专利名称：基于酵母的生物肥的制作方法
1.发明领域本发明涉及包含酵母的生物肥，所述酵母用以固定大气氮气以及分解含磷、钾和/或碳的不溶性化合物。本发明亦涉及生物肥的制法以及生物肥用以提高作物产量的方法。
2.发明背景肥料系支持高产量作物生长所必需。在植物健康生长所需的基本营养素中，大量氮(以NO3-或NH4+摄取)、磷(以H2PO4-摄取)及钾(以K+摄取)营养素为大多数生长于大多数土壤上作物所需(Wichmann.W.等，IFA世界肥料使用手册(IFA World Fevtilizer Use Manual))。如此大量氮、磷及钾营养素主要以无机肥形式提供，可呈处理后的天然无机物或制造所得化学品(K.F.Isherwood，1998，无机肥使用与环境(MineralFertilizer Use and the Environment)，美国环保计划技术报告第26号(United Nations Environmental Programme Technical Report No.26))。无机肥的发展及使用始于1940年代，已经使同样至稍少量农田上的作物产量显著增高因而供应今日众多人口食用。若无此项农业的发展则必须将大量牧场及森林转成耕地(K.F.Isherwood，1998，无机肥使用与环境(Mineral Fertilizer Use and the Environment)，美国环保计划技术报告第26号(United Nations Environmental Programme Technical ReportNo.26))。
尽管无机肥在给人类提供大量农产品中的重要性，但近年来已经了解其对环保造成伤害。无机肥招致土壤损伤。例如大多数氮肥可酸化土壤，因此对植物及其它土壤生物的生长造成不良影响。广泛使用化学氮肥也会抑制天然固氮微生物的活性，因而降低土壤的天然肥沃度。无机肥还将有毒物质引入土壤及产物内。例如从磷酸岩处理所得的磷酸盐肥料常含有小量有毒元素例如镉，镉可能累积于土壤内而被植物摄取。长期使用无机肥也造成严重环境污染。例如由于渗滤作用及土壤的侵蚀导致氮及磷酸盐肥料流失，结果导致土壤及地下水的污染，以及导致地表水的富营养化。污染土壤及水的彻底清理复杂且困难度高。此种工作的成本也庞大。
在对此项问题寻找解决的道时，有些人回头使用有机肥。如众所周知，有机肥来自许多不同来源。有机肥的类型包括农场废物例如农作物残余物以及动物粪便；植物及动物产品残余物例如木材；以及城镇废物例如废水(Wichmann.W.等，IFA世界肥料使用手册(IFA WorldFertilizer Use Manual))。有机肥的营养素含量通常低，对支持植物生长上较为无效。例如牛粪中的总营养素低于2％，其中所含的氮营养素由于丧失至环境中故较难以有效利用(K.F.Isherwood，1998，无机肥使用与环境(Mineral Fertilizer Use and the Environment)，美国环保计划技术报告第26号(United Nations Environmental Programme TechnicalReport No.26))。通常需要极大量的有机肥施用至土壤。为了获得作物高产，有机肥仅用来补充无机肥。因此使用有机肥来取代无机肥仍然无法令人满意地解决无机肥的问题。此外有机肥也造成环保问题。例如某些有机肥若未经处理含有病原微生物例如大肠杆菌(E.coli)，沙门氏菌(Salmonella)及介壳虫科(Coccidae)。有机肥也含有有毒化学品而可能产生讨厌的气味。使用有机肥也造成天然水系的污染和富营养化。因此在世界许多地方包括美国皆立法对有机肥的组成及使用施加显著限制。
曾经提议利用微生物的生物肥作为无机肥的替代品。天然固氮微生物包括细菌例如根瘤菌(Rhizobium)、固氮菌(Azotobacter)以及固氮螺菌(Azospirillum)(参见例如美国专利第5,071,462号)以及真菌例如黄米曲霉(Aspergillus flavus-oryzae)(参见例如美国专利第4,670,037号)已经用于生物肥中。天然微生物可溶解磷酸岩矿或其它不溶性磷酸盐成为可溶性磷酸盐，这些微生物已经单独(例如美国专利第5,912,398号)或与固氮微生物组合(例如美国专利第5,484,464号)用于生物肥中。已经开发出遗传修饰的细菌菌株用于生物肥中。已经开发基于重组DNA技术的办法来创建更有效的固氮、磷分解及钾分解性细菌菌株用于生物肥中，参见例如美国专利第5,578,486号；PCT公报WO 95/09814；中国专利公报CN 1081662A；CN 1082016A；CN 1082017A；CN1103060A；以及CN 1109595A。
但基于天然微生物的生物肥通常不够有效来替代无机肥。因此重要地是开发生物肥，其可替代无机肥用于给农作物补充氮、磷及钾，从而产生高品质农作物同时避免与无机肥相关的问题。本发明提供可替代无机肥的基于酵母的生物肥。
此处引述的文献并非旨在承认任一在此引用的文献为相关的现有技术，或承认引述的文献被视为本申请权利要求的可专利性材料。有关这些文献的日期和内容的陈述系基于申请人可取得的信息而绝非视为这些文献的日期或内容的正确性。
3.发明概述本发明涉及生物肥。本发明的生物肥组合物包含多达6种不同酵母细胞成分、有机基质成分和/或无机基质成分。具体而言，组合物的酵母细胞成分可固定大气氮气、分解不溶性无机物或化合物、分解复杂的碳材料或化合物、过度生产生长因子或过度生产ATP。
本发明使用市面上出售和/或可由公众取得的酵母菌，例如但非限于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本发明的酵母细胞成分系通过在活化条件下培养酵母细胞产生，因此细胞固定大气氮气、分解不溶性磷无机物或化合物、分解不溶性钾无机物或化合物以及分解复杂的碳材料或化合物的能力得到活化或提升。酵母细胞亦在产生过量生长因子或ATP的能力得到活化或提升的条件下培养。具有这些活性的酵母细胞用于将来自大气的氮气转成可由植物用作营养素的含氮化合物，用于从无机物及复杂的分子中释放出不溶性磷、钾及碳，因此这些元素变成可由植物用于生长的形式取得。肥料中的一些酵母细胞通过供给生长因子及ATP而用于支持其它提供植物营养素的酵母细胞的生长。
本发明亦涉及在肥料中使用多种多样的有机及无机材料来支持本发明的酵母菌株的生长。在一个实施方案中，肥料系通过混合煤矿废物及磷酸岩与酵母菌株产生。在另一实施方案中，肥料系通过混合动物粪便及任选的生物消毒剂与酵母菌株产生。在另一实施方案中，肥料系通过混合来自污水处理厂的污泥及生物消毒剂与酵母菌株产生。
本发明亦涉及肥料的制法，其包含混合、干燥及包装本发明的酵母菌株及有机和/或无机材料。
本发明进一步涉及本发明的肥料的用法。本发明的生物肥可用于支持及提升多种多样植物的生长及成熟。
4.附图简述
图1.酵母细胞的活化。1酵母培养物；2容器；3电磁场源。
图2.酵母菌株间形成仿共生关系。4固氮酵母的电磁场源；5磷-分解酵母的电磁场源；6钾-分解酵母的电磁场源；7碳-分解酵母的电磁场源；8酵母培养物；9容器。
图3.酵母细胞适应于土壤类型。10电极；11容器；12电极；13酵母培养物；14电磁场源；15温度控制器。
图4.有机材料研磨过程。16有机原料；17破碎机；18研磨机；19粉状有机材料。
图5.无机材料研磨过程。20无机原料；21破碎机；22研磨机；23粉状无机材料。
图6.酵母发酵过程。24活化酵母细胞；25酵母细胞培养槽，淀粉∶水(35℃)＝1∶2.5，于28-30℃半有氧发酵48至72小时；26收获的培养物。
图7.混合有机及无机原料。27无机材料；28淀粉；29有机材料；30混合器；31混合物；32待转运至肥料生产阶段的混合物。
图8.混合酵母细胞。33固氮、磷-分解、钾-分解及碳-分解酵母的入口；34混合槽；35ATP-产生的酵母；36GP-产生的酵母；37酵母混合物；38待转运至肥料制造阶段的混合物。
图9.肥料制造过程。39酵母混合物；40有机与无机材料混合物；41造粒机(granulizer)；42肥料颗粒。
图10.干燥过程。43肥料颗粒；44第一干燥机；45第二干燥机；46干燥后的肥料。
图11.冷却及包装过程。47干燥后的肥料；48冷却器；49分离器；50散装装袋机；51终产品。
5.发明详述在一个实施方案中，本发明提供包含酵母细胞的生物肥组合物。本发明也在各种实施方案中提供生物肥组合物的制法及生物肥组合物的用法。
本发明的生物肥组合物可替代化学/无机肥给植物特别农作物供应氮(N)、磷(P)及钾(K)。本发明的生物肥组合物可提高作物产量达10-60％。由于本发明的生物肥利用活酵母的代谢活性来转换如大气氮及磷及钾无机物的原料成为植物营养素，故酵母细胞转换和释放这些营养素部分受到土壤中的养分含量调节。土壤的养分含量反过来又部分仰赖环境及植物变化需求。因此由生物肥组合物释放植物营养素可适应于土壤条件且可维持一段时间。
在一个实施方案中，本发明的生物肥组合物包含一种或多种酵母细胞成分。生物肥组合物的酵母细胞成分包含多数个酵母细胞，其可执行下列功能之一，各功能导致给植物提供其中一类营养素(1)固定大气氮气；(2)分解磷无机物或化合物；(3)分解钾无机物或化合物；(4)分解复杂或高分子碳材料或化合物。可包括额外酵母细胞成分来产生生长因子及ATP以支持肥料组合物中的其它酵母菌。
本发明的生物肥组合物进一步包含有机基质成分和/或无机基质成分。肥料组合物的有机基质成分为肥料中的酵母细胞的主要碳源。无机基质成分给肥料组合物中的酵母细胞提供含磷和/或钾的无机物、材料及化合物。有机及无机基质成分也可给植物提供其它无机物如但非限于钙、镁及硫；以及微量营养素如但非限于硼、铜、铁、锰、钼及锌。
用于此处的术语“氮固定”或“固定大气氮气”含括生物过程，其中分子氮或大气氮气被转成一种或多种含氮(N)化合物，包括但非限于氨、铵盐、尿素及硝酸盐。
用于此处的短语“分解磷无机物或化合物”表示生物过程，其将磷(P)化合物例如但非限于那些存在于磷酸岩中的水不溶性磷化合物转成一种或多种不同的磷化合物，它(们)较为容易由植物及其它酵母菌用于存活和/或生长。例如所得磷化合物更可溶于水，并因此可由植物根部摄取。
用于此处的短语“分解钾无机物或化合物”表示生物过程，其将钾(K)化合物例如但非限于那些钾云母中存在的水不溶性钾化合物转成一种或多种不同的钾化合物，它(们)较为容易由植物及其它酵母菌用于存活和/或生长。例如所得钾化合物更可溶于水，并因此可由植物根部摄取。
用于此处的短语“分解复杂或高分子量碳无机物、材料或化合物”表示将复杂有机或无机碳分子以生物转换成为一个或多个碳分子，其通常具有较低分子量，且较为容易由植物及其它生物包括其它酵母菌用于存活和/或生长。例如这包含将风化煤中的高分子量碳化合物转成简单的碳水化合物如戊糖及己糖。此过程包括聚合物碳化合物中的长链碳原子被切割。
用于此处的术语“生长因子”表示酵母生长通常需要的分子，包括但非限于维生素，特别是维生素B复合体例如维生素B-1、核黄素(维生素B-2)、维生素B-12、烟酸(B-3)、吡哆醇(B-6)、泛酸(B-5)；叶酸；生物素；对氨基苯甲酸；胆碱；及肌醇。
多种多样的有机及无机材料可用以供给磷、钾及复杂的高分子碳无机物、材料及化合物，这些物质欲由酵母细胞转成由酵母及植物使用的营养素。可结合本发明使用的有机及无机材料包括但非限于矿物例如但非限于磷酸岩或岩石磷酸盐、磷灰石、磷钙石、钾石盐、石盐、光卤石、钾云母、褐煤；工业用材料或废物例如但非限于煤矿废料、风化煤、煤粉及碳氢化合物废物；环保材料及废物例如但非限于污水处理厂及填土的污泥、泥浆，例如草炭泥浆、河床及湖床泥浆；有机废物例如但非限于都市区的废物及粪便以及动物粪便例如家禽粪便、牛粪、猪粪、羊粪及鸟粪，来自植物的废料，来自动物的废料包括鱼粉、骨粉、人类废物、干燥血等，以及来自含纤维素、淀粉和/或其它碳水化合物的植物性材料的发酵产物或副产物。
此外视需求而定，消毒剂可包括于生物肥组合物中。以环保安全的消毒剂为较佳。例如生物消毒剂超-CM61可与环保及有机废物例如都市区的废物及粪便以及动物粪便一起使用。
在各种实施方案中，本发明的生物肥组合物包含至少一种酵母细胞成分且优选6种酵母菌细胞成分。发明人发现，在某些培养条件下，多种酵母菌株可被诱发而具有下列6种活性(1)固定大气氮气；(2)分解磷无机物或化合物；(3)分解钾无机物或化合物；(4)分解复杂或高分子量碳材料或化合物；(5)产生过量的生长因子，其量足够支持肥料组合物中的其它酵母菌株的需求；以及(6)产生过量的ATP，其量足够支持肥料组合物中其它酵母菌株的需求。培养条件决定培养的酵母活性得到活化或提升。6种活性的各个特定培养条件分别在5.1-5.6节中详细描述。
根据本发明，生物肥的酵母细胞成分的生产系通过在适当培养基中有电磁场存在下培养多数酵母细胞。电磁场可由本领域众所周知的多种装置产生。举例设置的示意图显示于
图1中。所需频率及振幅的电磁场由电磁源(3)产生，其包含一个或多个信号产生器，能产生电磁波，优选为100MHz至2000MHz频率范围的正弦波。若有所需，也可使用信号放大器来提高输出。电磁场可由多种手段施加至培养物上，包括将培养物放置于信号发射器附近。在一实施方案中，电磁场系由浸没于培养物(1)中的电极外加。在优选实施方案中，电极之一为金属板，另一电极包括多数个电线配置于容器(2)内部，以便电磁场能量可均匀分布于培养物中。使用的电极线数目依据于培养物容积及电线直径。在优选实施方案中，对于具有多达5000毫升容积的培养物，每100毫升培养物可使用直径0.1-1.2毫米的电极线；对于容积大于1000升的培养物，每1000升培养物可使用直径3-30毫米的电极线。
