一种产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株的制作方法
【专利说明】一种产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株 【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌植物亚 种菌株。 【【背景技术】】
[0002] 纤维素资源是地球上最廉价、最丰富的可再生资源之一。但由于其分子结构的特 殊性及其在自然界中存在的特殊性，纤维素资源不但没有得到合理充分的开发利用，而且 焚烧或弃置对环境造成环境污染。产纤维素酶的纤维素分解菌降解纤维的机理是通过与粗 纤维的附着、粘连、穿透等一系列作用，产生纤维素酶将纤维的各组分进行分解，纤维素被 逐步转化成葡萄糖或单细胞蛋白质等，进一步转成酒精等，不可可以减少环境污染，还是在 能源、饲料、食品、纺织、造纸等方面得以高效利用，带来巨大经济效益和社会价值。从微生 物中筛选新的生物活性物质已成为新的研究热点。纤维素酶是能够将纤维素降解转化横葡 萄糖的一组酶的总称，广泛存在于细菌中。芽胞杆菌是一类产芽胞的细菌，在各个行业具有 应用价值和经济效益。目前，具有产纤维素酶的解淀粉芽胞杆菌的文献报道甚少，而且酶活 很低。 【
【发明内容】
】
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种产纤维素酶的解淀粉芽胞杆菌植物亚 种菌株？从1'_29941(1^(3；[11118&1117101丨9116€&(^6118 8油8。.。1&1^&1'11111)，于2015年02月10 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 10558。
[0004] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
[0005] 本实验室取的福建省漳州市甘蔗研究所实验基地采集的植物玫瑰茄根系土壤，并 将采集到的土壤通过分离与筛选得到一株能够产纤维素酶的菌株，鉴定该菌株的形态学、 生理生化学特征、及测定其16S rRNA序列并进行比对分析，最终鉴定其为解淀粉芽胞杆菌 植物亚种的一个菌株。
[0006] 本发明的有益效果在于：提供了一种能够产纤维素酶的解淀粉芽胞杆菌植物亚种 菌株 FJAT-29941 (Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)，且所产的纤维素酶的 酶活良好，从而拓宽了优良纤维素酶的来源，为更多的纤维素酶应用提供了可能。 【【附图说明】】
[0007] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0008] 图1是本发明中PCR产物的1. 5 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0009] 图2是本发明中酪氨酸的标准曲线图。 【【具体实施方式】】
[0010] 本发明一种产纤维素酶的解淀粉芽胞杆菌植物亚种菌株FJAT-29941 (Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)是从福建省漳州市甘鹿研究所实验基地的植物玫 瑰茄根系土壤中分离、筛选出能够产纤维素酶的菌株，从而拓宽了纤维素酶的来源。
[0011] 为了对本发明进行详细阐述说明，申请人给出了如下具体实施例。
[0012] 实施例1该菌株FJAT-29941的分离与筛选
[0013] (1)样品的采集：取福建省漳州市甘蔗研究所实验基地的植物玫瑰茄根系土壤， 装入无菌采集袋中，置于4°C保存，备用；
[0014] (2)菌株的分离：取土壤IOg于90mL无菌水中，充分振荡后吸取ImL进行梯度稀 释，选用稀释度为10 \ 10 2, 10 3;接着将土壤稀释液涂布于细菌培养基平板上，于15°c下培 养3-5d ;之后将培养获得的菌落采用连续划线法接种于细菌培养基平板上，于15°C温度下 纯化培养72h，获得纯菌株；
[0015] (3)菌株的筛选：将分离所得的纯菌株采用点接法接种于纤维素钠液体培养基 (CMC-Na)，30°C培养48h，之后加入lmg/mL刚果红溶液，染色lh，弃去染液，加入ImoL/LNaCI 溶液，洗涤Ih ;最后挑选产透明圈的菌株即得到产纤维素酶的菌株；为了方便描述，将该筛 选所得到的菌株命名为菌株FJAT-29941。
[0016] 在本发明中，细菌培养基平板的组分为：蛋白胨10. 0g、牛肉浸膏3. 0g、NaCl 50. 0g、水1000mL，pH 7. 2-7. 4 ;纤维素钠液体培养基（CMC-Na液体培养基）的组分为： 羧甲基纤维素钠1 %、胰蛋白胨1 %、酵母浸膏0.5%、NaCl 0.5%，pH 9.5,琼脂18g、水 1000mL。需要说明的是，本发明中各培养基组分中的百分数在无特殊指明的情况下则均为 质量百分数。
[0017] 实施例2该菌株FJAT-29941的鉴定
[0018] (1)形态学的鉴定：
[0019] 对菌株FJAT-29941的主要形态进行鉴定，得到该菌株FJAT-29941的主要形态如 下：菌落颜色为灰白色，菌落呈圆形，表面干燥，边缘不整齐，不透明，革兰氏染色呈阳性。
[0020] (2)生理生化特征的鉴定：
[0021] 利用北京陆桥公司提供的生理生化微型鉴定管对菌株FJAT-29941的生理生化特 征进行鉴定，鉴定结果如下表1所示。
[0022] 表1菌株FJAT-29941的生理生化鉴定结果
[0024] 注：表1中，" + "表示有作用或有反应；表示无作用或无反应。
[0025] (3)该菌株FJAT-29941的16S rRNA序列测定与分析
[0026] 参照上海捷瑞生物工程有限公司试剂盒中的说明书进行操作提取该菌株 FJAT-29941的基因组DNA。委托上海博尚生物有限公司合成正向引物（如SEQ ID NO: 1 所示）：5 ' -AGAGTTTGATCACTGGCTCAG-3 ';反向引物（如 SEQ ID NO :2 所示）： 5' -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。
