基于水解探针法的快速检测地中海贫血泰国型缺失型的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种基于水解探针法的快速检测地中海 贫血泰国型缺失型的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常 见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有Cl-地贫和β-地贫。中国人群中，α-地贫 的基因型常见的为缺失型一SEA、-α3·7和-α 4·2。申请人在日常检测中发现α地贫中的泰 国型缺失（--?ΑΙ)人群中有一定的分布几率，而泰国型缺失等位基因并未在常规地贫检测 试剂盒以内。为了避免泰国型缺失的漏筛，需要建立一种可以快速诊断一ΤΗΑΙ等位基因的检 测试剂盒。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血泰 国型缺失型的试剂盒。采用该试剂盒可以实现单管单次反应完成一ΤΗΑΙ罕见缺失型地中海 贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
[0004] 本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血泰国型缺失型的试剂盒，包 括扩增引物和荧光探针，其中：
[0005] 所述的扩增引物为：一对可以扩增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ等位基因的特征序 列的引物THAI-F和THAI-R，其中：
[0006] THAI-F :5'-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3' ；
[0007] THAI-R :5'-CTTGGATCTGCACCTCTG-3' ；
[0008] 所述的荧光探针为特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针T HAI-Prob，具体为：
[0009] THAI-Prob :5, -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3, 〇
[0010] 上述试剂盒中的荧光探针中，CY5是指花青染料分子5,BHQ-2是指荧光淬灭基团。
[0011] 本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血泰国型缺失型的试剂盒还 包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCljP dNTP。具体地，酶液为 Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲 液；当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStar Taq DNA Polymerase时，缓冲液则优选为 与 GoldStar Taq DNA Polymerase 配套的缓冲液。
[0012] 采用上述试剂盒快速检测一THAI的方法包括以下步骤：
[0013] 1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板； _4] 2)配制反应体系，具体为：
[0015]将引物 THAI-F、THAI-R，荧光探针 THAI-Prob，以及 PCR 缓冲液、酶液、MgC12、dNTP、 水和DNA模板配制成反应体系；
[0016] 3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多 少）；
[0017] 4)数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结 果；当CY5通道有Cq值读数时，则表示该样本携带一THAI等位基因；当CY5通道没有Cq值 读数时，则表示该样本不携带一THAI等位基因。
[0018] 上述方法的步骤1)中，采用现有常规方法制备DNA模板。
[0019] 上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：待检测DNA :1~3ng/ yL ;各引物：0· 3~0· 5ymol/L ;探针浓度为0· 3~0· 5ymol/L ;DNA模板：20~200ng ;镁 离子：1. 5~I. 9mmol/L ;反应体系的终体积优选为20 μ L。
[0020] 上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95°C预变性8~12分钟，然后95°C 15~ 30秒，60 °C退火50~70秒，39~49个循环，于60 °C退火步骤末采集荧光信号。
[0021] 与现有技术相比，本发明的特点在于：
[0022] 1、本发明所述试剂盒可以实现单管单次反应完成一THAI罕见缺失型地中海贫血等 位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
[0023] 2、本发明所述试剂盒应用于荧光水解探针法检测一THAI罕见缺失型地中海贫血等 位基因时，无需开管操作，极大限度地降低了实验室PCR产物污染的可能。
[0024] 3、采用荧光水解探针的实验方案比现有其他方法所需时间少，对设备要求不高。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1中1#样本的扩增曲线；
[0026] 图2为本发明实施例1中2#样本的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于以下实施例。
[0028] 实施例1 :采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果
[0029] 1、试剂盒的组成：
[0030] 扩增α -珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的引物对THAI-F和THAI-R :
[0031] THAI-F :5'-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3'（SEQ ID NO :1);