预计用于本发明的酵母类别包括但非限于下列种属的酵母菌糖酵母(Saccharomyces)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，掷孢酵母(Sporobolomyces)，球拟酵母(Torulopsis)，丝孢酵母(Trichosporon)，威克酵母(Wickerhamia)，阿舒氏囊霉菌(Ashbya)，芽生菌(Blastomyces)，假丝酵母(Candida)，固囊酵母(Citeromyces)，克利伯菌(Crebrothecium)，隐球酵母(Cryptococcus)，德巴利氏酵母(Debaryomyces)，拟内孢霉(Endomycopsis)；地霉(Geotrichum)，汉逊氏酵母(Hansenula)，克勒克氏酵母(Kloeckera)，油脂酵母(Lipomyces)，毕赤氏酵母(Pichia)，红螺菌(Rhodosporidium)，以及红酵母(Rhodotorula)。酵母菌株的非限制性例子包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Hansen，ACCC2034，ACCC2035，ACCC2036，ACCC2037，ACCC2038，ACCC2039，ACCC2040，ACCC2041，ACCC2042，AS2.1，AS2.4，AS2.11，AS2.14，AS2.16，AS2.56，AS2.69，AS2.70，AS2.93，AS2.98，AS2.101，AS2.109，AS2.110，AS2.112，AS2.139，AS2.173，AS2.174，AS2.182，AS2.196，AS2.242，AS2.336，AS2.346，AS2.369，AS2.374，AS2.375，AS2.379，AS2.380，AS2.382，AS2.390，AS2.393，AS2.395，AS2.396，AS2.397，AS2.398，AS2.399，AS2.400，AS2.406，AS2.408，AS2.409，AS2.413，AS2.414，AS2.415，AS2.416，AS2.422，AS2.423，AS2.430，AS2.431，AS2.432，AS2.451，AS2.452，AS2.453，AS2.458，AS2.460，AS2.463，AS2.467，AS2.486，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.516，AS2.535，AS2.536，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，AS2.576，AS2.593，AS2.594，AS2.614，AS2.620，AS2.628，AS2.631，AS2.666，AS2.982，AS2.1190，AS2.1364，AS2.1396，IFFI 1001，IFFI 1002，IFFI 1005，IFFI 1006，IFFI 1008，IFFI 1009，IFFI 1010，IFFI 1012，IFFI 1021，IFFI 1027，IFFI 1037，IFFI 1042，IFFI 1043，IFFI 10451，IFFI 1048，IFFI 1049，IFFI 1050，IFFI 1052，IFFI 1059，IFFI 1060，IFFI 1063，IFFI 1202，IFFI 1203，IFFI 1206，IFFI 1209，IFFI 1210，IFFI 1211，IFFI 1212，IFFI 1213，IFFI 1215，IFFI 1220，IFFI 1221，IFFI 1224，IFFI 1247，IFFI 1251，IFFI 1270，IFFI 1277，IFFI 1287，IFFI 1289，IFFI 1290，IFFI 1291，IFFI 1291，IFFI 1292，IFFI 1293，IFFI 1297，IFFI 1300，IFFI 1301，IFFI 1302，IFFI 1307，IFFI 1308，IFFI 1309，IFFI 1310，IFFI 1311，IFFI 1331，IFFI 1335，IFFI 1336，IFFI 1337，IFFI 1338，IFFI 1339，IFFI 1340，IFFI 1345，IFFI 1348，IFFI 1396，IFFI 1397，IFFI 1399，IFFI 1411，IFFI 1413，ACCC2043，AS2.2，AS2.3，AS2.8，AS2.53，AS2.163，AS2.168，AS2.483，AS2.541，AS2.559，AS2.606，AS2.607，AS2.611，AS2.612；薛氏糖酵母(Saccharomyceschevalieri) Guillermond，AS2.131，AS2.213；戴耳克氏糖酵母(Saccharomyces delbrueckii)Lindner，AS2.285；戴耳克氏糖酵母(Saccharomyces delbrueckii)Lindner变种蒙古Lodder，AS2.209，AS2.1157；微小糖酵母(Saccharomyces exiguus)Hansen，AS2.349，AS2.1158；发酵性糖酵母(Saccharomyces fermentati)(Saito)Lodder et vanRij，AS2.286，AS2.343；罗哥糖酵母(Saccharomyces logos)van laer etDenamur ex Jorgensen，AS2.156，AS2.327，AS2.335；蜂蜜糖酵母(Saccharomyces mellis)Lodder et Kreger Van Rij，AS2.195；小椭圆糖酵母(Saccharomyces microellipsoides)Osterwalder，AS2.699；卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)Osterwalder，AS2.100；罗茜糖酵母(Saccharomyces rosei)Lodder et kreger van Rij，AS2.287；鲁氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)Boutroux，AS2.178，AS2.180，AS2.370，AS2.371；清酒糖酵母(Saccharomyces sake)，ACCC2045；葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum Beijer)，IFFI 1023，IFFI 1032，IFFI 1036，IFFI 1044，IFFI 1072，IFFI 1205，IFFI 1207；魏莱氏糖酵母(Saccharomyces willianus)Saccardo，AS2.5，AS2.7，AS2.119，AS2.152，AS2.293，AS2.381，AS2.392，AS2.434，AS2.614，AS2.1189；酵母种，AS2.311；路为氏糖酵母(Saccharomyces ludwigii)Hansen，ACCC2044，AS2.243，AS2.508；中华糖酵母(Saccharomyces sinenses)Yue，AS2.1395；八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)Beiierinck，ACCC 2046，AS2.1148；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Linder，ACCC2047，ACCC2048，AS2.248，AS2.249，AS2.255，AS2.257，AS2.259，AS2.260，AS2.274，AS2.994，AS2.1043，AS2.1149，AS2.1178，IFFI.1056；红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)Kluyver etvan Niel，ACCC 2049，ACCC 2050，AS2.619，AS2.962，AS2.1036；赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)(Fischer et Brebeck)Kluyver et van Neil，ACCC2051，AS2.261，AS2.262；白色球拟酵母(Torulopsis candida)(Saito)Lodder，ACCC2052，AS2.270；无名球拟酵母(Torulopsis famta)(Harrison)Lodder et van Rij，ACCC2053，AS2.685；球状球拟酵母(Torulopsis globosa)(Olson et Hammer)Lodder etvan Rij，ACCC2054，AS2.202；平常球拟酵母(Torulopsis inconspicua)Lodder et van Rij，AS2.75；贝雷氏丝孢酵母(Trichosporon behrendoo)Lodder et Kreger van Rij，ACCC2055，AS2.1193；头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum)Diddens et Lodder，ACCC2056，AS2.1385；皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)(de Beurm等)Ota，ACCC2057，AS2.25，AS2.570，AS2.571，AS2.1374；萤光威克酵母(Wickerhamiafluoresens)(Soneda)Soneda，ACCC2058，AS2.1388；棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)(Ashby et Nowell)Guillermond，ACCC2001，AS2.475，AS2.1176；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)Gilehrist et Stikes，ID(D 10)23；白色假丝酵母(Candida albicans)(Robin)Berkhout，ACCC2002，AS2.538，ID 16u(C1)u，ID 61(v(C1)v；树木假丝酵母(Candida arborea)，AS2.566；季也蒙氏假丝酵母(Candidaguillermondii)(Castellani)Langeron et guerra，AS2.63，ID 21a(C5)a，ID21b(C5)b；克鲁斯氏假丝酵母(Candida Krusei)(Castellani)Berkhout，AS2.1045；莱比可假丝酵母(Candida lambica)(Lindner et Genoud)van.Uden et Buckley，AS2.1182；解脂假丝酵母(Candidalipolytica)(Harrison)Diddens et Lodder，AS2.1207，AS2.1216，AS2.1220，AS2.1379，AS2.1398，AS2.1399，AS2.1400；副克柔氏假丝酵母(Candida parakrusei)(Castellani et Chalmer)Langeron et Guerra，ID 19a(C4)a，ID 19b(C4)b，ID 19c(C4)c，ID 19d(C4)d；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(Ashford)Langeron et Talice，AS2.590；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(Ashford)et Talice Var.imtermedia VanRij et Verona，AS2.491；假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)(Castellani)Basgal，AS2.68，ID64(C3)；铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)(Lindner)Windisch，AS2.492；粗壮假丝酵母(Candida robusta)Diddens et Lodder，AS2.1195；皱摺假丝酵母(Candidarugousa)(Anderson)Diddens et Loddeer，AS2.511，AS2.1367，AS2.1369，AS2.1372，AS2.1373，AS2.1377，AS2.1378，AS2.1384；热带假丝酵母(Candida tropicalis)(Castellani)Berkout，ACCC2004，ACCC2005，ACCC2006，AS2.164，AS2.402，AS2.564，AS2.565，AS2.567，AS2.568，AS2.617，AS2.637，AS2.1387，AS2.1397，ID 17a(C2)a，ID 17b(C2)b，ID 17d(C2)d；产朊假丝酵母(Candida utilis)Henneberg Lodder et KregerVan Rij，AS2.120，AS2.281，AS2.1180；基质固囊酵母(Citeromycesmatritensis)(Santa Maria)Santa Maria，AS2.1401；阿舒克利伯菌(Crebrothecium ashbyii)(Guillermond)Routein，ACCC2013，ACCC2014，AS2.481，AS2.482，AS2.1197；罗伦氏隐球酵母(Cryptococcus laurentii)(Kufferath)Skinner，ACCC2007，AS2.114，ID 95(y2)；新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)(Sanfelice)Vuillemin，ID25u(D2)u，ID 25v(D2)v，ID 25w(D2)w；汉逊氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)(Zopf)Lodder et Kreger-van Rij，ACCC2010，AS2.45；克洛氏德巴利氏酵母(Debaryomyces kloeckeri)Guilliermond etPeju，ACCC2008，ACCC2009，AS2.33，AS2.34，AS2.494；德巴利氏酵母种属(Debaryomyces sp.)