一种金鱼藻组织培养与快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及沉水植物金鱼藻的组培和快速繁殖 方法，该方法是利用完全无菌和严格的控温措施，实现了沉水植物金鱼藻在实验室大量生 产，并可以推广到生态环境修复。
【背景技术】
[0002] 金鱼藻属于金鱼藻科金鱼藻属，在湖泊生态修复工程中作为净水工具种和植被恢 复先锋物种、鱼虾蟹塘养殖过程中作为饵料、避难和产卵场所，以及室内观赏水族养殖过程 中作为布景材料。目前尚缺乏成熟技术，可以大规模扩繁金鱼藻优质工程苗，同时克服该物 种在自然环境中种源有限且污染严重的问题。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种金鱼藻组织培养与快速繁殖方法，该方法是在无菌条件下，采 取控温措施，给予固定光照，培养无菌苗体系，可常年提供大量无菌幼苗。方法易行，操作方 便，产量高。
[0004] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种金鱼藻组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤： A、 外植体选择与预处理:选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的可萌发腋芽的金鱼藻茎 段作为外植体，然后用洗涤剂浸泡，无菌水清洗进行预处理； B、 外植体灭菌： 用酒精和植物组织抗菌剂处理外植体，制备无菌外植体； C、 芽诱导:选择0.50 mg/L 6-BA和1.30mg/L IAA的MS固体培养基，蔗糖质量体积浓度 为3%，pH调至5.8-6.0，固体培养基装于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升；固体培养基经过120 °(：灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌处理后的1-1.5cm的金鱼藻外植体，于光照培养箱中静 置培养，待幼芽长至1.0-1.5cm进行增殖培养； D、 增殖培养:选择蔗糖质量体积浓度1.5%的1/2 MS液体培养基，添加0.5-2.00 mg/L 6-BA和0.01-1.00 mg/L IAA的激素;液体培养基分装于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培 养基灭菌方式与芽诱导相同，接入长1.0-1.5cm的幼芽置于光照培养箱中静置，进行增殖培 养； E、 炼苗和移栽:待金鱼藻无菌苗长至4. Ocm即可炼苗，打开瓶盖，室温下炼苗l-2d后洗 净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中； 所述的步骤C，D，E均采用无菌环境，光照60-70μΕ/(πι2 · s)，光照周期为12h/d，室内温 度（25±2)°C。
[0005] 所述步骤A中，预处理的具体步骤如下：用碱性洗涤剂浸泡30min，再用自来水冲洗 1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台。
[0006] 所述步骤B中，在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒，用无菌水冲洗4-5次，再 用5%植物组培抗菌剂PPM进行表面消毒5min，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待 用。
[0007]本发明具有以下优点： 目前关于金鱼藻组织培养的技术未见报道，也没有系统的对金鱼藻作出研究。但是金 鱼藻是污染水体中最后坚守的水生植物，水体污染的后期，几乎只剩下金鱼藻，可见金鱼藻 的耐污能力较强，因此获得足够的金鱼藻可以为水环境修复提供源源不断的种苗。该技术 能直接诱导金鱼藻幼芽的生长，不断产生丛生芽，而且在液体环境中才能更好实现金鱼藻 无菌苗的增殖培养。金鱼藻一年四季均可生长，但是冬季生长会变得迟缓，高温也会导致生 长缓慢，利用本发明可以不受季节、温度、地域影响，获得大量的无菌苗。一个为长1.5cm的 外植体经过一个月的培养可以繁殖出3-9cm长的幼苗，30d的增殖系数最高可达到18倍，一 年一个芽理论上可繁殖十亿棵以上幼苗，远远优越于自然水体植物的繁殖速度。以一个芽 30 d继代一次，每次的繁殖系数为18计算，预期结果如下表1所示。
【具体实施方式】
[0009] 本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均可实现本发明，所述技术方 案，如未特别说明，均可采用本领域的常规技术。
[0010] 实施例1 A、 外植体选择与预处理:选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的可萌发腋芽的茎段作为 外植体，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗两小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用 无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台； B、 外植体灭菌:在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒，用无菌水冲洗4-5次，再用5% 植物组培抗菌剂(PPM)进行表面消毒5分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待 用； C、 芽诱导:选择0.50 mg/L 6-BA和1.30 mg/L IAA的MS固体培养基，蔗糖浓度为3%(质 量体积比），pH调至5.8,培养基装于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升。培养基经过120°C灭菌处 理20min，冷却后，接入长约1.5cm的金鱼藻外植体。置于光照培养箱中静置培养，待芽长至 1 · 5cm可进行增殖培养； D、 增殖培养:选择1.5%蔗糖浓度(质量体积比）的1/2MS液体培养基，添加0.50mg/L 6-BA和0.01mg/L IAA激素。液体培养基装于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培养基灭菌方式 与芽诱导相同，每瓶接入6棵，放入光照培养箱中进行增殖培养； E、 炼苗和移栽:金鱼藻为不定根水生植物，不需根也可以生长，待无菌苗长至4. Ocm即 可炼苗，打开瓶盖，室温下炼苗1 -2d后(打开瓶盖，静置在培养箱内即可），洗净培养基，取出 试管苗，移栽至自然水体中。
