可在温和硫解条件下释放的聚合物共轭物的制作方法

专利名称:可在温和硫解条件下释放的聚合物共轭物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含可裂解地连接到来自含胺或含羟基化合物(例如药物或蛋白质)的配体上的脂质或亲水聚合物(例如聚乙二醇)的共轭物。该共轭物可以在温和硫解条件下裂解以使含胺或含羟基化合物以其原生形式再生。
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背景技术：
亲水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，已经用于各种底物(例如多肽、药物和脂质体)的改性，以降低底物的免疫原性和/或改进其血液循环寿命。例如，不经肠道施用的蛋白质可以是致免疫性的并可以在体内迅速降解。因此，难以实现蛋白质在患者体内的治疗有效的血含量。PEG与蛋白质的共轭已经被描述成是克服这些困难的一种途径。Davis等，在美国专利4,179,337中公开了PEG与蛋白质(例如酶和胰岛素)共轭以形成具有较低免疫原性但保持相当大比例的生理活性的PEG-蛋白质共轭物。Veronese等(Applied Biochem.and Biotech，11141-152(1985))公开了用氯甲酸苯酯活化聚乙二醇以改变核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等人，在美国专利4,766,106和4,917,888中公开了通过聚合物共轭使蛋白质溶解。美国专利4,902,502(Nitecki等)和PCT公开WO 90/13540(Enzon，Inc.)描述了PEG和其它聚合物共轭结合到重组蛋白质上以降低免疫原性并提高半衰期。
还描述了可将PEG用于改进脂质体的血液循环寿命(美国专利5,103,556)。使PEG共价连接到脂质的极性头部基团上以遮蔽或保护脂质体以防止被网状内皮组织系统识别和去除。
由于用聚合物使生物活性分子(例如蛋白质)改性通常降低了分子的活性，已经使用含可裂解键的蛋白质-聚合物共轭物。Garman(美国专利4,935,465)描述了用通过可逆连接基连接到蛋白质上的水溶性聚合物改性的蛋白质。还描述了含有可释放的PEG链的脂质体，其中在遇到合适的刺激(例如pH值的改变)时从脂质体中释放出PEG链(WO 98/16201)。
在一些情况下，聚合物从脂质体或分子中释放导致分子或脂质结构的改变。这些化学改性的结构可能在体内具有不可预测的潜在负面作用。
在美国专利6,342,244和6,214,330中描述了共轭措施——其中PEG-药物共轭物的裂解释放出药物。前者描述了二硫代苄基部分的裂解，此时释放出硫代醌甲基化物之类的副产物。后者描述了易水解芳基醚的裂解，此时释放出香豆素之类的副产物。
通常，需要提供下述可裂解共轭物——其中键在储存条件下稳定但是可以在活体内裂解以释放出原始形式的共轭分子，而不会形成不合意的副产物。

发明内容因此，本发明的一个目的是提供含有共价但可逆连接到亲水聚合物上的配体的共轭物。该配体来自含胺或含羟基化合物。在键裂解时，再生出原生形式的配体。
在一个方面，本发明包括具有通式I的共轭物 其中RiX是含胺或含羟基的配体，以使X是氧、伯氮或仲氮；M选自顺式-CRb＝CRc-、-CRbRd-和-CRbRd-CRcRe-，其中Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、甲基、取代甲基、氟基和氯基，其中甲基可以被羟基、氟基或氯基取代；D-形结构代表五元或六元环——M和二硫化物基团S-S以顺式-1，2-或邻位方位连接到该五元或六元环上；Ra代表环上的氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、卤素、和另一稠合环的一个或多个取代基，其中R是C1-C6烃基，其可以进一步被卤素取代；且L是直链或支链C1-C6烷基，其可以进一步被芳基或芳烷基取代；其中L和Ra可以一起形成环；且其中共轭物进一步包含，连接到L、连接到Ra、或连接到五元或六元环上的脂质或亲水聚合物。
所述共轭物典型地包含连接到L或连接到Ra上的亲水聚合物。在所选实施方式中，L和Ra不形成环。
所述亲水聚合物可以是例如，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚(羟丙基)噁唑啉、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚(羟丙基)甲基丙烯酸酯、聚(羟乙基)丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚丙二醇、聚天冬酰胺、及上述物质的共聚物；优选的亲水聚合物是聚醚，例如聚乙二醇。
优选地，五元或六元环是芳环，更优选苯环。在一个具体实施方式
(其中M是顺式-CRb＝CRc-)中，共轭物具有结构Ia 在该具体实施方式
中，Rb和Rc各自优选为氢。优选地，亲水聚合物连接到L上并且不连接到Ra上。
Ra可以是，例如，氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、氟基、氯基的单个取代基，其中R是C1-C6烃基，其可以进一步被卤素取代。优选地，Ra是氢或选自R、OR、C(O)OR、C(O)OH、氰基、硝基、氟基和氯基的单个取代基，其中R是甲基或乙基。在所选实施方式中，Ra是氢。
优选地，L具有结构-CR3R4-CR5R6-，以使-CR3R4连接到二硫化物基团上，其中R3和R4独立地选自H、烷基、芳基和芳烷基，且R5和R6独立地选自H和甲基。优选地，R3和R4各自独立地选自氢、甲基、乙基和丙基。更优选地，R4是H且R3选自氢、甲基、乙基和丙基。在所选实施方式中，R4是H且R3选自CH3、C2H5和C3H8。
在上述结构I的一个具体实施方式
中，L和Ra以顺式-1，2-或邻位方位连接到五元或六元环上，并且L和Ra一起形成另一五元至七元环。在这些具体实施方式
中，亲水聚合物连接到五元或六元环(也就是“D形结构”，优选为苯环)上或者其可以连接到由L和Ra形成的另一五元至七元环上。
R1X所代表的配体通常是脂质或生物活性化合物。在所选实施方式中，该配体是含胺的配体，其可以是，例如，多肽、含胺的药物、或含胺的脂质。含胺的脂质优选为含有双烃尾部基团的磷脂。当配体来自多肽时，该多肽可以是，例如，酶或细胞因子。