，ACCC2011，ACCC2012；肋状拟内子包霉菌(Endomycopsis fibuligera)(Lindner)Dekker，ACCC2015，AS2.1145；阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)Guilliermond；白地霉(Geotrichum candidum)Link，ACCC2016，AS2.361，AS2.498，AS2.616，AS2.1035，AS2.1062，AS2.1080，AS2.1132，AS2.1175，AS2.1183；罗威氏地霉(Geotrichum ludwigii)(Hansen)Fanf等，AS2.363；健强地霉(Geotrichum robustum)Fang等，ACCC2017，AS2.621；甜香地霉(Geotrichum suaveolens)(Krzemecki)Fang等，AS2.364；异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)(Hansen)H et P sydow，ACCC2018，AS2.294，AS2.295，AS2.296，AS2.297，AS2.298，AS2.299，AS2.300，AS2.302，AS2.338，AS2.339，AS2.340，AS2.341，AS2.470，AS2.592，AS2.641，AS2.642，AS2.735，AS2.782，AS2.794；产阿拉伯糖醇汉逊氏酵母(Hansenula arabitolgens)Fang，AS2.887；杰丁汉逊氏酵母(Hansenula jadinii)Wickerham，ACCC2019；土星汉逊氏酵母(Hansenulasaturnus)(Klocker)H et P sydow，ACCC2020，AS2.303；施氏汉逊氏酵母(Hansenula schneggii)(Weber)Dekker，AS2.304；亚菌膜汉逊氏酵母(Hansenula subpelliculosa)Bedford，AS2.740，AS2.760，AS2.761，AS2.770，AS2.783，AS2.790，AS2.798，AS2.866；柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)(Reess emend.Klocker)Janke，ACCC2021，ACCC2022，ACCC2023，AS2.197，AS2.496，AS2.711，AS2.714；斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)Lodder et van Rij，ACCC2024，AS2.1390；粉状毕赤氏酵母(Pichia farinosa)(Lindner)Hansen，ACCC2025，ACCC2026，AS2.86，AS2.87，AS2.705，AS2.803；膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)Hansen，ACCC2027，AS2.89，AS2.661，AS2.1039；类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)Banno，ACCC2028，AS2.1389；橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)(Saito)Lodder，ACCC2029，AS2.280；胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(Fresenius)Harrison，ACCC2030，AS2.102，AS2.107，AS2.278，AS2.499，AS2.694，AS2.703，AS2.704，AS2.1146；微小红酵母(Rhodotorula minuta)(Saito)Harrison，AS2.277；深红酵母(Rhodotorularubar)(Demme)Lodder，ACCC2031，AS2.21，AS2.22，AS2.103，AS2.105，AS2.108，AS2.140，AS2.166，AS2.272，AS2.279，AS2.282；中华红酵母(Rhodotorula sinesis)Lee，AS2.1391；拜烈氏糖酵母(Saccharomyces bailii)Lindner，AS2.312；以及卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)Hansen，ACCC2032，ACCC2033，AS2.113，AS2.116，AS2.118，AS2.121，AS2.132，AS2.162，AS2.189，AS2.200，AS2.216，AS2.265，AS2.377，AS2.417，AS2.420，AS2.440，AS2.441，AS2.443，AS2.444，AS2.459，AS2.595，AS2.605，AS2.638，AS2.742，AS2.745，AS2.748，AS2.1042。
某些酵母种可根据本发明得到活化且包括于本发明中，已知对人类和/或其它活生物具有病原性，例如棉桃阿舒氏囊霉(Ashby et Nowell)Guillermond，ACCC2001，AS2.475，AS2.1176；皮炎芽生菌Gilehrist etStikes，ID(D 10)23；白色假丝酵母(Robin)Berkhout，ACCC2002，AS2.538，ID 16u(C1)u，ID 61v(C1)v；副克柔氏假丝酵母(Castellani etChalmer)Langeron et Guerra，ID 19a(C4)a，ID 19b(C4)b，ID 19c(C4)c，ID 19d(C4)d；热带假丝酵母(Castellani)Berkout，ID 17a(C2)a，ID 17b(C2)b，ID 17d(C2)d；基质固囊酵母(Santa Maria)Santa Maria，AS2.1401；阿舒克利伯菌(Guillermond)Routein，ACCC2013，ACCC2014；罗伦氏隐球酵母(Kufferath)Skinner，ACCC2007，AS2.114，ID 95(y2)；新型隐球酵母(Sanfelice)Vuillemin，ID 25u(D2)u，ID 25v(D2)v，ID 25w(D2)w；汉逊氏德巴利氏酵母(Zopf)Lodder et Kreger-vanRij，ACCC2010；克洛氏德巴利氏酵母Guilliermond et Peju，ACCC2008，ACCC2009；德巴利氏酵母种，ACCC2011，ACCC2012；肋状拟内孢霉菌(Lindner)Dekker，ACCC2015，AS2.1145。某些情况下若野外开放使用可能危害人体和/或其它生物健康，则在本发明的生物肥中使用这些病原酵母较不佳。
通常以糖酵母属的酵母菌为较佳。啤酒糖酵母菌株中以啤酒糖酵母汉逊(Hansen)为较佳菌株。最佳酵母菌株为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏号为AS2.501，AS2.535，AS2.441，AS2.406，AS2.382及AS2.16的啤酒糖酵母汉逊菌株。通常酵母菌株可得自私有或公有实验室培养物，或得自公开的培养物保藏单位，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国科学院微生物所，中国北京海淀区，邮政信箱2714，邮编100080。
虽然较佳，但本发明的酵母细胞成分的制备非仅限于从酵母纯菌株开始。各酵母细胞成分可通过培养不同种或株的酵母细胞混合物来产生。酵母细胞成分的组成可由本领域众所周知的标准酵母鉴别技术确定。
某些酵母可发挥一种所需的功能比其它酵母更有效。于本发明条件下培养之前或之后，任一种或任一株酵母进行六种所需功能之一的能力可容易地由本领域已知方法测试。例如固氮量可由美国专利第5,578,486号所述的修饰的乙炔还原方法测定，在此以其全文引作参考。修饰的乙炔还原法通过测量空气容积内分子氮的减少来测定氮被固定的量。氮被固定的量也可通过测量酵母细胞产生的氨及硝酸盐来确定(参见例如Grewling等，1965年，康乃尔农业实验状态公报(CornellAgr Exp Sta Bull)96022-25)。对于其它功能，植物可利用的磷数量作为从不溶性或生物不可利用的磷化合物转变结果，可通过钼蓝法测定(参见例如Murphy等，1962年，分析化学期刊(Analytica Chimica Acta)2731-36)或紫外吸收法；而从不溶性或生物不可利用的钾化合物转变的可利用的钾数量可例如由火焰原子吸收光谱术测定(参见例如Puchyr等，1986年，分析化学协会期刊(J.Assoc.Off.Anal.Chem.)69868-870)。在生物肥组合物加至土壤后酵母供给植物可利用的氮、磷及钾的能力可由本领域已知的多种技术测试。例如酵母细胞在土壤中所产生的植物可利用的氨、硝酸盐、磷及钾通过Morgan土壤试验系统进行提取并定量分析(参见例如Lunt等，1950年，康乃尔农业实验状态公报(Conn Agr Exp Sta Bull)541)。
不欲受任何理论或机理所限，本发明人相信培养条件活化和/或提升酵母的基因或一组基因的表达，由此酵母细胞变成活性或更有效地执行各自功能。
根据本发明，生物肥组合物包含至少一种能执行下列生物功能之一的酵母细胞成分(1)固定大气氮气；(2)分解肥料组合物或土壤中存在的不溶性或生物不可利用的磷无机物或化合物；(3)分解肥料组合物或土壤中存在的不溶性或生物不可利用的钾无机物或化合物；(4)分解肥料组合物或土壤中存在的复杂或高分子量碳材料或化合物；(5)生产过量生长因子，其量足够支持肥料组合物中的其它酵母菌株所需；以及(6)生产过量ATP，其量足够支持肥料组合物中的其它酵母菌株所需。在优选的实施方案中，生物肥组合物可包含一种酵母菌株至多达6种不同酵母种或菌株，各菌株在特定条件下培养而诱发或使各自功能的能力最大化。须了解也考虑其它配方。如此若有所需，生物肥组合物可删除一种或多种前述酵母细胞成分。例如在富含生物可利用的磷的土壤中，肥料组合物可调配成不含磷化合物分解的酵母所组成的成分。在本发明最优选的实施方案中，预期生物肥组合物含有全部6种酵母细胞成分以及有机和/或无机基质。
在本发明的另一实施方案中，各种酵母细胞成分的酵母细胞存在于混合物中，酵母细胞可于某些条件下培养，以至具有不同功能的酵母细胞可彼此供给和/或彼此仰赖营养素及生长因子。结果在本发明的肥料组合物的各种酵母细胞成分间建立起仿共生关系。此种培养过程是任选的，但可改良生物肥的稳定性及功效，由此肥料更适合在天然土壤环境中长期使用。此种任选过程的培养条件述于第5.7节。
在本发明的又另一实施方案中，酵母细胞也可于某些条件下培养以便将酵母细胞调整适应特定类型的土壤。此种培养过程为任选的，可分开应用至各个酵母细胞成分或应用至酵母细胞成分的混合物中。结果为酵母在特殊土壤环境下生长及存活更好。此种任选过程的培养条件述于第5.8节。
如此处所用，若有生物肥存在于土壤或施用于植物根、茎、叶或其它部位，生物肥组合物可支持或提升植物生长，该植物或植物部分增加生存力、大小、重量、发芽速率、生长速率或成熟速率。因此，生物肥组合物可用于任一种农艺、园艺及森林应用上。生物肥组合物可用于大规模的商业耕作、开放性田地或温室内、或甚至用于装饰性植物内部。优选的是生物肥用以提升农作物的生长例如但非限于谷类作物、蔬菜作物、水果作物、花作物及草作物。例如生物肥可用于小麦、大麦、玉米、大豆、稻米、燕麦、马铃薯、苹果、柳橙、西红柿、香瓜、樱桃、柠檬、莴苣、胡萝卜、甘蔗、烟草、棉花等。
