菌落密度可调的高精度接种与影印工具的制作方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种菌落密度可调的高精度接种与影印工 具。
【背景技术】
[0003] 1952年，J. Lederberg发明了平板影印（Replica plating)方法，即通过影印平板 的接种培养方法，在母、子平板的对应位置上形成相同遗传型菌落。平板影印法不仅在微生 物遗传理论研究中有重要应用，而且在育种实践和其他研究中均有应用。传统的影印法是 将灭菌丝绒绷在一个比培养皿稍小的圆柱上，构成印章式的接种工具，然后把长有菌落的 培养皿倒置在丝绒印章上，轻轻印一下，原平板的菌落转移到丝绒上面，通过按压将菌转接 到另一个含有培养基的培养皿的一种接种方法。平板影印法的优点在于它方便菌的大规模 筛选。
[0004] 目前的影印工具的缺点主要表现为：1、无接种功能：目前的影印工具由于无法控 制接种微生物密度，间距无法调控，而微生物生长速度不一致，菌落的扩张速度也不一致， 导致无法用于初始接种。2、影印精度低：使用印章工具影印时，距离相近的菌落易被挤压， 造成菌落间污染；使用牙签工具影印时，若牙签之间存在菌落，则无法被影印，造成漏印； 使用牙签工具影印时，一个大菌落可能被增印成多个菌落；平板培养基表面不平整时，印章 /牙签影印工具分别会造成漏印/刺破培养基。3、灭菌时间长：由于绒布、牙签、猪鬃等均 不能在火焰上灼烧灭菌，所以在批量操作时，需事先湿热灭菌大量影印工具(每个工具影印 一次后就必须重新湿热灭菌才能用于另一母板)，单次湿热灭菌即需要1~2小时。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种菌落密度可调的高精度接种与影印工具。 使用该工具，既可定量接种菌落，又能够高精度影印复制菌落，且能够快速灼烧灭菌。
[0006] 本发明的接种与影印工具，包括圆盘状、同样大小的底板、中间板和面板，它们通 过边缘上均匀分布的四根不锈钢螺丝固定，在四根不锈钢螺丝外套铜螺柱，底板、中间板、 面板的中心与一手柄通过螺母固定连接；在中间板和面板上有1448个小孔，有10~1448根 平头不锈钢钉穿过中间板和面板的小孔，且钉头在底板和中间板之间可上下移动。
[0007] 中间板与底板的距离是4mm。
[0008] 中间板与面板的距离是8mm〇
[0009] 所述底板、中间板、面板厚I. 6mm，直径95mm。
[0010] 平头不锈钢钉长30 ± 1mm，直径1mm。平头不锈钢钉10~1448根，根据微生物菌落 大小自由调节，为避免菌落互相黏连融合同时兼顾分离效率，菌落较大时针数应较少，菌落 较小时针数应较多。 toon] 本发明装置定量接种菌落的功能指：根据菌落大小的不同，每个直径10厘米的培 养皿上能够形成的最大菌落数在1〇~1448个之间连续可调；高精度影印复制菌落的功能 指：能够将同一工具接种形成的菌落有效复制到另一平板上，避免漏印与增印，影印部件 (钢针）与平板表面完全贴合；灭菌性能指：整个工具能够耐受121Γ湿热灭菌，接种针部分 能够直接用酒精灯火焰快速灼烧灭菌。
[0012] 本发明的工具与现有工具比较总结如上表所示。
【附图说明】
[0013] 图1，面板、中间板结构示意图。
[0014] 图2,本发明装置结构示意图。
[0015] 图3,底泥中微生物案例，原代平板，显示接种效果。
[0016] 图4,底泥中微生物案例，子代平板，显示影印效果。
