一种用于污染土壤修复的制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及污染土壤修复技术领域，特别是用于污染土壤修复的制剂。
【背景技术】
[0002] 中国已成为环境问题最严重的国家之一。据统计截至上世纪末，我国受污染的耕 地面积达2000多万顷，约占耕地面积的五分之一。每年因土壤污染粮食减产就达1000万 吨，还有1200万吨粮食受污染。污染土壤的物质中，重金属污染占重要地位。2011年3月 28日，国家环保部等九部委联合会议，将今年环保专项行动"剑指"重金属污染问题。调查 显示，珠三角部分城市有近40%农田菜地土壤重金属污染超标，其中10%属严重超标。在土 壤中重金属一般可残留几十年，其中铅可残留100年。
[0003] 重金属污染农田土壤的修复治理有多种途经。一是工程治理，例如翻土、换土，但 实施复杂，费用高和易降低土壤肥力。二是化学治理，效果和费用都适中，缺点是容易再度 活化。三是农业治理，易操作耗费较低，但周期长，效果不显著。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种污染土壤修复的制剂，利用该制剂来降解土壤中有毒 重金属以及其他的污染物。
[0005] 本发明提供了一种污染土壤修复的制剂，其特征在于：所述微生物由地衣芽孢杆 菌（Bacillus Iicheniformis)，保藏编号为CGMCC N0.0 395. 4,名为WH4菌种；台湾假单胞 菌（Pseudomonas taiwanensis),保藏编号为 CGMCC NO. 7063，名为 WH15 菌种；细黄链霉 菌（Streptomyces microflavus),保藏编号为 CGMCC NO. 7066，名为 WH18 菌种；铜绿假 单胞菌（Pseudomonas aeruginosa),保藏编号为CGMCC NO. 7111，名为WH20菌种组成。
[0006] 所述制剂中还可以添加木碳、活性有机物料、蛭石。
[0007] 所述制剂内含菌种配比以重量百分比计为：（I) WH4菌种：10-45% ; (2) WH15 菌种：13-50% ; (3) WH18 菌种：8-40% ; (4) WH20 菌种：8_37%。
[0008] 本发明另外提供一种污染土壤修复的制剂的制造方法，包括菌种培养和配制，其 特征在于：（1)将WH4菌种、WH15菌种、WH18菌种、WH20菌种按WH4菌种：10-45%，WH15 菌种：13-50%，WH18菌种：8-40%，WH20菌种：8-37%的重量百分比配比混合均匀组成为 WH菌群；（2)所述WH菌群二级培养基按重量百分比配方：活性有机物料35- 45%;米糠 35-45%;大豆粉15-17%;奶粉L 5-2. 5% ;糖0· 5-1. 5% ;其余水；（3 )二级菌种培养： 先将WH菌群二级培养基按所述配方混合拌匀，常温下接种WH菌群，二级培养基温度范围 30° C-60° C，PH值6. 5-7. 5,培养时间7-15天，培养成熟后获得WH菌群的活性糠菌，其含 活菌数5亿-30亿个/克；（4)将木碳、活性有机物料、蛭石和WH菌群的活性糠菌，按以下 重量百分比配方混合、常温发酵10天以上、粉碎、包装制成土壤重金属生物降解剂：木碳 10-70% ;活性有机物料15-40% ;蛭石5-10% ; WH菌群活性糠菌10-40%。
[0009] 其中地衣芽孢杆菌还可以为采用如下的方式构建得到的地衣芽孢杆菌： 所述的地衣芽孢杆菌为转入了编码如下任一个蛋白变体的编码基因的地衣芽孢杆菌， 所述蛋白变体为相对于蛋白原始氨基酸序列分别进行如下突变，30A/V，49E/I，61L/R，78L/ P，122Q/T，133T/G，148A/S，181T/R，194R/V，209A/G，243R/Q，255V/T 蛋白原始氨基酸序列参 见GenBank :WP_041755179. 1(30A/V表示在原始序列第30位的A氨基酸替换为V氨基酸)。 这些突变后的氨基酸序列使得导入了该突变后的氨基酸序列的菌株具有相对于未突变的 菌株具有更好的效果。而申请人通过大量的实验证实，并不是所有的取代都具有相似的效 果，有大量的取代之后的短小芽孢杆菌与其它菌株一起并不具有较好的污水处理的效果。
[0010] 利用DNAMAN软件分析，根据氨基酸序列GenBank :WP_041755179. 1全基因合成所 述的核苷酸序列WR基因，通过进行扩增获得目的片段，PCR扩增获得目的基因 WR (同时通 过多重PCR将相应的突变位点引入到基因序列中，从而获得了不同突变体基因)，用限制性 内切酶进行双酶切PCR产物，与同样经过双酶切的表达载体pHT43相连，通过本领域常用的 质粒转移的方式将验证成功的重组质粒从大肠杆菌中转化进入到所述地衣芽孢杆菌中，获 得降解污染土壤的基因工程菌。
【具体实施方式】
[0011] 通过下面实施例对本发明作进一步详细阐述。
[0012] 实施例1 一种污染土壤修复剂的主要成份为WH4菌种、WH15菌种、WH18菌种、WH20菌种以及木 碳、活性有机物料、蛭石。