生物肥组合物可以常规肥的相同方式施用。如相关领域中专业技术人员已知，可采用多种方法及设备。在一实施方案中，本发明的酵母菌株的培养醪直接施用至土壤或植物。在另一实施方案中，本发明的酵母菌株干粉施用至土壤或植物。在又另一实施方案中，本发明的酵母细胞成分及有机和无机基质成分的混合物施用至土壤或植物。生物肥组合物可由喷液器、喷雾器及其它可自动化的机械装置施用至土壤。生物肥组合物可直接施用至植物例如浸泡植物种子和/或部或喷洒到叶上。这种施用可定期进行，例如每年一次或每个生长季节一次或视需要更为频繁。本发明的生物肥组合物也可与其它类型肥料结合使用或轮替使用。
于第5.1-5.6节分别说明用于固氮、磷化合物分解、钾化合物分解、复杂碳化合物分解、生长因子生产及ATP生产的酵母细胞成分。描述各种酵母细胞成分的制法。第5.7节描述本发明的肥料组合物中各种酵母菌株间建立仿共生(Symbiosis-like)关系的方法。第5.8节描述使本发明的酵母细胞适合于特殊类型土壤的方法。第5.9节描述生物肥组合物的制造。也描述有机及无机原料的制法以及生物肥的制法，包括混合、干燥、冷却及包装。在本发明的各种实施方案中，使用处理、移转及储存微生物的标准技术。虽然并非必要，但进行本发明方法时采用无菌条件或干净环境是理想的。
5.1.固氮酵母细胞成分氮固定是将大气氮气转成氨及硝酸盐的过程。天然微生物中已发现超过70个属的接近800种微生物，大多数为细菌及蓝细菌(cyanobacteria)可固氮。某些固氮微生物例如根瘤菌与植物形成共生关系，特别在豆科植物根部。其它例如固氮菌可自由存活并可固定土壤中的氮。
本发明中酵母固氮能力被活化或提升，所得固氮酵母细胞可用作本发明的生物肥组合物的成分。
根据本发明，具有固氮能力增强的酵母细胞系通过在适当培养基中有电磁场存在下培养细胞来制备。活化或提升酵母固氮能力的电磁场频率通常在800MHz至1000MHz的范围内。酵母细胞经培养一段足够长的时间后，可采用本领域众所周知的方法对细胞固氮的能力进行测试。
本发明制造固氮酵母细胞的方法在液体培养基中进行。培养基含有可由酵母细胞同化的营养源。通常碳水化合物例如糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉可单独或组合用于培养基中作为可同化碳源。培养基中所用的碳水化合物来源的确切数量部分依赖于培养基的其它成分，但碳水化合物的量通常占培养基重量的约0.1％至5％且优选约0.5％至2％及最优选约1％。这些碳源可分开使用，或数种碳源可合并用于培养基。
可掺入培养基的无机盐类包括可生成钠、钾、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常见盐类。营养素无机盐的非限制性例子有CaCO3、KH2PO4、MgSO4、NaCl及CaSO4。
表I固氮酵母的培养基组成
须注意表I提供的培养基组成并非限制性的。本领域专业技术人员鉴于实用及经济考虑例如培养规模以及培养基成分的当地供应量可对培养基作出多种修饰。
培养过程始于对每100毫升培养基接种1毫升选定酵母菌株的接种物，其细胞密度为102-105细胞/毫升，优选3×102-104细胞/毫升。过程可视需求放大或缩小规模。酵母培养物在电磁场存在下生长约12-24小时，优选约24小时。电磁场可由本领域已知的任一种手段施用，频率在860至870MHz的范围，优选约865MHz，更优选865.522至865.622MHz及最优选约865.572MHz。电磁场振幅系在1000-2000mV的范围，优选约1250mV。第一期培养后，酵母细胞进一步在基本相同条件下再培育约24小时，但振幅提升至4000-5000mV的较高水平，优选至约4656mV。培养过程的举例设置描述在
图1中。本发明方法在约25℃至30℃下进行；但优选在28℃下操作此过程。培育过程优选在溶氧浓度为0.025至0.8mol/立方米，优选0.4mol/立方米的条件下进行。溶氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。
培养过程结束时，固氮酵母细胞可由本领域已知的多种方法从培养物中回收，并储存在低于约0℃至4℃。固氮酵母细胞也可干燥且以粉末形式储存。
本领域已知的任一种方法可用于测试培养后的酵母细胞固氮的能力。例如用于测量微生物固氮的修饰的乙炔还原法可来评估制备后酵母的固氮能力。修饰的乙炔还原法描述在美国专利第5,578,486号中，在此以其全文引作参考。例如1毫升制备后的酵母培养物接种于密封250毫升烧瓶内的30毫升根据表I的培养基中。培养物于20-28℃下有含约20％容积比氧气及80％容积比氮气的空气存在下温育24-56小时。然后固氮数量利用本领域已知的任一种手段例如但非限于气相色谱法，通过测量空气中氮气的减少来测定。本发明的酵母细胞的固氮量为每克酵母干重至少约10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母汉逊菌株AS2.501的固氮量可达约11200毫克/克。
5.2.磷-分解的酵母细胞成分本发明的磷化合物-分解(P-分解)的酵母将不溶性或生物不可利用的含磷物质例如磷酸岩转成可溶性磷化合物，故变成植物可利用。
本发明中，酵母分解不溶性含磷物质的能力被活化或提升，结果所得P-分解酵母细胞可用作本发明的生物肥组合物的成分。
根据本发明，能分解磷的酵母细胞可通过在适当培养基中有电磁场存在下培养细胞来制备。活化或提升酵母的磷分解的电磁场频率通常在300MHz至500MHz的范围。细胞经培养一段足够长的时间后，采用本领域众所周知的方法可对细胞分解含磷物质的能力进行测试。
本发明含磷酵母细胞的制法可于液体培养基中进行。培养基含有可由酵母细胞同化的营养源。通常碳水化合物例如糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等及淀粉可单独或组合用作为培养基中的可同化碳源。培养基中所用碳源的确切数量部分依赖于培养基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培养基重量的约0.1％至5％及优选约0.5％至2％及最优选约1.5％。这些碳源可个别使用或若干碳源可组合用于培养基中。
可掺入培养基中的无机盐为能生成钠、钾、钙、硫酸根、碳酸根等离子的寻常盐类。营养素无机盐的非限制性例子有碳酸钙、硫酸镁、氯化钠及硫酸钙。适当形式的含不溶性磷的物质也可包括于培养基中。非限制性例子包括筛目≥200的磷酸岩粉末。其它不溶性含磷物质也可分开或合并使用。
表II磷分解酵母的培养基组成
须注意表II提供的培养基组成并非限制性的。本领域那些专业人员鉴于实用及经济考虑例如培养规模以及培养基成分的当地供应量可对培养基作出多种修饰。
培养过程始于对每100毫升培养基接种1毫升选定酵母菌株的接种物，其细胞密度102-105细胞/毫升，优选3×102-104细胞/毫升。过程可视需求放大或缩小规模。酵母培养物在电磁场存在下生长约12-24小时，优选约24小时。电磁场可由本领域已知的任一种手段施用，频率为360至370MHz的范围，优选约366MHz，更优选366.199至366.287MHz及最优选约366.243MHz。电磁场振幅为1000-2000mV的范围，优选约1230mV。第一期培养后，酵母细胞进一步在基本相同条件下再培育约24小时，但振幅提升至4000-5000mV的较高水平，优选至约4570mV。培养过程的举例设置描述在
图1中。本发明方法在约25℃至30℃下进行；但优选在28℃下操作此过程。培育过程优选在溶氧浓度为0.025至0.8mol/立方米，优选0.4mol/立方米的条件下进行。溶氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。
培养过程结束时，P-分解酵母细胞可由本领域已知的多种方法从培养物中回收，并储存在低于约0℃至4℃。P-分解酵母细胞也可干燥且以粉末形式储存。
本领域已知的任一种方法皆可用于测试培养后的酵母细胞分解含不溶性磷的物质的能力。在一实施方案中，1毫升制备后的酵母培养物接种于30毫升根据表II的培养基中。培养物在20-28℃下温育24-56小时。然后培养物中PO43-形式的生物可利用的磷含量可由本领域已知的任一种方法测定，包括但非限于紫外光吸收光谱测定法。培养物中PO43-含量为每克酵母干重至少提高10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母汉逊菌株AS2.535培养物中PO43-含量提高至约4460毫克/克。
5.3.钾-分解的酵母细胞成分本发明的钾化合物分解(K-分解)的酵母可将含不溶性钾的物质例如钾云母转成可溶性钾，故可由植物利用。
本发明中，多数个酵母分解不溶性含钾物质的能力被活化或提升，结果所得K-分解的酵母细胞可用作本发明的生物肥组合物的成分。
根据本发明，能分解钾的酵母细胞可通过在适当培养基中有电磁场存在下培养细胞来制备。活化或提升酵母的钾分解的电磁场频率通常为100MHz至300MHz的范围。细胞经培养一段足够长的时间后，采用本领域众所周知的方法可对细胞分解含钾物质的能力进行测试。
本发明的K-分解酵母细胞的制法可于液体培养基进行。培养基含有可由酵母细胞同化的营养源。通常碳水化合物例如糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等及淀粉可单独或组合用作培养基的可同化碳源。培养基中所用碳源的确切数量部分依赖于培养基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培养基重量的约0.1％至5％及优选约0.5％至2％及最优选约1.5％。这些碳源可个别使用或若干碳源可组合用于培养基中。
可掺入培养基中的无机盐为能生成钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的寻常盐类。营养素无机盐的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸钙、硫酸镁、氯化钠及硫酸钙。适当形式的含不溶性钾的物质也可包括于培养基中。非限制性例子包括筛目≥200的钾云母粉末。其它含不溶性钾的物质也可分开或合并使用。
表III钾-分解酵母的培养基组成
须注意表III提供的培养基组成并非限制性的。本领域那些专业人员鉴于实用及经济考虑例如培养规模以及培养基成分的当地供应量可对培养基作出多种修饰。
培养过程始于对每100毫升培养基接种1毫升选定酵母菌株的接种物，其细胞密度102-105细胞/毫升，优选3×102-104细胞/毫升。过程可视需求放大或缩小规模。酵母培养物在电磁场存在下生长约12-24小时，优选约24小时。电磁场可由本领域已知的任一种手段施用，频率为250-260MHz的范围，优选约255MHz，更优选255.388至255.462MHz及最优选255.425MHz。电磁场振幅在1000-2000mV的范围，优选约1340mV。第一期培养后，酵母细胞进一步在基本相同条件下再培育约24小时，但振幅提升至4000-5000mV的较高水平，优选至约4850mV。培养过程的举例设置描述在
图1中。本发明方法在约25℃至30℃下进行；但优选在28℃下操作此过程。培育过程优选在溶氧浓度为0.025至0.8mol/立方米，优选0.4mol/立方米的条件下进行。溶氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。
培养过程结束时，K-分解的酵母细胞可由本领域已知的多种方法从培养物中回收，并储存在低于约0℃至4℃。K-分解的酵母细胞也可干燥且以粉末形式储存。
本领域已知的任一种方法皆可用于测试培养后的酵母细胞分解含不溶性钾的物质的能力。在一实施方案中，1毫升制备后的酵母培养物接种于30毫升根据表III的培养基中。培养物在20-28℃下温育24-56小时。然后培养物中K+形式的生物可利用的钾含量可由本领域已知的任一种方法测定，包括但非限于原子吸收光谱测定法。培养物中K+含量为每克酵母干重至少提高10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母汉逊菌株AS2.441培养物中K+含量可达约4050毫克/克。
5.4.复杂碳-分解的酵母细胞成分本发明的碳-分解(C-分解)的酵母可将复杂、通常高分子量的碳化合物和物质如纤维素转成简单的碳水化合物，如戊糖和己糖。这些简单的碳水化合物被其他酵母细胞利用以支持它们的生长和活性。
本发明中，酵母分解复杂碳化合物的能力被活化或提升，结果所得C-分解的酵母细胞可用作本发明的生物肥组合物的成分。
根据本发明，能分解碳的酵母细胞可通过在适当培养基中有电磁场存在下培养细胞来制备。用于酵母碳分解的电磁场频率通常为1000MHz至1200MHz的范围。细胞经培养一段足够长的时间后，采用本领域众所周知的方法可对细胞分解复杂碳化合物的能力进行测试。
