒子发射和流动光学层析成像的特定情况一样，当通过光子的一次光源受激发时，特定的分子探针能够使用发出不同(更长)波长光的“指示器”进行标记。来自指示器的二次发射能够通过使用标准光学滤光片进行滤波，以从二次发射光子中分离一次光源的光子。但是，二次发射光子图像重构算法更加复杂，因为二次光子不一定出现在从点源开始的径直射线路径中。如果假定二次光子按等球面模式从二次点源发射，那么二次光子到达任何传感器元件上的强度将是到传感器元件距离的单值函数。通过提供二次光子相对于点源和位于重构层内的空间分布模型，进一步限定可以说明光子从二次源的非球面分布。任何一种方法将提供一种装置以计算重构切片或体积中的二次源位置。成像对象和检测器阵列之间的校准将改善图像重构。
如果一次光子强度和二次光子强度同时通过光学滤光进行测量，源自一次光子强度的高分辨率的密度重构能够叠加在二次源重构上或同二次源重构融合，以致于可以在单个重构图像中获得连同局部探针浓度的图像形态。依据强度、信噪比和滤波性能或在源和/或传感器上产生光子的窄带宽，可以有利地利用每一个均相对于不同标记的分子探针的多个二次源。
如上所述，本发明是一种用于自动检测和划分分子标记物的系统，上述分子标记物根据从患者身上获取的细胞的光学投影和层析成像重构被分子探针明确染色或标记。通过不适当分子标记物表达和/或划分的出现或缺失，能够做出患者是否患有恶性肿瘤的判断。
现在参考图9，图9是示意性地表示根据本发明实施方式设计的具有细胞重构数据的分类方法的例子。上述系统可以包括若干分类器，这些分类器能够一起工作以确定特殊细胞样本是否包含感兴趣细胞，以及这些细胞是否显示出与疾病相关的不恰当分子标记物表达和/或划分。分类器是一种根据确定特征值91分析对象的计算机程序。例如，本发明的自动分类器系统包括执行基本筛选功能和选择感兴趣对象的一次分类器90。二次分类器92将细胞对象分为形态异常或形态正常且具有和疾病相关的不恰当分子标记物表达和/或划分，或正常的且不显示与不恰当分子标记物表达和/或划分相关的疾病。报告93可以提供任何一个或全部分类器的详细分类结果。应当理解根据本申请许多不同的分类器可以被应用。
如上所述，尽管本发明的自动系统可以包括一个一次和二次分类器，也能够使用一个单独的分类器顺序获取本发明所实现的分类。通常可以从商业上获得根据统计方法产生分类功能的软件包。
本发明的自动分类器优选地包括利用模糊双值决策或贝叶斯统计决策的分类器，上述决策根据分子标记物特性执行分类功能。例如，可以构造包括大量特征值的分类器，这些特征值包括分子标记物划分特征、形态特征、光度特征、离散结构特征、马尔可夫链结构特征、非马尔可夫链结构特征、分形结构特征和扫描宽度结构特征。
一次分类器典型功能是将感兴趣对象分解为3个子类(1)包含诊断信息的细胞，上述诊断信息包括分子标记物和它们与疾病相关的划分；(2)有炎症的细胞；和(3)伪影。通过整合特征值选择的双值决策树，一次分类器能够影响逐个细胞的分类。
如上所述，本发明从伪影中辨别细胞和细胞核以及从其他正常细胞中辨别具有与疾病相关的分子标记物划分的细胞的系统性能依赖于分类器根据计算的特征值产生差别的能力。例如，为了从异常细胞(也就是，诊断细胞)中识别正常细胞，本发明可以应用多种不同的判别函数，上述每一个判别函数被训练以识别对象的特殊类型以及在分子标记物表达和/或划分中的特殊改变。
二次分类器对由一次分类器选择的细胞样本中的细胞进行分类，而且在执行分类功能中也使用双值决策树和特征值。二次分类器能够认为是逐样本的分类器，分析由一次分类器分类的细胞并将样本分为与具有癌症相关的特征或不具有癌症相关特征。和一次分类器一样，被构造的二次分类器根据一组优选的分子标记物划分辨别细胞。
分类器包括至少一个判别函数，其中判别函数使用源自射线照相的特征对样本中感兴趣的细胞分类，上述特征包括但不局限于分子标记物表达和划分及选自下面组中的特征，该组包括面积、平均半径、光密度(OD)方差、OD偏度、OD值域、OD平均值、OD最大值、光斑密度、高平均距离、中/高平均距离、相关、均匀性、熵、分形维数、结构、点特征(punctateness)、连通分量、最近邻分析和空间密度频率间隔的各种谐频。