在相关方面，本发明提供了可通过含胺或含羟基的分子与具有结构II的化合物的反应获得的共轭物 其中Z是可被羟基或氨基替代的离去基团；M选自顺式-CRb＝CRc-、-CRbRd-和-CRbRd-CRcRe-，其中Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、甲基、取代甲基、氟基和氯基，其中甲基可以被羟基、氟基或氯基取代；D-形结构代表五元或六元环——M和二硫化物基团S-S以顺式-1，2-或邻位方位连接到该五元或六元环上。
Ra代表环上的氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、卤素、和另一稠合环的一个或多个取代基，其中R是C1-C6烃基，其可以进一步被卤素取代；且L是直链或支链C1-C6烷基，其可以进一步被芳基或芳烷基取代；其中L和Ra可以一起形成环；且其中该化合物进一步包含，连接到L、连接到Ra，或连接到五元或六元环上的脂质或亲水聚合物。
结构II的优选实施方式，也就是在变量M、L和Ra方面，和脂质或亲水聚合物，相当于上文对于结构I所述的那些。例如，在一个具体实施方式
中，该化合物具有结构IIa，其中所述五元或六元环是苯环，且M是顺式-CRb＝CRc-。
离去基团Z优选选自氯化物、对硝基苯酚、邻硝基苯酚、N-羟基四氢邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基戊二酰亚胺、N-羟基降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺、1-羟基苯并三唑、3-羟基吡啶、4-羟基吡啶、2-羟基吡啶、1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑、咪唑、三唑、N-甲基咪唑、五氟苯酚、三氟苯酚和三氯苯酚。
在另一方面，本发明提供了通过对血流施用具有如上所述的结构I的共轭物来对血流施用含胺或含羟基的分子R2XH的方法，由此通过共轭物的体内硫解裂解反应从共轭物中释放出分子R2XH。所述共轭物的优选实施方式如上所述。该方法进一步包括通过检测由裂解反应释放出的荧光部分来监测分子的释放。
在进一步方面，本发明提供了含有亲水聚合物链表面涂层并包含具有如上所述的结构I(其中R1X代表含胺或含羟基的脂质，优选磷脂)的脂质-聚合物共轭物的脂质体。结构I中其它变量的优选实施方式如上所述。所述脂质体可以包括装入的治疗剂。在相关方面，本发明提供了脂质体组合物，其包含这种脂质体并进一步包含稳定连接到亲水聚合物上的形成泡囊的脂质。优选地，连接到亲水聚合物上的脂质的总摩尔百分比为1％至大约20％。在脂质体组合物的一个优选实施方式中，稳定连接到形成泡囊的脂质上的亲水聚合物比结构I的共轭物中所含的聚合物短。
本发明还提供了包含上述共轭物和药学可接受载体(例如盐水、缓冲剂或类似物)的组合物。
联系附图阅读本发明的下列详述时，可以更充分理解本发明的这些和其它目的和特征。
图1显示了按照本发明的一个具体实施方式
的共轭物，其中二硫代肉桂酰基(DTC)连接甲氧基-聚乙二醇(mPEG)部分和含胺的配体；图2显示了用于mPEG-DTC-NHS酯共轭物合成的合成反应图式；图3显示了图1的mPEG-DTC-蛋白质共轭物的硫解裂解，和所得产物；且图4显示了本发明的另一共轭物的硫解裂解，和所得产物。
具体实施方式I.定义本文所用的“多肽”是氨基酸(具体长度不限)的聚合物。由此，例如，术语肽、寡肽、蛋白质和酶包括在多肽的定义内。该术语还包括多肽的表达后改性，例如糖基化、乙酰化、磷酸化和类似作用。
本文所用的“亲水聚合物”是指含有水溶性部分的聚合物，这使聚合物在室温下具有一定程度的水溶性。示例性亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚丙二醇、聚天冬酰胺、上述聚合物的共聚物、和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物。在美国专利5,395,619和5,631,018中描述了这些聚合物中许多的性能和反应。
“包含反应性官能团的聚合物”或“包含连接用键的聚合物“是指通常(但不是必须)在末端部分已经改性以与另一化合物反应形成共价键的聚合物。用于使聚合物官能化以含有这种反应性官能团的反应图式容易由本领域技术人员确定和/或已经在例如美国专利5,613,018；Zalipsky等人，Eur.Polymer.J.19(12)1177-1183(1983)；Zalipsky等人，Bioconj.Chem.4(4)296-299(1993)中公开。
本文所用的“烷基“是指由链烷通过从任何碳原子上去除氢原子而生成的并具有式CnH2n+1的基团。通过从未分支链烷的末端碳原子上去除氢原子而生成的基团构成普通烷基(正烷基)这一子类H[CH2]n。基团RCH2-、R2CH-(R不等于H)和R3C-(R不等于H)分别代表伯、仲和叔烷基。
“低碳烷基”是指含有1-6，更优选1-4个碳原子的烷基。
“烃基”包括由碳和氢构成的基团；也就是烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基和非杂环芳基。
“芳基”是指含有单环(例如苯基)、两个稠环(例如萘基)或三个稠环(例如蒽基或菲基)的取代或未取代单价芳族基团。该术语通常包括杂芳基，其是在环中含有一个或多个氮、氧或硫原子的芳环基团，例如呋喃基、吡咯、吡啶基和吲哚。“取代的”是指芳基中的一个或多个环氢被卤化物(例如氟、氯或溴)取代；被含有一个或两个碳原子的低碳烷基取代；或被硝基、氨基、甲基氨基、二甲基氨基、甲氧基、卤代甲氧基、卤代甲基或卤代乙基取代。
“芳烷基”是指进一步被芳基取代的低碳烷基(优选C1-C4，更优选C1-C2)取代基；例子是苄基和苯乙基。
“脂族二硫化物”键是指R’-S-S-R”形式的键，其中R’和R”各自是直链或支链烷基链，它们可以被进一步取代。
本文所用的“稳定的”键是指包含下述官能团的键——这些官能团在体内比本文所述的二硫化物键稳定得多。例子包括，但不限于，酰胺、醚和胺。
“形成泡囊的脂质”是指具有疏水和极性头部基团部分的两亲脂质，其可以在水中自发形成双层泡囊(以磷脂为例)，或稳定地并入脂质双层体中，其中疏水部分与双层膜的内部疏水区域接触，并且极性头部基团部分朝向膜的外部极性表面。这种形成泡囊的脂质通常包括一个或两个疏水酰基烃链或类固醇基团，并可以在极性头部基团上包含化学反应性基团，例如胺、酸、酯、醛或醇。例子包括磷脂，例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)和神经鞘磷脂(SM)，其中两个烃链通常在长度上为大约14-22个碳原子，并具有不定的不饱和度。其它形成泡囊的脂质包括糖脂(例如脑苷脂和神经节苷脂)和甾醇，例如胆固醇。