[0032] THAI-R :5'-CTTGGATCTGCACCTCTG-3'（SEQ ID NO :2);
[0033] 特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：
[0034] THAI-Prob :5'-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3'（SEQ ID NO :3);
[0035] 其它组成成分：
[0036] GoldStar Taq DNA Polymerase、与GoldStar Taq DNA Polymerase配套的缓冲液 和dNTPs均购自康为世纪，MgCl2购自Life Technology。
[0037] 按下述表1配制PCR反应体系：
[0038] 表1 : (mM 表不 mmol/L，μ M 表不 μ mol/L) CN 105176996 A 说明书 3/4 页
[0040] 2、实施方法：
[0041] PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：95°C预变性 8~12分钟，然后95 °C 15~30秒，60 °C退火50~70秒，39~49个循环，于60°C退火步 骤末采集荧光信号。
[0042] 样本处理：米用 Lab-Aid DNA mini extraction kid (Bio-V, Xiamen)试剂盒抽提 DNA，以双蒸水稀释至20~200ng/ μ L备用。DNA样本也可采用其他常规DNA提取方法提 取。
[0043] 样本检测：将1份用常规方法检测确定的已知基因型待检样本（简称1#样本）， 以及1份正常基因型（α α / α α，Ν/Ν)样本（简称2#样本），根据上述反应体系和反应程 序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录Cq值。
[0044] 3、样本来源：所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的DNA样本。
[0045] 4、数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结 果。当CY5通道有Cq值读数时，则表示该样本携带一ΤΗΑΙ等位基因；当CY5通道没有Cq值 读数时，则表示该样本不携带一ΤΗΑΙ等位基因。
[0046] 经检测分析，1#样本的CY5通道有Cq值读数（扩增曲线如图1所示，Cq值读数由 表2所示），表示1#样本携带一ΤΗΑΙ等位基因；2#样本的CY5通道没有Cq值（谱图如图2 所示，Cq值读数由表3所示），表示2#样本不携带一ΤΗΑΙ等位基因。
[0047] 表 2 :
[0051] 可见，采用本发明所述试剂盒进行一ΤΗΑΙ缺失型地中海贫血等位基因检测时，结果 准确；而且野生型样本无非特异性Cq值，具有较高的特异性。
[0052] 实施例2 :本发明所述试剂盒在随机基因型样本中的检测效果。
[0053] 1、试剂盒的组成：
[0054] 同实施例1。
[0055] 2、实施方法：
[0056] 同实施例1。
[0057] 3、样本来源：
[0058] 样本为14例随机样本（由钦州市妇幼保健院提供），以双蒸水稀释至20~200ng， 作为待检样本），以及经Gap-PCR验证的1例野生型样本，1例泰国型阳性样本。
[0059] 4、数据分析及结果判定：
[0060] 根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果。若CY5通道有Cq值 读数，则表示该样本携带一THAI等位基因；若CY5通道没有Cq值读数，则表示该样本不携 带一THAI等位基因。结果如下述表4所示。
[0061] 表 4 :
[0063] 注：样本类型中Neg Ctrl =阴性对照，Pos Ctrl =阳性对照，Unkn =未知样本类 型，检测结果中，N/A=无 Cq值。
[0064] 结果显示，野生型样本与阳性样本检出Cq值与理论一致，随机样本中检出一 例__??等位基因。
【主权项】
1. 基于水解探针法的快速检测地中海贫血泰国型缺失型的试剂盒，包括扩增引物和荧 光探针，其特征在于： 所述的扩增引物为：一对可以扩增a-珠蛋白基因簇中--?AI等位基因的特征序列的 引物THAI-F和THAI-R，其中： THAI-F :5' -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3'； THAI-R :5' -CTTGGATCTGCACCTCTG-3'； 所述的荧光探针为特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob，具体 为： THAI-Prob :5' -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3'。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括缓冲液、酶液、 MgCljP dNTP。
【专利摘要】本发明公开了一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血泰国型缺失型的试剂盒。该试剂盒包括一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R，其中：THAI-F：5’-AAGCGAGA？GGAATCACATTC-3’；THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’；以及一条特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。采用该试剂盒可以实现单管单次反应完成--THAI罕见缺失型地贫等位基因的检测，且灵敏性、稳定性和准确性高。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105176996
【申请号】
【发明人】龙驹, 孙雷, 庞婉容, 翁勋锦, 叶学和
【申请人】钦州市妇幼保健院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月26日