[0011] 步骤C，D，E均为无菌环境，光照60-70μΕ/(πι2 · s)，光照周期为12h/d，室内温度(25 ±2)°C。
[0012] 所述MS培养基配方如下:单位mg/L KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4·7Η20 370 KH2PO4 170 CaCl2·2Η20 440 MnSO4·4Η20 22.3 ZnS04-7H20 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4-7Η20 0.25 CuSO4.5Η20 0.025 CoCL2.6Η20 0.025 Na2-EDTA 37.3 FeSO4-7 H2O 27.8 甘氨酸 2.0 盐酸吡哆醇0.5 盐酸硫铵素0.1 烟酸 0.5 肌酸 100。
[0013] 固体培养基为上述培养配方中加入6g/L琼脂。
[0014] 本方法可以由一个外植体直接诱导出幼芽，再不断繁殖得到更多的丛芽，30 d的 增殖系数达到18，且获得幼苗和自然环境中的金鱼藻没有差别。存活率大于90%。
[0015] 实施例2 A、 外植体选择与预处理:选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的可萌发腋芽的茎段作为 外植体，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗两小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用 无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台； B、 外植体灭菌:在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒，用无菌水冲洗4-5次，再用5% 植物组培抗菌剂(PPM)进行表面消毒5分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待 用； C、 芽诱导：选择0.50mg/L 6-BA和1.30/L IAA的MS固体培养基，蔗糖浓度为3%(质量体 积比），pH调至6.0,培养基装于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升。培养基经过120°C灭菌处理 20min，冷却后，接入长约1.5cm的金鱼藻外植体，置于光照培养箱中静置培养，待新芽长至 1 · 5cm可进行增殖培养； D、 增殖培养:选择1.5%蔗糖浓度(质量体积比）的I/2MS液体培养基，添加2mg/L 6-BA和 lmg/L IAA激素。液体培养基装于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培养基灭菌方式与芽诱 导相同，每瓶接入6棵，置于光照培养箱中静置培养； E、 炼苗和移栽:金鱼藻为不定根水生植物，不需要根也可以生长，待无菌苗长至4.Ocm 即可炼苗，打开瓶盖，室温下炼苗l-2d后(打开瓶盖，静置在培养箱内即可），洗净培养基，取 出试管苗，移栽至自然水体中。
[0016] C，D，E均为无菌环境，平均光照60-70μΕ八m2 · S)，光照周期为12h/d，室内温度(25 ±2)°C。
[0017] 本方法由一个外植体直接诱导出幼苗，30 d的增殖系数可以达到8倍，存活率大于 85%〇
【主权项】
1. 一种金鱼藻组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 外植体选择与预处理:选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的可萌发腋芽的金鱼藻茎 段作为外植体，然后用洗涤剂浸泡，无菌水清洗进行预处理； B、 外植体灭菌： 用酒精和植物组织抗菌剂处理外植体，制备无菌外植体； C、 芽诱导：选择0.50 mg/L 6-BA和1.30mg/L IAA的MS固体培养基，蔗糖质量体积浓度 为3%，pH调至5.8-6.0，固体培养基装于50毫升三角瓶中，每瓶20毫升；固体培养基经过120 °(：灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌处理后的1-1.5cm的金鱼藻外植体，于光照培养箱中静 置培养，待幼芽长至1.0-1.5cm进行增殖培养； D、 增殖培养:选择蔗糖质量体积浓度1.5%的1/2 MS液体培养基，添加0.5-2.00 mg/L 6-BA和0.01-1.00 mg/L IAA的激素;液体培养基分装于200毫升三角瓶中，每瓶100毫升，培 养基灭菌方式与芽诱导相同，接入长1.0-1.5cm的幼芽置于光照培养箱中静置，进行增殖培 养； E、 炼苗和移栽:待金鱼藻无菌苗长至4.0cm即可炼苗，打开瓶盖，室温下炼苗l-2d后洗 净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中； 所述的步骤C，D，E均采用无菌环境，光照60-70μΕ八m2 · s)，光照周期为12h/d，室内温度 (25±2)°C。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，预处理的具体步骤如下：用 碱性洗涤剂浸泡30min，再用自来水冲洗1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复 清洗4-5次，置于无菌操作台。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，在无菌操作台上首先用75% 乙醇浸泡15秒，用无菌水冲洗4-5次，再用5%植物组培抗菌剂PPM进行表面消毒5min，无菌水 冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待用。
【专利摘要】本发明公开了一种金鱼藻组织培养与快速繁殖方法。A、外植体选择：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的植物茎段作为外植体。B、外植体灭菌：用酒精和植物组织抗菌剂处理外植体，制备无菌外植体。C、芽诱导：选择激素种类和浓度配比组合诱导芽生长。D、增殖培养：调整激素配比进行增殖培养？E、炼苗和移栽：在培养箱中打开瓶口培养两天，在转入自然水体中培养。该方法可以不受季节环境限制，培养出大量无菌苗，供水生生态系统恢复之用。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105638481
【申请号】
【发明人】不公告发明人
【申请人】水生藻安生物科技（武汉）有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月6日