本发明的C-分解酵母细胞的制法可于液体培养基进行。培养基含有可由酵母细胞同化的营养源。适当形式的含复杂碳的物质如纤维素、煤等可用作培养基中的碳源。培养基中所用碳源的确切数量部分依赖于培养基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培养基重量的约0.1％至5％及优选约0.1％至1％及最优选约0.5％。这些碳源可个别使用或若干碳源可组合用于培养基中。
可掺入培养基中的无机盐为能生成钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的寻常盐类。营养素无机盐的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸钙、硫酸镁、氯化钠及硫酸钙。
表IVC-分解酵母的培养基组成
须注意表IV提供的培养基组成并非限制性的。本领域那些专业人员鉴于实用及经济考虑例如培养规模以及培养基成分的当地供应量可对培养基作出多种修饰。
培养过程始于对每100毫升培养基接种1毫升选定酵母菌株的接种物，其细胞密度102-105细胞/毫升，优选3×102-104细胞/毫升。过程可视需求放大或缩小规模。酵母培养物在电磁场存在下生长约12-24小时，优选约24小时。电磁场可由本领域已知的任一种手段施用，频率为1087-1097MHz的范围，优选约1092MHz，更优选1092.346至1092.428MHz及最优选1092.387MHz。电磁场振幅在1000-2000mV的范围，优选约1530mV。第一期培养后，酵母细胞进一步在基本相同条件下再培育约24小时，但振幅提升至4000-5000mV的较高水平，优选至约4720mV。培养过程的举例设置描述在
图1中。本发明方法在约25℃至30℃下进行；但优选在28℃下操作此过程。培育过程优选在溶氧浓度为0.025至0.8mol/立方米，优选0.4mol/立方米的条件下进行。溶氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。
培养过程结束时，C-分解的酵母细胞可由本领域已知的多种方法从培养物中回收，并储存在低于约0℃至4℃。C-分解的酵母细胞也可干燥且以粉末形式储存。
本领域已知的任一种方法皆可用于测试培养后的酵母细胞分解含复杂碳的物质的能力。在一实施方案中，1毫升制备后的酵母培养物接种于30毫升根据表IV的培养基中。培养物在20-28℃下温育24-56小时。然后培养物中简单碳水化合物的含量可由本领域已知的任一种方法测定，包括但非限于色谱以及分子荧光光谱测定法。优选地，培养物中简单碳水化合物的含量为每克酵母干重至少提高10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母汉逊菌株AS2.406培养物中简单碳水化合物的含量可达27200毫克/克。
5.5.生产生长因子的酵母细胞成分本发明的生长因子生产(GP-生产)的酵母可产生维生素及其它营养素，例如但非限于维生素B-1、核黄素(维生素B-2)、维生素B-12、烟酸(B-3)、吡哆醇(B-6)、泛酸(B-5)、叶酸、生物素、对氨基苯甲酸、胆碱、肌醇，其产量可支持其它酵母菌株的生长。这些生长因子可由酵母在发酵过程中产生。
本发明中，酵母过量生产生长因子的能力被活化或提升，结果所得GP-生产的酵母细胞可用作本发明的生物肥组合物的成分。
根据本发明，能生产GP的酵母细胞可通过在适当培养基中有电磁场存在下培养细胞来制备。用于活化或提升酵母GP-生产的电磁场频率通常为1300MHz至1500MHz的范围。细胞经培养一段足够长的时间后，采用本领域众所周知的方法可对细胞生产生长因子的能力进行测试。
本发明的GP-生产的酵母细胞的制法可于液体培养基进行。培养基含有可由酵母细胞同化的营养源。通常碳水化合物例如糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等及淀粉可单独或组合用作培养基的可同化碳源。培养基中所用碳源的确切数量部分依赖于培养基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培养基重量的约0.1％至5％及优选约0.5％至2％及最优选约0.8％。这些碳源可个别使用或若干碳源可组合用于培养基中。
可掺入培养基中的无机盐为能生成钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的寻常盐类。营养素无机盐的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸钙、硫酸镁、氯化钠及硫酸钙。
表VGP-生产的酵母的培养基组成
须注意表V提供的培养基组成并非限制性的。本领域那些专业人员鉴于实用及经济考虑例如培养规模以及培养基成分的当地供应量可对培养基作出多种修饰。
培养过程始于对每100毫升培养基接种1毫升选定酵母菌株的接种物，其细胞密度102-105细胞/毫升，优选3×102-104细胞/毫升。过程可视需求放大或缩小规模。酵母培养物在电磁场存在下生长约12-24小时，优选约24小时。电磁场可由本领域已知的任一种手段施用，频率为1382-1392MHz的范围，优选约1387MHz，更优选1387.517至1387.595MHz及最优选1387.556MHz。电磁场振幅在1000-2000mV的范围，优选约1620mV。第一期培养后，酵母细胞进一步在基本相同条件下再培育约24小时，但振幅提升至4000-5000mV的较高水平，优选至约4830mV。培养过程的举例设置描述在
图1中。本发明方法在约25℃至30℃下进行；但优选在28℃下操作此过程。培育过程优选在溶氧浓度为0.025至0.8mol/立方米，优选0.4mol/立方米的条件下进行。溶氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。
培养过程结束时，GP-生产的酵母细胞可由本领域已知的多种方法从培养物中回收，并储存在低于约0-4℃。GP-生产的酵母细胞也可干燥且以粉末形式储存。
本领域已知的任一种方法皆可用于测试培养后的酵母细胞过量生产生长因子的能力。在一实施方案中，1毫升制备后的酵母培养物接种于30毫升根据表V的培养基中。培养物在20-28℃下温育32-48小时。然后培养物中的生长因子含量以维生素B1、B2、B6及B12总量表示，可由本领域已知的任一种方法测定，包括但非限于高效液相色谱(HPLC)。培养物中的生长因子含量为每克酵母干重提高至少10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母汉逊AS2.382培养物中维生素B1、B2、B6及B12的含量可达6120毫克聚集物/克。
5.6. ATP-生产的酵母细胞成分本发明的ATP-生产的酵母能过量生产ATP，其量可支持生物肥组合物中其他酵母菌株的生长。
本发明中，酵母过量生产ATP的能力被活化或提升，结果所得ATP-生产的酵母细胞可用作本发明的生物肥组合物的成分。
根据本发明，能提升ATP-生产的酵母细胞可通过在适当培养基中有电磁场存在下培养细胞来制备。用于酵母活化或提升ATP-生产的电磁场频率通常为1600MHz至1800MHz的范围。细胞经生长一段足够长的时间后，采用本领域众所周知的方法可对细胞生产ATP的能力提升进行测试。
本发明ATP-生产的酵母细胞的制法可于液体培养基进行。培养基含有可由酵母细胞同化的营养源。通常碳水化合物例如糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等及淀粉可单独或组合用作培养基的可同化碳源。培养基中所用碳源的确切数量部分依赖于培养基的其它成分，但碳水化合物含量通常占培养基重量的约0.1％至5％及优选约0.5％至2％及最优选约0.8％。这些碳源可个别使用或若干碳源可组合用于培养基中。
可掺入培养基中的无机盐为能生成钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的寻常盐类。营养素无机盐的非限制性例子有(NH4)2HPO4、碳酸钙、硫酸镁、氯化钠及硫酸钙。
表VIATP-生产的酵母的培养基组成
须注意表VI提供的培养基组成并非限制性的。本领域那些专业人员鉴于实用及经济考虑例如培养规模以及培养基成分的当地供应量可对培养基作出多种修饰。
培养过程始于对每100毫升培养基接种1毫升选定酵母菌株的接种物，其细胞密度102-105细胞/毫升，优选3×102-104细胞/毫升。过程可视需求放大或缩小规模。酵母培养物在电磁场存在下生长约12-24小时，优选约24小时。电磁场可由本领域已知的任一种手段施用，频率为1690-1700MHz的范围，优选约1694MHz，更优选1694.328至1694.402MHz及最优选1694.365MHz。电磁场振幅在1000-2000mV的范围，优选约1470mV。第一期培养后，酵母细胞进一步在基本相同条件下再培育约24小时，但振幅提升至4000-5000mV的较高水平，优选至约4780mV。培养过程的举例设置描述在
图1中。本发明方法在约25℃至30℃下进行；但优选在28℃下操作此过程。培育过程优选在溶氧浓度为0.025至0.8mol/立方米，优选0.4mol/立方米的条件下进行。溶氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。
培养过程结束时，ATP-生产的酵母细胞可由本领域已知的多种方法从培养物中回收，并储存在低于约0-4℃。ATP-生产的酵母细胞也可干燥且以粉末形式储存。
本领域已知的任一种方法皆可用于测试培养后的酵母细胞过量生产ATP的能力。在一实施方案中，1毫升制备后的酵母培养物接种于30毫升根据表VI的培养基中。培养物在20-28℃下温育36-56小时。然后培养物中ATP的含量可由本领域已知的任一种方法测定，包括但非限于HPLC。ATP的产量为每克酵母干重至少提高约10毫克。例如活化后，啤酒糖酵母汉逊菌株AS2.16培养物中ATP的产量可达约3320毫克/克。
5.7.仿共生关系的形成在本发明的另一实施方案中，如5.1-5.4节所述具有最新活化或提升固氮、分解含磷无机物或化合物、分解不溶性含钾无机物或化合物以及分解复杂碳材料的能力的酵母菌株被合并培养，以便它们形成仿共生关系，由此它们可共同生长而基本上无须仰赖外来供应生物可利用的氮、磷、钾及碳营养素。生长需要的营养素系由肥料组合物中的各自营养素-生产的酵母菌株通过将来自各种来源的生物不可利用的营养素转成可利用的营养素来提供。各种酵母菌株产生各型营养素的活性部分与其它酵母细胞的需求以及植物有关。结果当需要时，可溶性生物可利用的营养素可被转化，因此避免由于例如渗滤而过量损失。
可用以改良生物肥性能的任选方法说明如下。四株根据5.1-5.4节制备的酵母经混合后在适当液体培养基中有电磁场存在下培养。培养基含有生物不可利用形式的氮、磷、钾及碳营养素。作为非限制性实例子，大气氮气用作氮营养源，磷酸盐岩石粉用作磷营养源，钾云母粉用作钾营养源以及粉状纤维素用作复杂的碳营养源。其它形式的不溶性含磷及钾的物质及复杂的碳化合物也可用以替代或组合前述任一种无机物质作为磷、钾及碳营养源。可掺入培养基的无机盐为能生成钠、钙、硫酸根、碳酸根等离子的寻常盐类。营养素无机盐的非限制性例子有碳酸钙、硫酸镁、氯化钠及硫酸钙。
表VII形成仿共生关系的培养基组成
须注意表VII提供的培养基组成并非限制性的。本领域那些专业人员鉴于实际及经济考虑例如培养规模以及培养基成分的当地供应情况可对培养基作出多种修饰。
培育过程可优选在溶氧浓度为0.025至0.8mol/立方米，优选0.4mol/立方米的条件下进行。溶氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。本发明方法在约25℃至30℃下进行；但优选在28℃下操作此方法。该方法始于在无菌培养基中通常接种各约20毫升四种酵母细胞菌株的接种物，各个细胞密度约108细胞/毫升。任选方法可视需要放大或缩小规模。
酵母培养物在四种独立的电磁场中生长12-72小时，优选生长约48小时。电磁场可由多种手段施用，各具有下列频率(1)860至870MHz的范围，优选约865MHz，更优选865.522至865.622MHz的范围及最优选865.572MHz用于固氮；(2)360至370MHz的范围，优选约366MHz，更优选366.199至366.287MHz的范围及最优选366.243MHz用于分解磷；(3)250至260MHz的范围，优选约255MHz，更优选255.388至255.462MHz的范围，及最优选255.425MHz用于分解钾；(4)1087-1097MHz的范围，优选约1092MHz，更优选1092.346至1092.428MHz的范围及最优选1092.387MHz用于分解复杂的碳。各磁场在0-3000mV，优选20-1800mV之间以1mV的台阶及每一完整周期18-23分钟的速率重复循环。培养过程的举例设置示于图2中。
5.8.土壤调适本发明的酵母菌株也必须能够在各型土壤中生长及发挥其各自功能。酵母菌株存活及生长能力可通过使本发明的酵母菌株调整适应特定土壤条件而得到提升。
在本发明的另一实施方案中，根据5.1-5.6节任一节制备的酵母细胞可单独或混合在含有得自一种或多种土壤来源的土壤的固体或半固体培养基中培养。此种任选方法可用于改良生物肥性能，以下列实例方式描述。