II.本发明的储存稳定的体内可裂解共轭物
A.结构本发明提供了下述共轭物——其中诸如生物活性分子或脂质体的脂质组分之类的分子经由体内可裂解键连接到另一部分上。连接部分通常用以提高该分子的药理学性能；例如，用以降低免疫原性和/或提高给药后在体内的溶度或循环时间。该键随后在体内裂解，从而释放出处于其原始生物活性形式的该分子。
通常，共轭物包括连接到聚乙二醇(PEG)上的蛋白质或其它含胺或含羟基的分子。然而，可以在几乎任何两种含有合适官能团的分子之间形成共轭物，例如用于提高胃肠和BBB输送的脂质-蛋白质或脂质-药物共轭物，用在表面改性脂质体中的脂质-聚合物共轭物。
一方面，本发明提供了具有通式I的含二硫化物的共轭物，其如下所述连接到脂质或聚合物上 在该结构中，R1X代表含胺或含羟基的配体，以使X是氧、伯氮或仲氮，其来自在共轭物裂解后释放出的分子(例如R1XH或R1XH2)。该分子可以是生物活性化合物，例如蛋白质、多肽或小分子药物化合物。或者，该配体可以来自含胺的脂质，通常是磷脂，例如含有双烃尾部基团的磷脂酰乙醇胺。
式I中的“D”形结构代表五元或六元环。该环可以是饱和的，例如环己烷、环戊烷，或杂环，例如四氢呋喃、四氢吡喃、哌啶、吡咯烷、或吗啉。或者，该环可以是不饱和的，例如环己烯。优选地，该环是芳环，例如苯、萘、或蒽，并且更优选为苯。还包括杂芳环，其中一个或多个环原子(不包括与基团S-S和M连接的那些)被氮、氧或硫取代。优选的单环体系包括吡啶、嘧啶、2，4-咪唑、-噻唑和-噁唑，和2，5-吡咯、-呋喃和-噻吩。优选地，该环是碳环型环。最优选地，该环是苯环。
基团M和二硫化物基团(-S-S-)以顺式-1，2-或邻位方位连接到五元或六元环上。M本身选自顺式-CRb＝CRc-、-CRbRd-和CRbRd-CRcRe-，其中Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、甲基、取代甲基、氟基和氯基，其中甲基可以被羟基、氟基或氯基取代。优选地，Rb、Rc、Rd和Re独立地选自H和甲基；在一个具体实施方式
中，Rb、Rc、Rd和Re每一个各自是H。
在一个优选实施方式中，该环是苯环且M是顺式-CRb＝CRc-，产生结构Ia 参照结构I和Ia，Ra代表五元或六元环上的氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、卤素、和另一稠合环的一个或多个取代基，其中R是C1-C6烃基，优选C1-C4烃基，其可以进一步被卤素取代。卤素优选为氟基或氯基，且R优选包括0至2个卤素取代基。
优选地，当存在另一稠合环时，其含有5至7个环原子，优选5或6个环原子。可以包括任何稳定的稠环体系。例子包括，但不限于，萘、2，6-或2，7-苯并咪唑、-苯并噻唑和-苯并噁唑、2，4-或2，6-吲哚、喹啉、和5环或6环上的一个或多个非稠合碳原子被氮取代时的类似物。
在所选实施方式中，Ra如上所述是氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基和卤素的单个取代基，其中R如上所述。在进一步具体实施方式
中，Ra是氢或选自R、OR、C(O)OR、氰基、硝基、羧基、氟基和氯基的单个取代基，其中R是甲基或乙基。在一个具体实施方式
中，Ra是氢。
L代表直链或支链C1-C6烷基，其可以进一步被芳基取代。优选地，L具有结构-CR3R4-CR5R6-，以使-CR3R4连接到二硫化物基团上，其中R3和R4独立地选自H、烷基、芳基和芳烷基，且R5和R6独立地选自H和甲基。
在结构I中，L和Ra可以一起形成环，优选五元至七元环。在这种情况中，Ra和二硫化物基团(-S-S-)优选以顺式-1，2-或邻位方位连接到五元或六元环(在Ia中为苯环)上。
共轭物进一步包括连接到结构I中的L、连接到Ra，或连接到五元或六元环上的脂质或亲水聚合物；也就是，与配体R1X共轭连接的部分。在下列结构(i-iv)中给出可能的连接部位的例子，其中脂质或亲水聚合物被标为R2。例如，脂质或亲水聚合物可以如下列结构(i)中那样连接到L的末端，或者其可以直接(例如结构(ii))或经取代基Ra(例如结构(iv))连接到五元或六元环上。还包括下述具体实施方式
——其中Ra和L本身连接以形成环(结构(iii))，且R2连接到该环上(通常依靠与Ra或L的连接进行)。
在所选实施方式(例如，(i)和(ii))，Ra和L不形成环。在进一步实施方式中，R2连接到L的末端(下列结构(i))。
L是否连接到Ra上以形成环，这决定了共轭物在裂解时产生两个还是三个片段(其中之一是原生形式的分子R1XH或R1XH2)。如上述结构所示，在波形线代表最终裂解位置时，结构(i-ii)在裂解时产生三个片段，且共轭物(iii-iv)在裂解时产生两个片段。下面将更详细描述本发明的这一方面。
如下文进一步所论述，与二硫化物基团相邻的位置L的替换变体(例如，当L＝-CR3R4-CR5R6-时，R3和/或R4的替换)，可用于调节共轭物的裂解速率。例如，为了获得更快的裂解速率，R3和R4是氢。通过对R3和/或R4选择烷基、芳烷基或芳基以位阻二硫化物，可以实现较慢的裂解速率。优选地，R3和R4独立地选自氢和低碳(C1至C6)烷基。在所选实施方式中，R3和R4各自独立地选自氢、甲基、乙基和丙基。
脂质或亲水聚合物通常经稳定的连接基(例如酰胺、酯、氨基甲酸酯或其硫类似物，其中酰胺和氨基甲酸酯是优选的)连接到所述结构I上。经由这些连接基进行共轭连接的方法是本领域公知的。例如，在Zalipsky等人，1999，2001；Zalipsky，2002；Roberts等人，2002；Molineux，2002，2003；Harris等人，2003和其它来源中描述了经由这些基团将PEG与各种部分连接的方法。
亲水聚合物或脂质也可以包括通常连接到其自由末端上的导向部分。这些导向部分包括在共有美国专利6,660,525(其经此引用并入本文)中描述的那些。导向部分的非限制性例子包括抗体、叶酸酯，用以导向上皮癌和骨髓干细胞；磷酸吡啶氧基(pyridoxyl)酯、半乳糖、用以导向肝实质细胞；载脂蛋白，用以导向肝实质细胞和脉管内皮细胞；转铁蛋白，用以导向脑内皮细胞；VEGF，用以导向肿瘤上皮细胞；VCAM-1或ICAM-1，用以导向脉管内皮细胞；Mac-1，用以导向嗜中性白细胞和白细胞；HIV GP120/41或HIV GP120 C4 domain peptomers，用以导向CD4+淋巴细胞；纤连蛋白，用以导向活性血小板；骨桥蛋白，用以导向动脉粥样硬化斑中的内皮细胞和平滑肌细胞。