[0027] 以提取所获得的菌株FJAT-29941的基因组DNA为模板，且以上述引物为引物对 PCR扩增其16S rRNA基因全长序列：
[0028] PCR反应体系（25 yL) :2. 5 yL 10XBuffer、0. 5 yL IOmM dNTP、l yL 正向引物、 1 μ L反向引物、0· 3 μ L (5U/ μ L)的Taq酶和1 μ L DNA模板；
[0029] PCR反应程序：94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸Imin 30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0030] PCR产物产物检测与测序分析：取2 μ L PCR产物，点样于1. 5%的琼脂糖凝胶中， 以IOObp Marker作为标准分子量，100V电压，电泳40min，EB染色，即进行凝胶电泳分离检 验，电泳分离检验结果如图1所示，并将PCR产物委托上海博尚生物技术有限公司进行测 序，得到的序列如SEQ ID NO. 3所示。在韩国细菌序列比对网站EZtaxon-e. ezbiocloud. net上对菌株FJAT-29941的16S rRNA序列进行比对分析后，确认该菌株FJAT-29941在分 类学上属于解淀粉芽抱杆菌植物亚种（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)。
[0031] 依据上述16S rDNA序列测定与分析并结合形态、生理生化特征最终确定菌 株FJAT-29941属于解淀粉芽抱杆菌植物亚种（Bacillus amyloliquefaciens subsp. p I ant arum)的一株菌株。
[0032] 实施例3该菌株FJAT-29941产纤维素酶活性的测定
[0033] (1)葡萄糖标准曲线的绘制：
[0034] a、葡萄糖在80°C烘箱中干燥过夜；
[0035] b、葡萄糖溶液的配制：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，用无菌水溶解后定容至 100mL，得标准葡萄糖溶液（浓度为1.0 Omg/ml)，置于冰箱中备用；
[0036] c、标准曲线的测定：取7支带有20mL刻度试管，按下表2进行操作。用酶标仪进 行全谱扫描，根据数据绘制酪氨酸标准曲线（见图2)。
[0037] 表2葡萄糖标准曲线
CN 105176867 A 说明书 4/4 页
[0040] (2)酶活性的测定：
[0041] 将菌株FJAT-29941以1%的接种量接于CMC-Na液体培养基中，于170rpm、30°C摇 床中培养48h，得发酵液；接着发酵液于4°C、6000rpm下离心10min，取上清液ImL并于50°C 保温2-3min，加入同样温度的羧甲基纤维素钠溶液3mL，50°C反应30min后，沸水浴lOmin， 冷却后加入3mL DNS，接着沸水浴lOmin，终止反应；终止反应后的液体采用去离子水定容 至20mL ;最后采用酶标仪测定容后溶液在540nm下的吸光值。以灭活酶液（沸水IOmin)作 为空白对照。
[0042] 酶活力按国际单位规定：定义每ImL纤维素酶在Imin内催化羧甲基纤维素钠水解 生成1 μ g的葡萄糖为一个酶活力单位U (U/mL)。
[0044] 其中，Uqk-一ImL粗酶液的酶活，U/mL ;N-一测试粗酶液稀释倍数；B-一测定 OD54。值所对应的葡萄糖的质量，μ g。
[0045] 则通过计算，该株菌株FJAT-29941的酶活大小为9. 84U/mL。
[0046] 实施例4该菌株FJAT-29941的纤维素降解能力检测
[0047] 将菌株FJAT-29941接种于IOmL CMC-Na液体培养基，于30°C、170r/min摇床振 荡培养24h ;之后吸取100 μ L菌液分别转接到以滤纸条代替羧甲基纤维素钠为纤维素源的 20mL摇瓶培养基。其中摇瓶培养基处理方式具体为将CMC-Na液体培养基中的羧甲基纤维 素钠分别替换为lcmXO. 3cm滤纸条，设置3个平行组。48h观察滤纸片降解情况。
[0048] 观察结果发现，滤纸条被降解为多个小滤纸片，说明该菌株FJAT-29941能够产生 纤维素酶，且所产生的纤维素酶具有很强的纤维素降解能力。
[0049] 综上，本发明提供了一种能够产纤维素酶的解淀粉芽胞杆菌植物亚种菌株 FJAT-29941 (Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)，且所产的纤维素酶的酶 活良好，从而拓宽了优良纤维素酶的来源，为更多的纤维素酶应用提供了可能。
【主权项】
1. 一种产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株，其特征在于：所述菌株为解淀粉 芽胞杆菌植物亚种菌株 FJAT-29941 (Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)，于 2015年02月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 10558。
【专利摘要】本发明提供一种产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株FJAT-29941(Bacillus？amyloliquefaciens？subsp.plantarum)，于2015年02月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC？NO.10558。本发明菌株所产的纤维素酶的酶活良好，从而拓宽了优良纤维素酶的来源，为更多的纤维素酶应用提供了可能。CGMCC NO.1055820150210
【IPC分类】C12N1/20, C12N9/42, C12R1/07
【公开号】CN105176867
【申请号】
【发明人】刘波, 刘国红, 车建美, 朱育菁, 陈峥, 陈倩倩, 唐建阳
【申请人】福建省农业科学院农业生物资源研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月28日