将含10毫升酵母、密度为106细胞/毫升的悬浮液与1000立方厘米的土壤培养基混合。方法规模可视需要放大或缩小。酵母与土壤的混合物于电磁场存在下培养约48-96小时，优选约48小时。电磁场可由多种手段施用，依赖于酵母菌株，电磁场具有对应于第5.1-5.6节所述频率的一种频率。可使用100-3000mV，优选2100mV的场振幅。培养物在约3℃至约48℃间循环的温度下温育。例如在典型的周期中，培养温度可始于35-48℃，保持此温约1-2小时，然后调整至42-45℃且于此温维持1-2小时，接着调整至26-30℃且于此温维持约2-4小时，然后向下调整至5-10℃并于此温维持约1-2小时及温度可再升高至35-45℃用于另一周期。周期重复直至此过程完成。最后温度周期完成后，培养温度降至3-4℃且于此温维持约5-6小时。调整适应后，酵母细胞由常规方法例如过滤从培养基中分离及回收。调适后的酵母细胞可储存于4℃以下。培养过程的举例设置示于图3中。
5.9.酵母细胞的分离或富集根据第5.7节已经调适而形成仿共生关系的酵母细胞可以各酵母细胞菌株保有其获得或提升的功能的方式而分离或丰富。酵母细胞的分离根据在此以其全文引作参考的美国专利第5,578,486号及中国专利公报CN 1110317A所述方法进行。用于活化酵母细胞的频率可在分离过程中使用。然后分离后的酵母细胞经干燥储存。
5.10.生物肥的制造除了酵母细胞成分外，多种有机及无机原料也可包括于本发明的生物肥组合物中。这些材料的制备以及制造生物肥牵涉的步骤系在此描述。
5.10.1.有机及无机基质成分的制备大范围的有机及无机材料可用于本发明的生物肥组合物中。有机材料例如但非限于煤矿废料以及风化煤或任何含有20％以上的有机物质的材料可用作碳源以支持植物及酵母的生长。也可使用这些有机材料的组合及混合物。存在于这些材料的有机化合物由酵母分解，该酵母可将复杂或高分子量碳链分子分解成为简单碳化合物，因而可被植物以及肥料中的其它酵母细胞利用。
无机材料例如但非限于磷酸盐岩石及钾云母，分别作为磷源及钾源包括在内。也可使用其它含磷或含钾材料及无机物。这些无机化合物由K-分解及P-分解的酵母细胞分解成生物可利用的钾及生物可利用的磷，它们可被生长中的植物以及肥料中的酵母细胞利用。任何有机或无机材料可单独或合并使用或用以替代本发明的任何其它材料。或者，如果特定用途视为需要，则一种或多种有机或无机成分可被删除或由另一种取代。例如若土壤含有足够钾无机物则可删除钾云母。
本发明所用的有机及无机材料不应含有其含量可抑制酵母细胞或植物生长的毒性物质或微生物。
本发明的有机及无机成分在掺入肥料前可研磨成适当的形式及大小。通常有机或无机材料可输送至破碎机，于该处被分解成为直径≤5厘米的碎片。任何常规破碎机或相等同的机器皆可用于此目的。然后小片由任何输送装置转移至研磨机并被研磨至筛目≥150的粉末。任何允许细研的研磨机皆可用于此目的。然后粉末输送至适当的储存槽中储存直至与肥料的其它成分使用为止。研磨过程示意图显示于图4及5中。
5.10.2.使用产生生长因子的酵母的发酵过程本发明中，GP-生产的酵母的制备在发酵过程中使用第5.5节所述活化酵母菌株作为种子来进行。发酵过程示意显示于图6中。
根据每千克淀粉2.5升水的比例制备发酵培养基。使用干净水、优选不含任何微生物的水以制备发酵培养基。发酵在20-30℃，优选25-28℃下于干净环境及没有强磁场源例如电源线及电源产生器的空间中进行。任何接触发酵醪的设备包括反应器、管路及搅拌器每次使用前必须彻底清洁。依据发酵温度，发酵过程通常持续约60-72小时。至少有90％发酵基质被发酵。发酵优选在半有氧或氧水平为最高可溶性氧浓度的约20-60％的条件下进行。氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。发酵后，细胞数应达约2×1010细胞/毫升。发酵醪维持于15-28℃下且须在24小时以内使用。或者，GP-生产的酵母可经排水、干燥及以粉末形式储存。
5.10.3.使用ATP-生产的酵母的发酵过程本发明中，ATP-生产的酵母的制备在发酵过程中使用第5.6节所述调适的酵母菌株作为种子进行。发酵过程示意图显示于图6中。
根据每千克淀粉2.5升水的比例制备发酵培养基。使用干净水、优选不含任何微生物的水，最优选高压灭菌水以制备发酵培养基。发酵系在20-30℃，优选25-28℃下于干净环境及没有强磁场源例如电源线及电源产生器的空间中进行。任何接触发酵醪的设备包括反应器、管路及搅拌器每次使用前必须彻底清洁。依据发酵温度，发酵过程通常持续约60-72小时。至少有90％发酵基质被发酵。发酵优选在半有氧或氧水平为最高可溶性氧浓度的约20-60％的条件下进行。氧水平可由本领域专业人员已知的任一种常规手段控制，包括但非限于搅拌和/或通气。发酵后，细胞数应达约2×1010细胞/毫升。发酵醪维持于15-28℃且须在24小时以内使用。或者，ATP-生产的酵母可经排水、干燥及以粉末形式储存。
5.10.4.原料混合物的制备有机及无机原料以表VIII所示举例的比例混合。将适量的根据第5.10.1节制备的有机及无机材料以及淀粉输送至混合机中。可使用常规的混合机例如但非限于转鼓混合机。混合槽恒定旋转以便均匀混合无机材料、有机材料及淀粉的粉末。然后混合物输送至储存槽。有机及无机基质材料的混合程序示于图7中。
表VIII原料比例
5.10.5.酵母混合物的制备酵母混合物以表IX所示的举例比例制备。将适量的根据第5.1-5.6节制备的六种干粉形式的酵母菌株输送至混合槽。酵母混合约10-20分钟。然后把混合物送至储存槽。任何用于混合酵母的设备包括混合槽及储存槽每次用前必须经彻底清洁，优选灭菌。酵母混合物低于20℃以下储存且须在24小时以内使用。酵母的混合程序示于图8中。或者，六种酵母混合物可经干燥后以粉末形式储存。
表IX微生物比例
5.10.6.生物肥的制造本发明生物肥的生产是以根据表X所示比例通过混合第5.10.5节的酵母混合物及第5.10.1节的有机及无机材料的混合物来进行的。例如酵母及有机及无机材料输送至造粒机以形成颗粒。然后肥料颗粒以两阶段式干燥处理干燥。第一干燥阶段，肥料在第一干燥机中不超过65℃的温度下干燥不超过10分钟时间，以便酵母细胞快速变成休眠状态。然后把肥料送至第二干燥机并于不超过75℃的温度下干燥不超过30分钟时间以进一步去除水。两阶段后，水含量应低于5％。优选的是温度及干燥时间为两干燥阶段所特有，从而酵母细胞不会丧失其活力及功能。接着肥料冷却至室温。肥料也可在分离器中筛选选择优选尺寸的肥料颗粒。任何分离器例如但非限于可调整速度及筛目大小的涡轮分离器皆可使用。最后将选定大小的肥料送至散装袋填装机包装。
生产过程示于图9-11中。图9为从其成分生产肥料程序的示意图。
图10为干燥过程的示意图。
图11为冷却及包过程的示意图。
表X生物肥的组成(每一公吨肥料)
6.实施例下列实施例表明本发明的生物肥组合物的制造。本实施例为本发明的优选实施方案。
保藏编号为AS2.501、AS2.535、AS2.441、AS2.406、AS2.382及AS2.16的啤酒糖酵母汉逊菌株，各保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，用以制备生物肥的酵母细胞成分。酵母菌株AS2.501根据第5.1节所述方法培养用于固氮。酵母菌株AS2.535根据第5.2节所述方法培养用于磷分解。酵母菌株AS2.441根据第5.3节所述方法培养用于K-分解。酵母菌株AS2.406根据第5.4节所述方法培养用于C-分解。酵母菌株AS2.382根据第5.5节所述方法培养用于生长因子生产。酵母菌株AS2.16根据第5.6节所述方法培养用于ATP生产。
煤矿废料及磷酸盐岩石分别用作有机及无机材料。本实施例所用的煤矿废料含有至少30％有机物质。本实施例所用的磷酸盐岩石含有至少25％的五氧化磷。煤矿废料及磷酸盐岩石根据第5.10.1节制备。
生长因子-生产的酵母的生产在发酵过程中使用第5.5节所述活化酵母菌株AS2.382作为种子进行。发酵过程示意图示于图6中。发酵培养基按照每千克淀粉2.5升干净水的比例制备。发酵培养基根据每升培养基10毫升种子溶液的比例接种。在温度28±1℃及氧浓度0.4mol/立方米时于干净环境中进行发酵约48小时，所述干净环境其中没有任何电磁场源。发酵后，细胞数达约2×1010细胞/毫升。
ATP-生产的酵母的生产在发酵过程中使用第5.6节所述活化酵母菌株AS2.16作为种子进行。发酵过程示意图示于图6中。发酵培养基按照每千克淀粉2.5升干净水的比例制备。发酵培养基根据每升培养基10毫升种子溶液的比例接种。在温度28±1℃及氧浓度0.4mol/立方米时于干净环境中进行发酵约56小时，所述干净环境其中没有任何电磁场源。发酵后，细胞数达约2×1010细胞/毫升。
原料混合物系根据表XI及第5.10.4节的程序制备。
表XI原料比例
酵母混合物系根据表XII及第5.10.5节所述程序制备。
表XII酵母比例(每一公吨肥料)
生物肥的生产是以根据表XIII的比例混合酵母混合物、有机及无机材料来进行的。混合后的酵母及有机及无机材料送至造粒机以制成颗粒。然后肥料颗粒经两阶段式干燥处理干燥。第一干燥阶段，肥料在第一干燥机中不超过60±2℃的温度下干燥5分钟以便酵母细胞迅速变成休眠状态。然后肥料送至第二干燥机并于不超过65±2℃的温度下干燥8分钟而进一步去除水。然后肥料冷却至室温。最后送至散装袋填装机包装。
表XIII肥料组成(每一公吨肥料)
本发明的范围非受限于所述的特定实施方案，其仅供单一举例说明本发明的个别方面，并且功能上相等同的方法及成分皆属于本发明的范围。确实除本文显示及叙述的以外，本发明的多种修饰对本领域专业技术人员来说由前文描述及附图将显然自明。这些修饰一定落入随附的权利要求的范围内。
权利要求
1.一种生物肥组合物，其包含至少一种下列酵母细胞成分(a)第一酵母细胞成分，其包含第一多数个可固氮的酵母细胞；(b)第二酵母细胞成分，其包含第二多数个可分解磷化合物的酵母细胞；或(c)第三酵母细胞成分，其包含第三多数个可分解钾化合物的酵母细胞。
2.如权利要求1所述的生物肥组合物，其进一步包含(d)第四酵母细胞成分，其包含第四多数个可将复杂的碳化合物转成简单碳水化合物的酵母细胞；(e)第五酵母细胞成分，其包含第五多数个可过量产生生长因子的酵母细胞；以及(f)第六酵母细胞成分，其包含第六多数个可过量产生腺苷三磷酸的酵母细胞。
3.一种生物肥组合物，其包含至少一种下列酵母细胞成分(a)第一酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率860至870MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第一电磁场中将第一多数个酵母细胞培养足够致使所述第一多数个酵母细胞固氮的时间；(b)第二酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率360至370MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第二电磁场中将第二多数个酵母细胞培养足够致使所述第二多数个酵母细胞分解磷化合物的时间；或(c)第三酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率250至260MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第三电磁场中将第三多数个酵母细胞培养足够致使所述第三多数个酵母细胞分解钾化合物的时间。
4.如权利要求3所述的生物肥组合物，其进一步包含(d)第四酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率1087至1097MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第四电磁场中将第四多数个酵母细胞培养足够致使所述第四多数个酵母细胞将复杂的碳分子转成简单碳水化合物的时间；(e)第五酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率1382至1392MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第五电磁场中将第五多数个酵母细胞培养足够致使所述第五多数个酵母细胞过量产生生长因子的时间；以及(f)第六酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率1690至1700MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第六电磁场中将第六多数个酵母细胞培养足够致使所述第六多数个酵母细胞过量产生腺苷三磷酸的时间。
5.如权利要求2或4所述的生物肥组合物，其进一步包含有机基质成分、无机基质成分或有机及无机基质成分二者。