对于一些配体，例如具有各种官能侧基的多肽配体，多个聚合物R2可以共轭连接到配体上。它们可以经由单独或与在体内更稳定的键结合的上示多种结构I共轭连接。聚合物分子量的选择取决于连接到配体上的聚合物链的数量，其中当连接聚合物链的数量小时，通常选择较大分子量的聚合物，反之亦然。
图1显示了按照本发明的示例性共轭物的结构。该共轭物是上示结构Ia的具体实施方式
，其中Ra-Rc各自是氢。因此，该共轭物是以二硫代肉桂酸酯(DTC)结构为基础的。
该共轭物中的R2是亲水聚合物甲氧基-聚乙二醇(mPEG)，其可以表示成式CH3O(CH2CH2O)n，其中n优选为大约10至大约2300，这相当于大约440道尔顿至大约100,000道尔顿的分子量。聚合物分子量的选择在一定程度上取决于连接配体的选择。在配体来自用于脂质体中的含胺的脂质时的具体实施方式
中，PEG分子量的优选范围是大约750至大约10,000道尔顿，更优选为大约2,000至大约5,000道尔顿。在配体来自含胺的多肽时的具体实施方式
中，PEG分子量的优选范围是大约2,000至大约40,000道尔顿，更优选大约2,000至大约20,000道尔顿。可以认识到，R2可以选自多种亲水聚合物以及脂质。示例性聚合物如上所述。
在该共聚物中，L是-CR3R4-CR5R6-，其中R4-R6是氢且R3是变量。如上所述，R3可以是氢、烷基、芳基或芳烷基。该共轭物中的XR1是含伯胺的分子，例如药物或蛋白质。将mPEG经由氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)基团连接到L的末端。
B.合成图2显示了用于合成示例性PEG-蛋白质共轭物的示例性方法，在下述实施例1-6中也对其进行了描述。通过不同分子R1或聚合物R2的替换，或通过改变连接基和/或环上的取代，有机合成和生物共轭(bioconjugation)化学领域的技术人员可以容易地改变该方案。
如上所述，在一个优选实施方式中，与二硫化物连接的环是苯环，并且M包含顺式烯烃。通过按照已公开程序(Panetta和Rapoport，1982)在苯硫酚中添加原(ortho-)酸酯取代的炔，可以合成按照此具体实施方式
的顺式-巯基肉桂酸。使用这一程序如下文实施例1中所述由苯硫酚(1)和原丙炔酸三乙酯制备顺式-巯基肉桂酸(2)。
通过与在远端含有可用于进一步共轭连接的官能团(在此例子中是氨基)的链烷硫醇反应，实现图2中连接基L的连接。可以按照Owen，1967的方法由相应的氨基醇制备所述反应试剂，2-巯基丙胺盐酸盐(3，R＝CH3)。按照类似方式可以制备含有各种R基团的类似氨基烷基硫醇衍生物。
使氨基链烷硫醇与叠氮基羧酸二乙酯之类活化剂反应，然后与芳族硫醇反应，可以形成混合二硫化物(4)，例如可以按照Mukaiyama等人，Tetrahedron Letters 565907-5908(1968)的方法。或者，可以如S.J.Brois等人，J.Am.Chem.Soc.927629-31(1970)中所述，使用甲氧基羰基亚磺酰基氯与氨基链烷硫醇形成活性二硫化物。可以使活性二硫化物与芳族硫醇反应以形成二硫化物(4)(参看Zalipsky等人，1999)。
然后使用L的末端氨基进行R2部分的连接，在此情况下用于经由氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)键进行的PEG连接。这可以通过按照各种公开的规程(参看例如，Zalipsky和Menon-Rudolph，在“Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications”中，J.M.Harris&S.Zalipsky，eds.，Amer.Chem.Soc.，Washington DC，pp.318-341(1997))与mPEG-氯甲酸酯的反应实现。可以按照Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.15100(1992)，通过无水mPEG-OH溶液的光气化产生聚合氯甲酸酯。或者，可以也按照已知方法(参看例如，H.C.Chiu等人，Bioconjugate Chem.4290-295(1993)；Zalipsky等人，1992；以及Zalipsky与Menon-Rudolph，1997；均引自上文)，通过mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯与末端胺的反应形成该键。
然后按照标准方法使蛋白质(或要共轭连接的其它分子，例如含胺或含羟基的药物)共轭连接到自由羧基上。例如，可以使用碳二亚胺-介导的酯化程序(参看例如，G.W.Anderson等人，J.Amer.Chem.Soc.861839(1964))将该酸转化成其N-羟基琥珀酰亚胺酯(5)。或者，这可以使用反应试剂六氟磷酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓(R.Knorr等人，Tetrahedron Lett.30(15)1927-30(1989)；M.Wilchek等人，Bioconjugate Chem.5491(1994))实现。
有许多使蛋白质的氨基与N-羟基琥珀酰亚胺酯反应的通用规程。对于代表性程序，参看例如Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.15100(1992)或H.C.Chiu等人，Bioconjugate Chem.4290(1993)。
根据这些反应的各种参数，例如NHS试剂的量、蛋白质上氨基的数量、反应缓冲剂的pH值、温度、和反应持续时间，可以获得具有各不相同的PEG化(PEGylation)程度的多种蛋白质-聚合物共轭物类。如果需要，可以通过各种色谱分离技术分馏通式(mPEG)n-蛋白质的共轭物混合物。通常可以例如通过离子交换色谱法分离1∶1共轭物(也就是，n＝1时)。
与上述合成相关地，本发明还包括包含可通过含胺、含羟基或含羧基的化合物与具有通用结构式II的化合物的反应获得的共轭物的组合物 其中M、Ra和L如上所述，Z是离去基团，且化合物进一步包括如上所述连接到L、连接到Ra或连接到D-形结构所代表的五元或六元环上的脂质或亲水聚合物。