现在参考图10，该图示意性地表示确定分子探针划分的示例过程。在第一个步骤94中，从投影图像或3D重构图像中提取特征。在步骤95中，例如使用已知的边缘查找技术确认感兴趣对象内的边缘、分界线、边界、区域、表面和体积。在从投影图像或3D重构图像中提取特征之后，特征在步骤96中被用于查找感兴趣对象，和上面图9中描述的分类系统可以实现的一样。在步骤97中，已经确定的感兴趣对象，与感兴趣对象相关的分子探针密度被映射为相应的对象，作为步骤98中探针划分的度量标准。例如，与感兴趣对象X相关的探针A的浓度将作为与上述对象相关的靶分子浓度的度量标准，并且同样作为细胞内目标的划分。
现在参考图11，图11是示意性地表示细胞内划分的例子。在最简单的情况下，细胞1能够被分成两个区室，细胞质区室18和细胞核区室19。在细胞的细胞质或细胞核区室里分子标记物能够被划分。在另一个例子中，细胞质区室能够进一步分成其他区室，诸如线粒体，内质网和溶酶体。在另外一个例子中，诸如核仁的细胞器能够被定义为位于细胞核部分内的区室。在另外一个例子中，诸如浓缩的染色体36的过渡结构能够被定义为区室。本领域的技术人员认同任何能够在细胞间隙定位的分子结构能够被定义为区室。
现在参考图12，图12示意性地表示细胞检测方法的框图，上述细胞具有与恶性肿瘤和/或包括癌症在内的疾病相关的分子标记物划分。
该方法包括1、在步骤100中，获取具有多个细胞的细胞样本并在溶液中悬浮多个细胞；2、如果需要，在步骤102中对细胞样本中的多个细胞固定；3、在步骤103中，在多个细胞中用标记的分子探针或染色标记至少一个分子标记物；4、在步骤104中，用至少一个点光源照亮至少多个细胞中的至少一个细胞；5、在步骤105中，用数字阵列检测器获取通过至少一个细胞的至少两个不同的投影图像；6、在步骤106中，对至少两个投影图像进行照射偏差补偿；
7、在步骤107中，分析至少两个投影图像以检测至少一个具有密度和位置特征的被标记的分子标记物；8、在步骤108中，分析至少一个细胞内的至少一个分子标记物的位置；9、在步骤109中，通过使用密度和位置特征，测量至少一个标记分子标记物的划分；和10、在步骤110中，用至少一个分类器分析至少一个标记分子标记物的划分，用于恶性肿瘤和/或与分子标记物划分相关的疾病的检测。
在一个典型实施方案中，对至少两个投影图像进行照射偏差补偿的步骤106可以使用传统的光学和图像处理技术实现。步骤107中的分析至少两个投影图像以检测至少一个具有密度和位置特征的标记的分子标记物，可以使用已公开的美国专利6,519,355中描述的技术实现，美国专利6,519,355的发明人为Alan C.Nelson，于2003年2月11日公开，其标题为“光学投影成像系统和用于自动检测细胞核和细胞质密度特性与疾病相关的细胞的方法”，该技术包括在这里作为参考。
步骤108，分析至少一个细胞内的至少一个分子标记物的位置，可以使用共同未决的美国申请号10/147,154中描述的技术实现，该专利由发明人Alan C.Nelson于2002年5月13日提出申请，标题为“使用瞬时标志(temporal signatures)发射计算的层析成像的方法和设备”，该技术包括在这里作为参考。
步骤109，测量划分，可以有利地包括分析由至少一个被标记的分子标记物形成的密度特性结构，上述分子标记物位于重合边界曲面内，上述重合边界曲面位于至少两个投影图像内。进一步，测量划分的步骤可以有利地包括比较在至少两个投影图像内的边界面以确定位于至少两个投影图像之间的一组重合边界面。测量划分的步骤仍可以进一步有利地包括在重构的3D空间内至少两个标记的标记物的协同定位。测量划分的步骤仍可以进一步有利地包括在重构的2D空间内至少两个标记的标记物的协同定位。例如，测量划分的步骤仍可以进一步有利地包括使用上述Nelson美国申请号10/147,154中的技术，分析至少两个彼此相关的被标记的标记物的密度特性的结构。