6.如权利要求2或4所述的生物肥组合物，其中各酵母细胞成分分别包含属于选自下列属的酵母细胞糖酵母(Saccharomyces)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，掷孢酵母(Sporobolomyces)，球拟酵母(Torulopsis)，丝孢酵母(Trichosporon)，威克酵母(Wickerhamia)，阿舒氏囊霉菌(Ashbya)，芽生菌(Blastomyces)，假丝酵母(Candida)，固囊酵母(Citeromyces)，克利伯菌(Crebrothecium)，隐球酵母(Cryptococcus)，德巴利氏酵母(Debaryomyces)，拟内孢霉(Endomycopsis)；地霉(Geotrichum)，汉逊氏酵母(Hansenula)，克勒克氏酵母(Kloeckera)，油脂酵母(Lipomyces)，毕赤氏酵母(Pichia)，红螺菌(Rhodosporidium)，以及红酵母(Rhodotorula)。
7.如权利要求2或4所述的生物肥组合物，其中各酵母细胞成分包含选自于下列酵母物种的细胞啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，薛氏糖酵母(Saccharomyces chevalieri)，戴耳克氏糖酵母(Saccharomyces delbrueckii)，微小糖酵母(Saccharomyces exiguus)，发酵性糖酵母(Saccharomyces fermentati)，罗哥糖酵母(Saccharomyceslogos)，蜂蜜糖酵母(Saccharomyces mellis)，小椭圆糖酵母(Saccharomyces microellipsoides)，卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)，罗茜糖酵母(Saccharomyces rosei)，鲁氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)，清酒糖酵母(Saccharomyces sake)，葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum Beijer)，魏莱氏糖酵母(Saccharomyceswillianus)，酵母种，路为氏糖酵母(Saccharomyces ludwigii)，中华糖酵母(Saccharomyces sinenses)，拜烈氏糖酵母(Saccharomyces bailii)，卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)，赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)，白色球拟酵母(Torulopsis candida)，无名球拟酵母(Torulopsis famta)，球状球拟酵母(Torulopsis globosa)，平常球拟酵母(Torulopsis inconspicua)，贝雷氏丝孢酵母(Trichosporonbehrendoo)，头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum)，皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)，萤光威克酵母(Wickerhamia fluoresens)，棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)，皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)，白色假丝酵母(Candida albicans)，树木假丝酵母(Candidaarborea)，季也蒙氏假丝酵母(Candida guillermondii)，克鲁斯氏假丝酵母(Candida Krusei)，莱比可假丝酵母(Candida lambica)，解脂假丝酵母(Candida lipolytica)，副克柔氏假丝酵母(Candida parakrusei)，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)，假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)，铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)，粗壮假丝酵母(Candida robusta)，皱摺假丝酵母(Candida rugousa)，产朊假丝酵母(Candida utilis)，基质固囊酵母(Citeromyces matritensis)，阿舒克利伯菌(Crebrothecium ashbyii)，罗伦氏隐球酵母(Cryptococcus laurentii)，新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)，汉逊氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)，克洛氏德巴利氏酵母(Debaryomyces kloeckeri)，肋状拟内孢霉菌(Endomycopsisfibuligera)，阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)，白地霉(Geotrichumcandidum)，罗威氏地霉(Geotrichum ludwigii)，健强地霉(Geotrichumrobustum)，甜香地霉(Geotrichum suaveolens)，异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)，产阿拉伯糖醇汉逊氏酵母(Hansenulaarabitolgens)，杰丁汉逊氏酵母(Hansenula jadinii)，土星汉逊氏酵母(Hansenula saturnus)，施氏汉逊氏酵母(Hansenula schneggii)，亚菌膜汉逊氏酵母(Hansenula subpelliculosa)，柠檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粉状毕赤氏酵母(Pichiafarinosa)，膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)，橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)，胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，微小红酵母(Rhodotorula minuta)，深红酵母(Rhodotorula rubar)及中华红酵母(Rhodotorula sinensis)。
8.如权利要求2或4所述的生物肥组合物，其中各酵母细胞成分包含啤酒糖酵母细胞。
9.如权利要求2或4所述的生物肥组合物，其中各酵母细胞成分的酵母细胞分别是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏号选自AS2.501，AS2.535，AS2.441，AS2.406，AS2.382及AS2.16的酵母菌株啤酒糖酵母汉逊的细胞。
10.如权利要求2所述的生物肥组合物，其包含如权利要求1所述的酵母细胞成分(a)，(b)及(c)。
11.如权利要求4所述的生物肥组合物，其包含如权利要求3所述的酵母细胞成分(a)，(b)及(c)。
12.如权利要求10或11所述的生物肥组合物，其进一步包含有机基质成分，无机基质成分或有机和无机基质成分二者。
13.如权利要求12所述的生物肥组合物，其包含按重量计约0.1至0.2％酵母细胞成分(a)，约0.1至0.2％酵母细胞成分(b)，约0.1至0.2％酵母细胞成分(c)，约0.1至0.2％酵母细胞成分(d)，约1％酵母细胞成分(e)，约3％酵母细胞成分(f)；约65％有机基质成分；约19％无机基质成分；以及约14％淀粉。
14.一种组合物，其包含多数个酵母细胞，其中所述多数个酵母细胞已经在具有频率850至860MHz的范围及振幅1000至5000mV的范围的电磁场存在下培养一段足够致使所述多数个酵母细胞固定氮的时间。
15.一种组合物，其包含多数个酵母细胞，其中所述多数个酵母细胞已经在具有频率360至370MHz的范围及振幅1000至5000mV的范围的电磁场存在下培养一段足够致使所述多数个酵母细胞分解磷化合物的时间。
16.一种组合物，其包含多数个酵母细胞，其中所述多数个酵母细胞已经在具有频率250至260MHz的范围及振幅1000至5000mV的范围的电磁场存在下培养一段足够致使所述多数个酵母细胞分解钾化合物的时间。
17.一种组合物，其包含多数个酵母细胞，其中所述多数个酵母细胞已经在具有频率1087至1097MHz的范围及振幅1000至5000mV的范围的电磁场存在下培养一段足够致使所述多数个酵母细胞将复杂的碳分子转成简单碳水化合物的时间。
18.一种组合物，其包含多数个酵母细胞，其中所述多数个酵母细胞已经在具有频率1382至1392MHz的范围及振幅1000至2000mV的范围的电磁场存在下培养一段足够致使所述多数个酵母细胞过量产生生长因子的时间。
19.一种组合物，其包含多数个酵母细胞，其中所述多数个酵母细胞已经在具有频率1690至1700MHz的范围及振幅1000至5000mV的范围电磁场存在下培养一段足够致使所述多数个酵母细胞过量产生腺苷三磷酸的时间。
20.如权利要求14、15、16、17、18或19所述的组合物，其中所述酵母细胞为啤酒糖酵母的细胞。
21.一种生物肥组合物，其包含(i)至少一种下列酵母细胞成分(a)第一酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率约865.522MHz范围及振幅约1250mV的第一电磁场中将第一多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以及在具有频率约865.522MHz及振幅约4656mV的第二电磁场存在下将所述第一多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以便所述第一多数个酵母细胞可固定氮；(b)第二酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率约366.243MHz范围及振幅约1230mV的第一电磁场中将第二多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以及在具有频率约366.243MHz及振幅约4570mV的第二电磁场存在下将所述第二多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以便所述第二多数个酵母细胞可分解磷化合物；或(c)第三酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率约255.425MHz范围及振幅约1340mV的第一电磁场中将第三多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以及在具有频率约255.425MHz及振幅约4850mV的第二电磁场存在下将所述第三多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以便所述多数个酵母细胞可分解钾化合物；(ii)第四酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率约1092.387MHz范围及振幅约1530mV的第一电磁场中将第四多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以及在具有频率约1092.387MHz及振幅约4720mV的第二电磁场存在下将所述第四多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以便所述第四多数个酵母细胞可将复杂的碳分子转成简单碳水化合物；(iii)第五酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率约1387.556MHz范围及振幅约1620mV的第一电磁场中将第五多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以及在具有频率约1387.556MHz及振幅约4830mV的第二电磁场存在下将所述第五多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以便所述第五多数个酵母细胞可过量产生生长因子；以及(iv)第六酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率约1694.365MHz范围及振幅约1470mV的第一电磁场中将第六多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以及在具有频率约1694.365MHz及振幅约4780mV的第二电磁场存在下将所述第六多数个酵母细胞培养一段24小时时间，以便所述多数个酵母细胞可过量产生腺苷三磷酸；其中所述酵母细胞成分包含啤酒糖酵母的细胞。