离去基团Z可通过与含胺或含羟基的配体化合物(例如DSPE、多肽或含胺的药物)的反应置换。根据配体化合物中置换基团的反应性选择离去基团。合适的离去基团包括氯化物、对硝基苯酚、邻硝基苯酚、N-羟基四氢邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基戊二酰亚胺、N-羟基降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺、1-羟基苯并三唑、3-羟基吡啶、4-羟基吡啶、2-羟基吡啶、1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑、咪唑、三唑、N-甲基咪唑、五氟苯酚、三氟苯酚和三氯苯酚。通常，这种反应形成连接到配体上的酯或酰胺键。
C.共轭物的裂解如上所述，通过二硫化物键的裂解引发共轭物的裂解。这通过由半胱氨酸或谷胱甘肽之类外源反应试剂引发的硫解机制在体内产生。可以通过改变与二硫化物基团相邻的连接基的结构来调节裂解速率，并可以使用下述方法在体外估算裂解速率。
裂解反应可以根据共轭物的结构最初产生两种或三种裂解产物。例如，图3显示了图1的mPEG-DTC-(NH-配体)共轭物在三片段裂解反应中的硫解裂解机制。例如在存在半胱氨酸(如图所示)或其它天然形成的还原剂的情况下，使邻二硫代肉桂酰基部分的二硫化物基团硫解裂解。也可以施用外源还原剂以人为引发足以使共轭物裂解和分解的硫解条件或促进裂解。
如图3中所示，在裂解时，在五元或六元环(此处是苯环)上生成的硫醇基团在闭环反应中置换了来自酰胺部分的含胺的配体。含胺的化合物以其天然未改性形式再生。R2，或在此例子中是mPEG，仍然连接到L上，其现在共轭连接到含硫醇的裂解试剂，半胱氨酸上。在闭环反应中形成的第三种实体是已知的稳定的化合物硫代香豆素，或其衍生物，这取决于共轭物的替换。
图4显示了在L和Ra连接时的具体实施方式
中的共轭物裂解，产生两片段裂解。在图1C的具体实施方式
中，再次在二硫代肉桂酰基上构造共轭物。如上文结构(iv)中那样，R2连接到芳环上。例如，R2可以是如图1中所示经由氨基甲酸酯连接的PEG。
或者，R2可以如上文结构(iii)中那样连接到L-Ra环上。在裂解时，通过类似机制，共轭分子再以其原生形式(例如R1NH2)释放。第二种片段是既连接到裂解试剂的残基(图4种以半胱氨酸表示)上又连接到聚合物或其它基团R2上的硫代香豆素衍生物。
通过用生理学上存在的硫醇(例如半胱氨酸、谷胱甘肽或清蛋白)培养，可以验证共轭物在生理相关条件下的硫解裂解。(S.Zalipsky等，Proceed.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.2873(2001))。可以通过SDS-PAGE监测自由蛋白质或其它释放分子的生成。通过在共轭物随时间消失时测量其浓度，或通过在自由蛋白质(或其它释放分子)出现时对其进行测量，可以跟踪监测反应速率。由于硫代香豆素衍生物通常被描述成是发色的，通常也容易检测释放的硫代香豆素或其衍生物。可以通过荧光色谱法观察硫代香豆素的释放速率。
如果共轭分子在共轭形式下是非生物活性的，可以通过观察生物活性的恢复来监测裂解(参见S.Zalipsky等，“Reversible PEGylationThiolytic regeneration of active protein from its polymer conjugates”，inPeptidesThe Wave of the Future，M.Lebl和R.A.Houghton，eds.，Amer.Peptide Soc.，2001，p.953；R.B.Greenwald等，Bioconjugate Chem.14395(2003))。通过提高与二硫化物键相邻的R基团的尺寸(例如从甲基变成异丙基，叔丁基等)，可以明显降低硫解裂解的速率。
当在无还原剂的情况下储存时，本共轭物提供了稳定性益处，并且在存在合适还原剂(例如硫醇)的情况下以药学适用的速率裂解。储存稳定性特别优于在Greenwald等，美国专利6,214,340中所述的共轭物，后者是以可裂解苯基酯为基础的。这些酯通常以高于烷基酯的速率进行水解(参看例如，Quick等人，1978；Blay等人，1988；1992年3月)。这种水解会在环境储存条件下产生，而这对于还原性裂解而言是极不可能的。
III.受试共轭物的示例性应用A.包含本发明的mPEG-脂质共轭物的脂质体组合物在一个具体实施方式
中，含胺的配体化合物是含胺的脂质。本文所说的脂质是指通常含有至少一个有至少大约8个碳原子的烃链(“尾部”)，更优选有大约8-24个碳原子的酰基烃链的水溶性分子。优选的脂质是具有含胺的极性头部基团和酰基链的脂质。示例性脂质是含有一个酰基链(例如硬脂酰基胺)或两个酰基链的磷脂。具有含胺的头部基团的优选磷脂包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸。磷脂尾部优选含有大约12至大约24个碳原子，并可以是完全饱和或部分不饱和的。一种优选的脂质是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)；然而，本领域技术人员会想到在此描述范围内的多种脂质。还可以认识到，脂质显然可以包括胺基团或可以通过衍生而包括胺基团。不包括上述烃链的其它脂质部分(例如胆固醇胺)也是合适的。
在一个具体实施方式
中，本发明的共轭物可以配制成脂质体。脂质体是用于各种治疗目的，并特别用于通过全身给药将治疗剂带到目标区域或细胞中的封闭脂质泡囊。特别地，含有亲水聚合物链(例如聚乙二醇(PEG))表面涂层的脂质体是合意的药物载体，因为这些脂质体提供了与不含聚合物链的脂质体相比延长的血液循环寿命。聚合物涂层中的聚合物链保护脂质体并在脂质体周围形成水溶剂化的聚合物的“硬刷”(“stiff brush”)。由此，聚合物充当对血蛋白的阻隔物，防止蛋白质结合并识别被巨噬细胞和网状内皮组织系统的其它细胞吸收并去除的脂质体。
通常，含有聚合物链表面涂层的脂质体是通过在脂质混合物中并入大约1至大约20摩尔％的脂质-聚合物共轭物而制得的。脂质-聚合物共轭物的实际量可以更高或更低，这取决于聚合物的分子量。
在各种具体实施方式
中，上述1至大约20摩尔％脂质中的聚合物链经由本文所示的可裂解连接结构连接到脂质上，或在一个优选的实施方式中，通过这些键与在体内更稳定的键的结合连接到脂质上。在这种情况下，较高分子量的聚合物链优选经由本文所示的可裂解连接结构连接，且较短聚合物链通过更稳定的键连接。