在优选的实施方案中，和用FOT识别的一样，一个区室可以是在细胞内具有边界的任何3维空间。细胞样本可以是人体肺组织标本、人体子宫颈组织标本、血液标本或者可以包括稀有细胞。在一个实施例中，识别分子标记物划分的样本染色包括用anti-pRb抗体与细胞发生反应。在另一个实施例中，对甲基CpG有特异性的结合蛋白可以用于甲基化DNA染色。
本发明的系统对于分析各种类型生物细胞很有帮助。在一个实施例中，感兴趣细胞能够被选择用来诊断癌症，和/或感兴趣细胞可以有利地是未扩散的癌细胞。感兴趣细胞可以包括扩散的癌细胞，在扩散的癌细胞中感兴趣细胞被用于筛选癌症患者。感兴趣细胞也可以被用于确定患者是否将会发生癌变。癌细胞能够来自上皮组织癌。或者另外的，扩散前的癌细胞能够源自上皮组织。上皮组织癌可以有利地选自由肺和喉癌、宫颈和卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌和胃肠道癌组成的组。
在另一个实施方案中，通过在大量取自患有肺癌的个体的光谱样本中测量标记物的划分确定与分子标记物划分相关的疾病，并比较这些分子标记在正常个体中的划分，确定哪个分子标记具有可区分这两类的划分，所述标记物包括但不限于pRb、p53/53BP1、SAM68、PTEN、E2F和c-myc。其它分子标记也能够以同样方式筛选与划分相关联的疾病。
这里详细描述了本发明，以便符合专利法的要求，并向本领域技术人员提供使用本发明新颖的原理所需要的信息，以及构建和使用这种示例和所需要的特定的部分。不过，应当理解，本发明可以用特定的不同的装置实现，并且设备和重构算法、它们的各种变形，以及该装置的详细内容和操作过程都可以在不脱离本发明的实际精神和范围下实现。
权利要求
1.一种检测细胞的方法，所述细胞带有与恶性肿瘤和/或包括癌症的疾病相关的分子标记物划分，所述方法包括以下步骤a)获取具有多个细胞(1)的细胞样本，并将多个细胞悬浮在溶液中(100)；b)如果需要，固定细胞样本的多个细胞(102)；c)用标记的分子探针或染色剂在多个细胞中标定至少一个分子标记物(103)；d)用至少一个点光源照射多个细胞中的至少一个细胞(1)(104)；e)用数字阵列检测器通过至少一个细胞(1)获取至少两个不同的投影图像(105)；f)对至少两个投影图像的照射变化进行补偿(106)；g)分析所述至少两个投影图像，以检测至少一个具有密度测定和位置特征的被标记的分子标记物(107)；h)分析至少一个分子标记物在至少一个细胞中的位置(1，108)；i)通过用密度测定和位置特征测量所述至少一个被标记的分子标记物的划分(109)；和j)用至少一个分类器分析所述至少一个被标记的分子标记物的划分，用于检测与分子标记物划分相关联的恶性肿瘤和/或疾病(110)。
2.如权利要求1所述的方法，其中获取至少两个不同投影图像的步骤(105)进一步包括操作光学层析成像系统获取至少两个投影图像。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的光学层析成像系统包括流动光学层析成像系统。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的细胞采样包括选自由痰液、支气管—肺泡灌洗液、尿液、子宫刮取物和吸取物，乳头吸取物、乳头灌洗液，粪便、来自靶器官和血液中的细针状体灌洗液组成的组中的至少一个独立样本。
5.如权利要求1所述的方法，进一步包括从多个细胞(1)中剥离细胞质(18)的步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由肺癌、膀胱癌、宫颈癌，乳腺癌，结肠癌、直肠癌、膀胱癌、卵巢癌和血细胞癌组成的组。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述的分子探针选自由生色团、荧光、产生生色团的酶和产生荧光的酶标记的抗体、特定结合蛋白、外源凝集素、核酸探针组成的组。