[0013] 上述微生物中，WH4菌种为地衣芽抱杆菌（Bacillus Licheniformis) ;WH15菌种为台湾假单胞菌（Pseudomonas taiwanensis) ;WH18菌种为细黄链霉菌 (Streptomycesmicrof lavus) ;WH20 菌种为铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa)。
[0014] 本污染土壤修复剂内含菌种的配比为（重量百分比）： (I) WH4 菌种：10% ; (2) WH15 菌种：13% ; (3) WH18 菌种：40% ; (4) WH20 菌 种：37%〇
[0015] 本土壤修复剂的制造方法包括菌种培养和配制，其工艺步骤为： (I)将上述WH4菌种、WH15菌种、WH18菌种、WH20菌种按上述重量百分比的配比混合 均匀组成为WH菌群； (2) WH菌群二级培养基配方（重量百分比）为： 活性有机物料40%、米糠40%、大豆粉16%、奶粉2%、糖1%、其余水； (3)二级菌种培养，先将WH菌群二级培养基按上述配方混合拌匀，常温下接种WH菌 群，培养基温度60° C，PH值7.0,培养时间7天，培养成熟后获得WH菌群的活性糠菌，含活 菌可达30亿个/克； (4)将木碳、活性有机物料、蛭石、WH菌群的活性糠菌，按以下重量百分比配方混合、常 温发酵10天以上、粉碎、包装制成活性微生物土壤修复剂剂：木碳10% ;活性有机物料 40% ;蛭石10% ; WH菌群的活性糠菌40%。
[0016] 实施例2 利用DNAMN软件分析，根据氨基酸序列GenBank :WP_041755179. 1全基因合成所述的 核苷酸序列WR基因，通过进行扩增获得目的片段，PCR扩增获得目的基因 WR (同时通过多 重PCR将相应的突变位点引入到基因序列中，从而获得了不同突变体基因），用限制性内切 酶进行双酶切PCR产物，与同样经过双酶切的表达载体pHT43相连，通过本领域常用的质粒 转移的方式将验证成功的重组质粒从大肠杆菌中转化进入到所述WH4菌种地衣芽孢杆菌 中，获得降解污染土壤的基因工程菌。共计13种类型。
[0017] 将这13种类型的转基因 WH4菌种分别按照实施例1的方法并代替原来的WH4菌 种制备得到相应的制剂。
[0018] 实施例3效果验证 取污染土壤，测定土壤原始的重金属含量，分别为Cd 45mg/kg;Pb 50mg/kg;Cr 70mg/ kg 〇
[0019] 将实施例1和2制备得到的制剂，按照IOg制剂/kg 土壤的处理量来处理土壤，处 理10天。设置空白对照。处理后结果如下表：
施用本制剂后，土壤中各种重金属含量显著降低，效果非常显著。具有较好的应用前 景。
【主权项】
1. 一种污染土壤修复的制剂，其由微生物组成。2. -种污染土壤修复的制剂，其由如下各组分组成：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)，保藏编号为CGMCCNO. 0395. 4，名为WH4菌种；台湾假单胞菌 (Pseudomonastaiwanensis),保藏编号为CGMCCNO. 7063，名为WH15 菌种；细黄链霉菌 (StreptomycesmicrofIavus),保藏编号为CGMCCNO. 7066，名为WH18 菌种；铜绿假单胞 菌（Pseudomonasaeruginosa),保藏编号为CGMCCNO. 7111，名为WH20 菌种组成。3. 如权利要求2所述的制剂，其特征在于：所述的地衣芽孢杆菌为转入了编码如下任 一个蛋白变体的编码基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述蛋白变体为相对于蛋白原始氨基酸 序列分别进行如下突变 30A/V，49E/I，61L/R，78L/P，122Q/T，133T/G，148A/S，181T/R，194R/ V，209A/G，243R/Q，255V/T,蛋白原始氨基酸序列参见GenBank:WP_041755179. 1。4. 如权利要求1-3任一项所述的制剂在处理污染土壤中的应用。5. -种蛋白，其序列为相对于蛋白原始氨基酸序列分别进行如下突变30A/V，49E/I， 61L/R，78L/P，122Q/T，133T/G，148A/S，181T/R，194R/V，209A/G，243R/Q，255V/T,蛋白原始 氨基酸序列参见GenBank:WP_041755179. 1〇
【专利摘要】本发明涉及一种用污染土壤修复的制剂，其中所述活菌中包括由地衣芽孢杆菌(Bacillus？licheniformis)；台湾假单胞菌(Pseudomonas？taiwanensis)；细黄链霉菌(Streptomyces？microfIavus)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas？aeruginosa)组成。本发明还提供一种制剂的生产方法。本发明的制剂，对污染土壤处理效果明显，具有较好的推广应用价值。
【IPC分类】C12R1/465, B09C1/10, C12R1/385, C12N1/20, C12R1/38, C07K14/32, C12R1/10
【公开号】CN105176876
【申请号】
【发明人】卢美珍
【申请人】卢美珍
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月11日