在其它优选实施方式中，一些或所有聚合物链在自由末端含有如上所述的导向(targeting)部分。
与含有通过脂族二硫化物键连接聚合物和脂质的聚合物-脂质共轭物的脂质体相比，含有本发明的聚合物-脂质共轭物的脂质体(优选地，其中的R3和/或R4(对于结构I，在L的定义中)不是氢)具有更长的血液循环寿命。
重要地，本发明的聚合物-脂质共轭物的裂解导致原始脂质以未改性形式再生。这是合意的，因为非天然的改性脂质可能具有不合意的体内效应。同时，当在无还原剂的情况下储存时，该共轭物是稳定的。
B.多肽共轭物在另一具体实施方式
中，本发明包括如上所述的共轭物，其中含胺的配体化合物是多肽。在用于制备本发明的聚合物-多肽共轭物的优选合成反应方案中，按照如实施例1-5中所述的合成途径制备如图2中在5所示的mPEG-DTC-离去基团化合物。离去基团可以是，例如，所示N-羟基琥珀酰亚胺、碳酸硝基苯酯、或上述其它基团之一。与二硫化物相邻的R基团可以是H、CH3、C2H5或类似基团，并根据二硫化物裂解的所需速率进行选择。然后将mPEG-DTC-NHS化合物5，或相当物，偶联到多肽的胺部分上以形成氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)键。
聚合物链(例如PEG)与多肽的连接通常使酶或其它生物活性(例如多肽的受体结合)变小。然而，多肽的聚合物改性提供了提高多肽的血液循环寿命的益处。在本发明中，对对象施用聚合物-多肽共轭物。当共轭物循环时，与生理性还原条件(例如血半胱氨酸和其它体内硫醇)的接触引发亲水聚合物链从多肽上裂解。当从多肽上释放出聚合物链时，多肽的生物活性逐渐积聚。由此，多肽最初具有对体内分解足够的血液循环寿命，并且在聚合物链裂解时随时间经过重新获得其完全的生物活性。
一些或所有聚合物链可以在自由末端含有导向部分。
在各种具体实施方式
中，聚合物链经由本文所示的可裂解连接结构连接到多肽上，或通过这些键与在体内更稳定的键的结合连接到多肽上。后一种途径可以使PEG链通过可逆键连接到多肽中对生物活性而言所必须的氨基上，并通过更稳定的键连接到对肽活性而言非必须的氨基上。
可以认识到，上述任何亲水聚合物都预计可用。在优选实施方式中，聚合物是聚烷撑二醇，优选聚乙二醇(PEG)。根据多肽、多肽上反应性胺的数量、和聚合物改性的共轭物的所需尺寸，选择聚合物的分子量。
预计可用的多肽无限制，并可以是天然生成的或重组制成的多肽。小的人类重组多肽是优选的，并且10-30KDa范围内的多肽是优选的。示例性多肽包括细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素和干扰素；促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、酶和类似物。也考虑了病毒多肽，其中将病毒的表面改性以包含一个或多个经由本文所述的可裂解键连接的聚合物链。包含用于细胞转染的基因的病毒的改性会延长病毒的循环时间并降低其免疫原性，由此改进外源基因的输送。
C.含胺的药物共轭物在本发明的再一具体实施方式
中，上述结构I的含胺配体来自含胺的药物。用例如PEG进行的治疗药物改性，能有效改进药物的血液循环寿命并降低任何免疫原性。
按照上述任何反应方案，以提供特定药物所必须的改性制备共轭物。多种治疗药物都含有反应性胺部分，并且本发明不受任何限制地预计可用于任何这样的药物。例子包括丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素和ciprofloxacin。
实施例下列实施例进一步阐述本文所述的本发明并无论如何不限制本发明的范围。
实施例1.顺式巯基肉桂酸(2)的制备(参看图2)可以按照J.A.Panetta和H.Rapoport(J.Org.Chem.472626-2628(1982))公开的程序如下所述合成该化合物。
将新蒸馏的苯硫酚(1；见图2)、原丙炔酸三乙酯(按照H.Stetter等，Synthesis 207(1973)的程序制备)(3.27克，19毫摩尔)(1.6克，15毫摩尔)和特戊酸(1.6克，15毫摩尔)在10毫升对甲基异丙基苯中的溶液(2.0g，18mmol)在回流下加热26小时。去除溶剂，并将残留物在硅胶上使用己烷/醚(9/1)作洗脱剂进行色谱法分离，产生2.79克(75％收率)浅黄色液体状的2-巯基肉桂酸乙酯IR 3000，1720，1600，1495，1440cm-1；NMRδ7.65(d，1H)，7.1-7.45(m，4H)，5.55(d，1H)，4.05(q，2H)，1.15(t，3H)；MS对C11H12O2S计算m/e 208.0558(M+)，实测值208.0560。
将如上合成的2-巯基肉桂酸乙酯(1克，5.4毫摩尔)溶于10毫升95％乙醇，并加入KOH(0.75克，13.4毫摩尔)。将反应混合物在回流下加热2小时，然后冷却至25℃，并用5％HCl水溶液酸化。将水相用醚(3×20毫升)萃取，并将合并的有机馏分用水(20毫升)和盐水(20毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并浓缩以产生0.85克(87％)结晶肉桂酸2。M.p.128-129℃；UVλmax＝250nm(ε＝7350M-1.cm-1)，和275(9700)；NMRδ7.8(d，1H)，7.15-7.45(m，4H)，5.5(d，1H)；Anal.对C9H8O2SC，60.0；H，4.5；实测C，60.2；H，4.6。
实施例22-巯基丙基胺盐酸盐(3，R＝CH3)的制备由相应的氨基醇，例如按照T.C.Owen，J.Chem.Soc.C 1373-1376(1967)所述的程序，制备该化合物。简言之，将该化合物用硫酸酯化成硫酸氨基烷基酯，然后用二硫化碳和碱环化成噻唑烷硫酮，然后将其水解以制得产物。可以按照类似方式制备类似的含有各种R取代的氨基链烷硫醇衍生物。
二硫代肉桂酸(DTC)连接基的形成混合的二硫化物2-氨基丙基-二硫代肉桂酸(4)的合成按照T.Mukaiyama等，Tetrahedron Letters 565907-5908(1968)所述的程序，使2-巯基丙胺盐酸盐(3)(实施例2)与叠氮基羧酸二乙酯反应，然后与顺式巯基肉桂酸(2)(实施例1)反应，提供混合二硫化物(4)。或者，如S.J.Brois等，J.Am.Chem.Soc.927629-31(1970)中所述，可以使(3)与甲氧基羰基亚磺酰基氯反应以形成2-(甲氧基羰基二硫代)丙胺盐酸盐，然后与巯基肉桂酸(2)反应以形成混合二硫化物(4)(参看S.Zalipsky等，Bioconjugate Chem.10703-7(1999))。