8.如权利要求1所述的方法，其中至少一个被标记的分子标记物选自由pRb、p53/53BP1、E2F、PTEN、SAM68、BRCA1、c-myc和甲基CpG组成的组。
9.如权利要求1所述的方法，其中至少一个被标记的分子标记物表明在取自患有癌症的个体的细胞(1)或细胞核(19)与取自未患有癌症的个体的细胞(1)或细胞核(19)之间的不同划分。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包括使用图像分析重构至少一个细胞区室(18，19，36)的边界表面(12，13)，其中细胞区室内出现至少一个被标记的分子标记物。
11.如权利要求1所述的方法，其中测量划分的步骤进一步包括分析由至少一个被标记的分子标记物形成的密度特性的结构的步骤，上述分子标记物位于重合边界表面(12，13)内，上述重合边界表面位于至少两个投影图像内。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括比较至少两个投影图像内的边界表面(12，13)，以确定位于至少两个投影图像之间的一组重合边界表面(12，13)的步骤。
13.如权利要求1所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括在重构的3D空间内确定至少两个被标记的标记物的共同定位的步骤。
14.如权利要求1所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括在2D空间确定至少两个被标记的标记物的共同定位的步骤。
15.如权利要求1所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括分析至少两个彼此相关的被标记的标记物的密度特征结构的步骤。
16.如权利要求11所述的方法，其中密度特征结构选自由光密度(OD)变化、OD偏斜、OD范围、OD平均值、OD最大值、光斑密度、高平均距离、中/高平均距离、相关、均匀性、熵、分形维数(fractaldimension)、点特征(punctateness)、最近邻分析、连通分量、最近邻分析和空间密度频率间隔的各种谐频组成的组。
17.如权利要求13所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括通过共同定位标记有甲基CPG结合蛋白和核酸探针的甲基CPG和对靶基因的助催化剂区域具有特异性的DNA序列，检测肿瘤抑制剂基因的助催化剂区域的甲基化CpG细胞群的步骤。
18.如权利要求14所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括通过共同定位标记有甲基CPG结合蛋白和核酸探针的甲基CPG和对靶基因的助催化剂区域具有特异性的DNA序列，检测肿瘤抑制剂基因的助催化剂区域的甲基化CpG细胞群的步骤。
19.一种检测细胞的方法，所述细胞带有与恶性肿瘤和包括癌症的疾病相关的分子标记物划分，所述方法包括以下步骤a)取具有多个细胞(1)的细胞样本，并将多个细胞悬浮在溶液中(100)；b)如果需要，固定细胞样本的多个细胞(102)；c)用标记分子探针或染色剂在多个细胞中标记至少一个分子标记物(103)；d)用至少一个点光源照射多个细胞中的至少一个细胞(1)(104)；e)用数字阵列检测器获取通过至少一个细胞(1)的至少一个投影图像(105)；f)对至少一个投影图像的照射变化进行补偿(106)；g)分析至少一个投影图像，以检测至少一个被标记的分子标记物(107)；h)分析在至少一个细胞(1)中至少一个分子标记物在二维(2D)空间中的位置(108)；i)通过使用密度测定和位置特征测量所述至少一个被标记的分子标记物的划分(109)；和j)用至少一个分类器分析所述至少一个被标记的分子标记物的划分，用于检测与分子标记物划分相关联的恶性肿瘤和/或疾病(110)。
20.如权利要求19所述的方法，其中获取至少一个投影图像的步骤(105)进一步包括操作光学层析成像系统获取至少两个投影图像。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的光学层析成像系统包括流动光学层析成像系统。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述的细胞采样包括选自由痰液、支气管—肺泡灌洗液、尿液、子宫刮取物和吸取物，乳头吸取物、乳头灌洗液，粪便、来自靶器官和血液中的细针状体灌洗液组成的组中的至少一个独立样本中。
23.如权利要求19所述的方法，进一步包括从多个细胞(1)中剥离细胞质(18)的步骤。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述癌症样本选自由肺癌、膀胱癌、宫颈癌，乳腺癌，结肠癌、直肠癌、膀胱癌、卵巢癌和血细胞癌组成的组中。
25.如权利要求19所述的方法，其中所述的分子探针选自由生色团、荧光、产生生色团的酶和产生荧光的酶标记的抗体、特定结合蛋白、外源凝集素、核酸探针组成的组。
26.如权利要求19所述的方法，其中至少一个被标记的分子标记物选自pRb、p53/53BP1、E2F、PTEN、SAM68、BRCA1、c-myc和甲基CpG组成的组。
27.如权利要求19所述的方法，其中至少一个被标记的分子标记物表明在取自患有癌症的个体的细胞(1)或细胞核(19)与取自未患有癌症的个体的细胞(1)或细胞核(19)之间的不同划分。
28.如权利要求19所述的方法，进一步包括使用图像分析重构至少一个细胞区室(18，19，36)的边界表面(12，13)，其中细胞区室内出现至少一个被标记的分子标记物。
29.如权利要求19所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括在2D空间确定至少两个被标记的标记物的共同定位的步骤。
30.如权利要求19所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括分析至少两个彼此相关的被标记的标记物的密度特征结构的步骤。
31.如权利要求26所述的方法，其中密度特征结构选自由光密度(OD)变化、OD偏斜、OD范围、OD平均值、OD最大值、光斑密度、高平均距离、中/高平均距离、相关、均匀性、熵、分形维数、点特征、最近邻分析、连通分量、最近邻分析和空间密度频率区域的谐频组成的组。
32.如权利要求31所述的方法，其中测量划分的步骤(109)进一步包括通过共同定位标记有甲基CPG结合蛋白和核酸探针的甲基CPG和对靶基因的助催化剂区域具有特异性的DNA序列，检测肿瘤抑制剂基因的助催化剂区域的甲基化CpG细胞群的步骤。
全文摘要
用带有与恶性肿瘤和/或包括癌症的疾病相关的分子标记物划分检测细胞，通过以下步骤获取具有多个细胞(1)的细胞样本，并将多个细胞悬浮在溶液中(100)；所述细胞被固定(102)；用带标记的分子探针标记分子标记物(103)；用点光源照射细胞(1)(104)；和用数字阵列检测器获取不同的投影图像(105)；对投影图像的照射变化进行补偿(106)；和进行分析，以检测具有密度测定和位置特征的分子标记物(107)；分析分子标记物的位置(108)；通过使用密度测定和位置特征测量所述至少一个被标记的分子标记物的划分(109)；和用至少一个分类器分析所述至少一个被标记的分子标记物的划分，用于检测与分子标记物划分相关联的恶性肿瘤和/或疾病(110)。
文档编号G06T11/00GK1653480SQ03810807
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月3日 优先权日2002年5月14日
发明者周志伟, A·C·尼尔森, R·W·韦伯斯特 申请人:维森盖特有限公司