[0017] 图5,放线菌紫外诱变案例，原代平板，显示接种效果。
[0018] 图6,放线菌紫外诱变案例，子代平板，显示影印效果。
【具体实施方式】
[0019] -、本发明工具的制备 面板、中间板设计如1所示。其中，1、圆盘：直径95_，厚1.6_ 2、 中心孔：直径3mm小孔，位于圆盘正中心，共1个； 3、 中轴线孔：直径2mm小孔，位于黄色圆盘纵横中轴线上，圆心距圆盘边缘为5mm，共4 个； 4、 小孔：在圆盘上打满直径I. 15mm小孔，纵横孔距（圆心间距）均为2. 15mm，共1448 个； 5、 定位孔：直径Imm小孔，位于圆盘横中轴线上，圆心距圆盘边界为I. 5mm，共1个。
[0020] 底板无1448个小孔，中心孔直径增大为7mm，中轴线孔径增大为4mm，其他与面板 一样。
[0021] 针数可在10~1448孔之间连续调整，安装过程本说明以357针为例：两块板应先用 铜螺柱隔离，间距8mm。将357根平头不锈钢钉插入中间板、面板。由于不锈钢钉的直径略 小于孔直径，钉可在孔内可以上下移动；不锈钢钉安装完毕后再组装底板，底板的作用在于 限制不锈钢钉的移动范围并通过自身重力作用压迫所有不锈钢钉自然下滑(从而保证不锈 钢钉与平板贴合度良好)，底板与中间板用铜螺柱隔离，底板与中间面板的间距活动范围为 〇~4_;再用不锈钢螺丝固定底板、中间板、面板，然后安装手柄。整个装置可耐受121°C湿 热灭菌1000次，其接种部位(钉尖）可用酒精灯火焰灼烧灭菌。
[0022] 二、本发明工具的应用两例 例一、底泥中微生物的分离与影印传代 1、样品来源及培养基 分离微生物的样品来源：来自湖北省某水库的底泥。
[0023] 培养基：可溶性淀粉 20g，KNO3 lg，NaCl 0· 5g，K2HPO4 0· 5g，MgSO4 0· 5g，FeSO40.0 lg，琼脂20g，蒸馏水1L，pH=7. 2,琼脂粉含量为I. 6%。
[0024] 2、底泥菌悬液的制备 称取Ig底泥加到锥形瓶中，然后加入50ml灭菌的生理盐水，再加入玻璃珠，置于摇床 中，25°C，160r/min震荡lh，然后静置备用。
[0025] 3、平板影印接种菌(制备原代平板） 取在121°C的温度下灭菌的IOcm培养皿放入洁净工作台中紫外线照射30分钟，取底泥 菌悬液>10mL倒入清洁的灭菌培养皿内，用接种影印工具沾取菌悬液后放置(依靠工具的 自身重力，无需按压）于事先制备好的高氏一号固体平板（IOcm培养皿）上，用记号笔在接 种影印工具定位孔对应的培养皿边缘做定位孔标记，盖上平皿盖25°C倒置培养。
[0026] 4、平板影印传代(制备子代平板） 待平板中菌落长到适当大小(菌落明显但又尚未黏连融合)，采用无菌操作，用同一接 种影印工具的定位孔对准培养皿上的定位孔标记，放下接种影印工具(依靠工具的自身重 力，无需按压)，钢针针头上将沾染原平板上对应的菌落，再转印于另一个含有高氏一号培 养基的培养皿上面进行传代（依靠工具的自身重力放置即可，同时做定位孔标记)，盖上平 皿盖25°C倒置培养。影印完成后，将原代平板于4°C保藏待用。
[0027] 例二、放线菌诱变育种的分离与影印传代 1、样品来源及培养基 分离微生物的样品来源：放线菌纯菌株--链霉菌AN02。
[0028] 培养基：可溶性淀粉 20g，KNO3 lg，NaCl 0· 5g，K2HPO4 0· 5g，MgSO4 0· 5g，FeSO40.0 lg，琼脂20g，蒸馏水1L，pH=7. 2,琼脂粉含量为I. 6%。
[0029] 2、菌悬液的紫外诱变处理 将菌悬液置于PHILIPS PL-S9W/01/2P中波紫外灯管25厘米处照射3分钟。
[0030] 3、平板影印接种菌(制备原代平板） 取在121°C的温度下灭菌的IOcm培养皿放入洁净工作台中紫外线照射30分钟，取底 泥菌悬液>10mL倒入清洁的灭菌培养皿内，用接种影印工具沾取经紫外诱变处理的菌悬液 后放置(依靠工具的自身重力，无需按压)于事先制备好的高氏一号固体平板（IOcm培养皿） 上，用记号笔在接种影印工具定位孔对应的培养皿边缘做定位孔标记，盖上平皿盖25°C倒 置培养。
[0031] 4、平板影印传代(制备子代平板） 待平板中菌落长到适当大小(菌落明显但又尚未黏连融合)，采用无菌操作，用同一接 种影印工具的定位孔对准培养皿上的定位孔标记，放下接种影印工具(依靠工具的自身重 力，无需按压)，钢针针头上将沾染原平板上对应的菌落，再转印于另一个含有高氏一号培 养基的培养皿上面进行传代（依靠工具的自身重力放置即可，同时做定位孔标记)，盖上平 皿盖25°C倒置培养。影印完成后，将原代平板于4°C保藏待用。
【主权项】
1. 一种菌落密度可调的高精度接种与影印工具，其特征在于，包括圆盘状、同样大小 的底板、中间板和面板，它们通过边缘上均匀分布的四根不锈钢螺丝固定，在四根不锈钢螺 丝外套铜螺柱，底板、中间板、面板的中心与一手柄通过螺母固定连接；在中间板和面板上 有1448个小孔，有10~1448根平头不锈钢钉穿过中间板和面板的小孔，且钉头在底板和中 间板之间可上下移动。2. 根据权利要求1所述的高精度接种和影印工具，其特征在于，底板是可以活动的，并 通过自身重力作用压迫所有不锈钢钉自然下滑(从而保证不锈钢钉与平板贴合度良好)。3. 根据权利要求1所述的高精度接种和影印工具，其特征在于，不锈钢钉为平头，其 直径略小于孔直径，钉可在孔内可以小幅度上下移动。4. 根据权利要求1所述的高精度接种和影印工具，其特征在于，所述底板、中间板可 配备的平头不锈钢钉数量和针间间隙可以根据需要自由调节。5. 根据权利要求1所述的高精度接种和影印工具，其特征在于，所述的工具整体能够 耐受湿热灭菌，不锈钢钉能够耐受酒精灯火焰灼烧灭菌； 此外，本工具设计的中间板、面板、底板的外形尺寸，开孔的孔径大小和密度，不锈钢钉 的材质、直径、长度等均可根据需要调节； 如分离霉菌(菌落很大）时可采用直径20厘米的大培养皿，此时，中间板、面板、底板的 直径应增加至19. 5厘米，开孔孔径增加(不锈钢钉直径相应增加)，开孔密度减小，不锈钢钉 长度增加，不锈钢针材质也可替换为铝针、铜针等耐热不锈材料。
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种菌落密度可调的高精度接种与影印工具。包括圆盘状、同样大小的底板、中间板和面板，它们通过边缘上均匀分布的四根不锈钢螺丝固定，在四根不锈钢螺丝外套铜螺柱，底板、中间板、面板的中心与一手柄通过螺母固定连接；在中间板和面板上有1448个小孔，有10~1448根平头不锈钢钉穿过中间板和面板的小孔，且钉头在底板和中间板之间可上下移动。使用该工具，既可定量接种菌落，又能够高精度影印复制菌落，且能够快速灼烧灭菌。
【IPC分类】C12M1/26
【公开号】CN105176802
【申请号】
【发明人】程凯, 章登岚, 孙轶群, 吴刚, 赵以军
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月17日