实施例4mPEG-氨基甲酸乙酯-连接的二硫代肉桂酸(mPEG-DTC，5a)的合成使2-氨基丙基二硫烷基肉桂酸(4)(实施例3)与mPEG-氯甲酸酯反应，可以实现这种转化。参看例如，S.Zalipsky和S.Menon-Rudolphin Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications，J.M.Harris&S.Zalipsky，eds.，Amer.Chem.Soc.，Washington，DC，1997，pp.318-341。按照S.Zalipsky等，Biotechnol.Appl.Biochem.15100-114(1992)，通过无水mPEG-OH溶液的光气化，容易生成mPEG氯甲酸酯。
或者，按照H.-C.Chiu等，Bioconjugate Chem.4290-295(1993)；Zalipsky等，(1992)，引自上文；或引自上文的Zalipsky等，(1997)的程序，通过2-氨基丙基二硫烷基肉桂酸(4)(实施例3)与mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯的反应，可以形成氨基甲酸乙酯键。
实施例5mPEG-DTC NHS酯(5)的合成可以使用本领域已知的，例如如G.W.Anderson等，J.Amer.Chem.Soc.861839(1964)；R.Knorr等，Tetrahedron Lett.301927(1989)；或M.Wilchek等，Bioconjugate Chem.5491(1994)中所述的酯化程序，将mPEG-氨基甲酸乙酯-连接的二硫代肉桂酸(5a)转化成其N-羟基琥珀酰亚胺酯。
实施例6mPEG-DTC-蛋白质共轭物(6)的制备可以按照各种公开的程序，使N-羟基琥珀酰亚胺酯(5)与蛋白质的氨基，通常在中性或碱性pH(pH7-9)的水性缓冲剂中反应。对于代表性程序，参看例如，S.Zalipsky等，(1992)，如上所述；H.C.Chiu等，Bioconjugate Chem.4290(1993)。根据各种反应参数，例如mPEG试剂和蛋白质上的氨基的比率、反应缓冲剂的pH值、温度和反应持续时间，可以获得具有各不相同的PEG化(PEGylation)程度的多种共轭物类。可以通过各种色谱分离技术分馏通式(mPEG)n-蛋白质的共轭物混合物。通常可以通过离子交换色谱法提纯n＝1时的(mPEG)n-蛋白质共轭物。
实施例7mPEG-DTC-蛋白质共轭物的硫解裂解通过用生理学上存在的硫醇(例如半胱氨酸、谷胱甘肽或清蛋白培养共轭物，可以验证生物相关条件下随硫解产生的De-PEGylation(S.Zalipsky等，Proceed.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.2873(2001))。可以例如通过SDS-PAGE监测可裂解PEG-蛋白质共轭物转化成自由蛋白质的状况。通过在共轭物随时间消失时测量其浓度，或通过在自由蛋白质出现对其进行测量，可以跟踪监测反应速率。如果共轭物由于PEG化而缺乏生物活性，可以测量蛋白质在裂解条件下生物活性恢复的时间过程(S.Zalipsky等，Reversible PEGylationThiolyticregeneration of active protein from its polymer conjugates，in PeptidesTheWave of the Future，M.Lebl和R.A.Houghton，eds.，Amer.Peptide Soc.，2001，p.953；R.B.Greenwald等，Bioconjugate Chem.14395(2003))。
尽管已经参照特定实施方式描述了本发明，但本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的情况下进行各种变动和修改。
权利要求
1.具有结构I的共轭物 其中R1X是含胺或含羟基的配体，以使X是氧、伯氮或仲氮；M选自顺式-CRb＝CRc-、-CRbRd-或CRbRd-CRcRe-，其中Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、甲基、取代甲基、氟基或氯基，其中甲基可以被羟基、氟基或氯基取代；D-形结构代表五元或六元环——M和二硫化物基团S-S以顺式-1，2-或邻位方位连接到该五元或六元环上；Ra代表环上的氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、卤素、或另一稠合环的一个或多个取代基，其中R是C1-C6烃基，其可以进一步被卤素取代；且L是直链或支链C1-C6烷基，其可以进一步被芳基或芳烷基取代；其中L和Ra可以一起形成环；且其中共轭物进一步包含，连接到L、连接到Ra，或连接到五元或六元环上的脂质或亲水聚合物。
2.根据权利要求
所述1的共轭物，其中所述L和Ra不形成环。
3.根据权利要求
2所述的共轭物，包含连接到L或连接到Ra上的亲水聚合物。
4.根据权利要求
2所述的共轭物，其中所述五元或六元环是芳环。
5.根据权利要求
4所述的共轭物，其中所述芳环是苯环，且M是顺式-CRb＝CRc-，以使共轭物具有结构Ia
6.根据权利要求
5所述的共轭物，其中所述Rb和Rc各自是氢。
7.根据权利要求
6所述的共轭物，包含连接到L上并且不连接到Ra上的亲水聚合物。
8.根据权利要求
7所述的共轭物，其中Ra是氢。
9.根据权利要求
5所述的共轭物，其中L具有结构-CR3R4-CR5R6-，以使-CR3R4连接到二硫化物基团上，其中R3和R4独立地选自H、烷基、芳基或芳烷基，且R5和R6独立地选自H或甲基。
10.根据权利要求
9所述的共轭物，其中R3和R4各自独立地选自氢、甲基、乙基或丙基。
11.根据权利要求
10所述的共轭物，其中R4是H且R3选自氢、甲基、乙基和丙基。
12.根据权利要求
1所述的共轭物，其中L和Ra以顺式-1，2-或邻位方位连接到五元或六元环上，并且L和Ra一起形成另一五元至七元环。
13.根据权利要求
12所述的共轭物，包含连接到五元或六元环上的亲水聚合物。
14.根据权利要求