22.如权利要求21所述的生物肥组合物，其中第一酵母细胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母汉逊AS2.501的细胞，第二酵母细胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母汉逊AS2.535的细胞，第三酵母细胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母汉逊AS2.441的细胞，第四酵母细胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母汉逊AS2.406的细胞，第五酵母细胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母汉逊AS2.382的细胞以及第六酵母细胞成分包含酵母菌株啤酒糖酵母汉逊AS2.16的细胞。
23.如权利要求21所述的生物肥组合物，其中多数个酵母细胞被干燥。
24.一种活化或提升多数个酵母细胞固定大气氮气能力的方法，其包含在具有频率850至860MHz范围以及振幅1000至5000mV范围的电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养一段足够致使所述多数个酵母细胞固定氮的时间。
25.如权利要求24所述的方法，其包含在具有频率约865.522MHz及振幅约1250mV的第一电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养24小时时间，以及在具有频率约865.522MHz及振幅约4656mV的第二电磁场存在下将所述第一多数个酵母细胞培养24小时时间，以便所述多数个酵母细胞可固定氮。
26.一种活化或提升多数个酵母细胞分解含磷无机物或化合物能力的方法，其包含在具有频率360至370MHz范围以及振幅1000至5000mV范围的电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养一段足够致使所述多数个酵母细胞分解磷化合物的时间。
27.如权利要求26所述的方法，其包含在具有频率约366.243MHz及振幅约1230mV的第一电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养24小时时间，以及在具有频率约366.243MHz及振幅约4570mV的第二电磁场存在下将所述第二多数个酵母细胞培养24小时时间，以便所述第二多数个酵母细胞可分解磷化合物。
28.一种活化或提升多数个酵母细胞分解含钾无机物或化合物能力的方法，其包含在具有频率250至260MHz范围以及振幅1000至5000mV范围的电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养一段足够致使所述多数个酵母细胞分解钾化合物的时间。
29.如权利要求28所述的方法，其包含在具有频率约255.425MHz及振幅约1340mV的第一电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养24小时时间，以及在具有频率约255.425MHz及振幅约4850mV的第二电磁场存在下将所述第三多数个酵母细胞培养24小时时间，以便所述多数个酵母细胞可分解钾化合物。
30.一种活化或提升多数个酵母细胞分解高分子量碳物质能力的方法，其包含在具有频率1087至1097MHz范围以及振幅1000至5000mV范围的电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养一段足够致使所述多数个酵母细胞转化复杂的碳分子成为简单碳水化合物的时间。
31.如权利要求30所述的方法，其包含在具有频率约1092.387MHz及振幅约1530mV的第一电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养24小时时间，以及在具有频率约1092.387MHz及振幅约4720mV的第二电磁场存在下将所述第四多数个酵母细胞培养24小时时间，以便所述第四多数个酵母细胞转化复杂的碳分子成为简单碳水化合物。
32.一种活化或提升多数个酵母细胞过量产生生长因子能力的方法，其包含在具有频率1382至1392MHz范围以及振幅1000至2000mV或1000至5000mV范围的电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养一段足够致使所述多数个酵母细胞过量产生生长因子的时间。
33.如权利要求32所述的方法，其包含在具有频率约1387.556MHz及振幅约1620mV的第一电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养24小时时间，以及在具有频率约1387.556MHz及振幅约4830mV的第二电磁场存在下将所述第五多数个酵母细胞培养24小时时间，以便所述第五多数个酵母细胞过量产生生长因子。
34.如权利要求32或33所述的方法，其进一步包含以所述酵母细胞接种包含浓度约400克/升的淀粉溶液的发酵培养基以及让发酵于20至30℃下进行直到至少90％发酵基质已经发酵为止。
35.一种活化或提升多数个酵母细胞过量产生ATP能力的方法，其包含在具有频率1690至1700MHz范围以及振幅1000至5000mV范围的电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养一段足够致使所述多数个酵母细胞过量产生腺苷三磷酸的时间。
36.如权利要求35所述的方法，其包含在具有频率约1694.365MHz及振幅约1470mV的第一电磁场存在下将所述多数个酵母细胞培养24小时时间，以及在具有频率约1694.365MHz及振幅约4780mV的第二电磁场存在下将所述第六多数个酵母细胞培养24小时时间，以便所述多数个酵母细胞过量产生腺苷三磷酸。
37.如权利要求35或36所述的方法，其进一步包含以所述酵母细胞接种包含浓度约400克/升的淀粉溶液的发酵培养基以及让发酵于20至30℃下进行直到至少90％发酵基质已经发酵为止。
38.一种在生物肥的酵母细胞成分中形成仿共生关系的方法，所述方法包含下列步骤制备混合物，其包含(a)第一酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率860至870MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第一电磁场中将第一多数个酵母细胞培养足够致使所述第一多数个酵母细胞固氮的时间；(b)第二酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率360至370MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第二电磁场中将第二多数个酵母培养足够致使所述第二多数个酵母细胞分解磷化合物的时间；(c)第三酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率250至260MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第三电磁场中将第三多数个酵母培养足够致使所述第三多数个酵母细胞分解钾化合物的时间；以及(d)第四酵母细胞成分，其制备系通过在具有频率1087至1097MHz范围及振幅1000至5000mV范围的第四电磁场中将第四多数个酵母细胞培养足够致使所述第四多数个酵母细胞将复杂的碳分子转成简单碳水化合物的时间；以及在具有多数个频率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz以及1087至1097MHz频率且各频率具有振幅0至3000mV范围的电磁场存在下将所述混合物培养一段足够致使所述酵母细胞成分形成仿共生关系的时间，其中所述磁场中各频率振幅系于0至3000mV间循环。
39.如权利要求24所述的方法，其进一步包含制备包含多数个酵母细胞及土壤的混合物；在具有频率于850至860MHz的范围以及振幅于1000至5000mV的范围的电磁场中将所述混合物培养一段足够致使所述多数个酵母细胞调整适应于土壤的时间。
40.如权利要求26所述的方法，其进一步包含制备包含所述多数个酵母细胞及土壤的混合物；在具有频率360至370MHz的范围以及振幅1000至5000mV的范围的电磁场中将所述混合物培养一段足够致使所述多数个酵母细胞调整适应于土壤的时间。
41.如权利要求28所述的方法，其进一步包含制备包含多数个酵母细胞及土壤的混合物；在具有频率250至260MHz的范围以及振幅1000至5000mV的范围的电磁场中将所述混合物培养一段足够致使所述多数个酵母细胞调整适应于土壤的时间。
42.如权利要求30所述的方法，其进一步包含制备包含多数个酵母细胞及土壤的混合物；在具有频率1087至1097MHz的范围以及振幅1000至5000mV的范围的电磁场中将所述混合物培养一段足够致使所述多数个酵母细胞调整适应于土壤的时间。
43.如权利要求32所述的方法，其进一步包含制备包含多数个酵母细胞及土壤的混合物；在具有频率1382至1392MHz的范围以及振幅1000至5000mV的范围的电磁场中将所述混合物培养一段足够致使所述多数个酵母细胞调整适应于土壤的时间。
44.如权利要求35所述的方法，其进一步包含制备包含多数个酵母细胞及土壤的混合物；在具有频率1690至1700MHz的范围以及振幅1000至5000mV的范围的电磁场中将所述混合物培养一段足够致使所述多数个酵母细胞调整适应于土壤的时间。
45.一种生产权利要求12所述的生物肥组合物的方法，该方法依顺序包含下列步骤(i)通过混合酵母细胞成分(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及(f)制备混合物；以及(ii)将所述有机基质成分及无机基质成分添加至所述混合物中而形成生物肥。
46.如权利要求45所述的方法，其进一步包含干燥所述生物肥。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述干燥步骤包含下列步骤(iii)在不超过65℃下干燥所述生物肥组合物一段时间以使酵母细胞变成休眠状态；(iv)在不超过70℃下干燥所述生物肥组合物一段时间以使水含量低于5％；(v)冷却所述生物肥组合物至环境温度；以及(vi)形成具有适当大小的所述生物肥组合物的颗粒。
48.如权利要求45所述的方法，其进一步包含在酵母细胞成分中形成仿共生关系的步骤，其包含在步骤(i)之后以及步骤(ii)之前，在具有多数个频率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz、1087至1097MHz频率、1382至1392MHz以及1690至1700MHz且各频率具有振幅0至3000mV范围的电磁场存在下将酵母细胞混合物培养一段足够致使所述酵母细胞成分形成仿共生关系的时间，其中所述磁场中各频率振幅系于0至3000mV间循环。
49.如权利要求45所述的方法，其进一步在步骤(i)之后以及步骤(ii)之前包含下列步骤(iii)添加土壤样本至步骤(i)的酵母细胞混合物中，(iv)在具有多数个频率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz以及1087至1097MHz频率且各频率具有振幅0至3000mV范围的电磁场存在下培养一段足够致使酵母细胞成分调整适应于土壤的时间，其中所述磁场中各频率振幅系于0至3000mV间循环；以及(v)自土壤分离酵母细胞。
50.如权利要求45所述的方法，其在步骤(i)之后以及步骤(ii)之前进一步包含下列步骤(iii)在具有多数个频率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz、1087至1097MHz频率、1382至1392MHz及1690至1700MHz且各频率具有振幅0至3000mV范围的电磁场存在下将步骤(i)的酵母细胞混合物培养一段足够致使所述酵母细胞成分形成仿共生关系的时间，其中所述磁场中各频率振幅系于0至3000mV间循环；(iv)将土壤样本添加至步骤(iii)的酵母细胞混合物，(v)在具有多数个频率860至870MHz、360至370MHz、250至260MHz、1087至1097MHz频率、1382至1392MHz及1690至1700MHz且各频率具有振幅0至3000mV范围的电磁场存在下将所述酵母细胞与土壤的混合物培养一段足够致使所述酵母细胞成分适应于土壤，其中所述磁场中各频率振幅系于0至3000mV间循环；以及(vi)自土壤分离酵母细胞。
51.一种促进植物生长的方法，其包含在权利要求1-13及21-23项中任一项所述的生物肥组合物存在下生长植物。
全文摘要
本发明提供包含酵母细胞的生物肥组合物，所述酵母细胞具有增强的固定大气中氮、分解无机磷及其化合物、分解无机钾及其化合物、分解复杂的碳化合物、过量生产生长因子以及过量生产ATP的能力。本发明的生物肥组合物可代替无机肥给农作物提供氮、磷和钾。本发明还包括生物肥组合物的生产方法以及应用方法。
文档编号C05F11/00GK1454191SQ0081987
公开日2003年11月5日 申请日期2000年9月5日 优先权日2000年9月5日
发明者张令玉 申请人:欧亚生物科技有限公司