12所述的共轭物，包含连接到所述另一五元至七元环上的亲水聚合物。
15.对血流施用含胺或含羟基的分子R2XH的方法，包括对血流施用具有下示结构的共轭物 其中R1X是含胺或含羟基的配体，以使X是氧、伯氮或仲氮；M选自顺式-CRb＝CRc-、-CRbRd-或CRbRd-CRcRe-，其中Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、甲基、取代甲基、氟基或氯基，其中甲基可以被羟基、氟基或氯基取代；D-形结构代表五元或六元环——M和二硫化物基团S-S以顺式-1，2-或邻位方位连接到五元或六元环上；Ra代表环上的氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、卤素、或另一稠合环的一个或多个取代基，其中R是C1-C6烃基，其可以进一步被卤素取代；且L是直链或支链C1-C6烷基，其可以进一步被芳基或芳烷基取代；其中L和Ra可以一起形成环；且其中共轭物进一步包含，连接到L、连接到Ra，或连接到五元或六元环上的脂质或亲水聚合物；由此通过所述共轭物的体内硫解裂解反应从所述共轭物中释放出所述分子R2XH。
16.根据权利要求
15所述的方法，其中L和Ra不形成环。
17.根据权利要求
16所述的方法，其中亲水聚合物连接到L或连接到Ra上。
18.根据权利要求
16所述的方法，其中五元或六元环是苯环，且M是顺式-CRb＝CRc-，以使共轭物具有结构Ia
19.根据权利要求
18所述的方法，其中亲水聚合物连接到L上并且不连接到Ra上。
20.根据权利要求
19所述的方法，其中Ra是氢。
21.根据权利要求
18所述的方法，其中L具有结构-CR3R4-CR5R6-，以使-CR3R4连接到二硫化物基团上，其中R3和R4独立地选自H、烷基、芳基或芳烷基，且R5和R6独立地选自H或甲基。
22.根据权利要求
21所述的方法，其中R3和R4各自独立地选自氢、甲基、乙基或丙基。
23.根据权利要求
15所述的方法，其中L和Ra以顺式-1，2-或邻位方位连接到五元或六元环上，并且L和Ra一起形成另一五元至七元环。
24.根据权利要求
23所述的方法，其中亲水聚合物连接到五元或六元环上。
25.根据权利要求
23所述的方法，其中亲水聚合物连接到所述另一五元至七元环上。
26.根据权利要求
15所述的方法，进一步包括通过检测由裂解反应释放出的荧光部分监测所述分子的释放。
27.含有亲水聚合物链表面涂层并包含具有结构I的脂质-聚合物共轭物的脂质体 其中R1X是含胺或含羟基的配体，以使X是氧、伯氮或仲氮；M选自顺式-CRb＝CRc-、-CRbRd-或CRbRd-CRcRe-，其中Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、甲基、取代甲基、氟基或氯基，其中甲基可以被羟基、氟基或氯基取代；D-形结构代表五元或六元环——M和二硫化物基团S-S以顺式-1，2-或邻位方位连接到该五元或六元环上；Ra代表环上的氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、卤素、或另一稠合环的一个或多个取代基，其中R是C1-C6烃基，其可以进一步被卤素取代；且L是直链或支链C1-C6烷基，其可以进一步被芳基或芳烷基取代；其中L和Ra可以一起形成环；且其中共轭物包含，连接到L、连接到Ra，或连接到五元或六元环上的亲水聚合物。
28.根据权利要求
27所述的脂质体，其中L和Ra不形成环，并且亲水聚合物连接到L上。
29.根据权利要求
27所述的脂质体，其中所述五元或六元环是苯环，且M是顺式-CRb＝CRc-，以使共轭物具有结构Ia
30.根据权利要求
29所述的脂质体，其中Ra是氢。
31.根据权利要求
29所述的脂质体，其中L具有结构-CR3R4-CR5R6-，以使-CR3R4连接到二硫化物基团上，其中R3和R4独立地选自H、烷基、芳基或芳烷基，且R5和R6独立地选自H或甲基。
32.根据权利要求
31所述的脂质体，其中R3和R4各自独立地选自氢、甲基、乙基或丙基。
33.根据权利要求
26所述的脂质体，其中L和Ra以顺式-1，2-或邻位方位连接到五元或六元环上，并且L和Ra一起形成另一五元至七元环。
34.根据权利要求
33所述的脂质体，其中亲水聚合物连接到五元或六元环或连接到所述另一五元至七元环上。
35.根据权利要求
27所述的脂质体，进一步包含装入的治疗剂。
36.可通过含胺或含羟基的分子与具有结构II的化合物的反应获得的共轭物 其中Z是可被羟基或氨基置换的离去基团；M选自顺式-CRb＝CRc-、-CRbRd-或CRbRd-CRcRe-，其中Rb、Rc、Rd和Re各自独立地选自H、甲基、取代甲基、氟基或氯基，其中甲基可以被羟基、氟基或氯基取代；D-形结构代表五元或六元环——M和二硫化物基团S-S以顺式-1，2-或邻位方位连接到该五元或六元环上。Ra代表环上的氢或选自R、OR、C(O)OH、C(O)OR、OC(O)OR、C(O)NR2、OC(O)NR2、氰基、硝基、卤素、或另一稠合环的一个或多个取代基，其中R是C1-C6烃基，其可以进一步被卤素取代；且L是直链或支链C1-C6烷基，其可以进一步被芳基或芳烷基取代；其中L和Ra可以一起形成环；且其中该化合物进一步包含，连接到L、连接到Ra，或连接到五元或六元环上的脂质或亲水聚合物。
37.根据权利要求
36所述的共轭物，其中L和Ra不形成环。
38.根据权利要求
37所述的共轭物，包含连接到L上的亲水聚合物。
39.根据权利要求
38所述的共轭物，其中所述五元或六元环是苯环，且M是顺式-CRb＝CRc-，以使该化合物具有结构IIa
40.根据权利要求
39所述的共轭物，其中L具有结构-CR3R4-CR5R6-，以使-CR3R4连接到二硫化物基团上，其中R3和R4独立地选自H、烷基、芳基或芳烷基，且R5和R6独立地选自H或甲基。
专利摘要
本发明涉及式(1)的共轭物，其包含连接到来自含胺或含羟基化合物(例如药物或蛋白质)的配体上的脂质或亲水聚合物(例如聚乙二醇)，该共轭物在储存条件下是稳定的并可以在温和硫解条件下裂解以使含胺或含羟基化合物以其原生形式再生，而不会形成不合意的副产物。
文档编号A61K49/00GK1997399SQ20058001262
公开日2007年7月11日 申请日期2005年4月20日
发明者S·扎利普斯基, P·苏布拉穆尼 申请人:阿尔扎公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan