专利名称：大豆未成熟子叶体细胞胚增殖、继代保存和植株再生方法
技术领域：
本发明涉及农作物组织培养方法技术领域，是一种大豆未成熟子叶体细胞胚增殖、继代保存和植株再生方法。
背景技术：
大豆是重要的经济作物，是人类食用油和植物蛋白的主要来源。在大豆生产中常常因为病草虫害的发生严重影响大豆的产量和品质。用常规的育种方法对大豆品种进行改良，因抗源匮泛而改良效果不佳。
随着分子生物学和分子遗传学的发展，利用转基因技术将外源基因转入植物中改良其某些不良性状已成为现代分子育种的重要方法之一。组织培养技术是转基因工作的基础，尽管以栽培大豆的未成熟胚和未成熟子叶为外植体经组织培养诱导体细胞胚胎发生与植株再生已获成功(Christianon，1983；Lazzeri，1985；Barwale，1986)，但大豆的组织培养不能象其它农作物，如小麦、水稻、玉米等形成胚性愈伤后，可多次继代增殖与保存，并诱导分化和再生植株，一直被认为是难以进行培养的作物，限制了大豆组织培养及转基因技术的应用。
Finer和Nagasawa(1988)报道了大豆体细胞胚胎发生后用悬浮培养进行增殖的系统，在液体培养基中球形体细胞胚的表面不断产生次一级的球形体细胞胚，形成由球形胚组成的胚性细胞团悬浮培养物。将胚性细胞团适当分割后转至新的液体培养基中，可继续增殖，形成新的胚性细胞团。体细胞胚再转入固体MS培养基上可进一步发育、成熟、萌发，形成完整植株。此系统大大改进了大豆的组织培养效率，但液体悬浮培养需要恒温摇床等设备，操作技术繁杂，难以掌握，仅在Fayette等个别栽培大豆品种中获得胚性细胞团，并仅有个别实验室使用了此系统(Bailey，1993)，尚未得到广泛应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是公开一种操作简单、适合于生产上主栽的大部分大豆品种的未成熟子叶体细胞胚增殖、继代保存和植株再生方法。
本发明解决技术问题的方案由以下步骤完成一、 大豆体细胞胚胎发生的诱导以MS培养基附加10-40mg/L 2，4-D(pH＝5.8-6.2)在25±1℃黑暗条件下诱导大豆未成熟子叶体细胞胚胎发生，培养30-60天可见体细胞胚胎发生。
二、 大豆体细胞胚的增殖与继代保存在产生的体细胞胚中挑选没有被周围的愈伤所吞食掉，直径在0.9-1.1毫米的黄绿色、小颗粒状的、成簇的球形胚，转接在MS培养基附加10-40mg/L 2，4-D(pH＝5.8-6.2)在25±1℃弱光16小时条件下诱导体细胞胚增殖，每隔12-16天换一次新鲜的培养基，继续挑选黄绿色、小颗粒状的、成簇的球形胚培养，去掉愈伤组织与大颗粒球形胚。体细胞胚增殖后可直接进行萌发，也可以继代保存，当需要继代保存时，将成簇的球形胚接于MS培养基附加10-40mg/L2，4-D(pH＝5.8-6.2)在20±1℃弱光16小时条件下培养，15-30天继代一次，可多次继代，直到需要使其再生植株时诱导球形胚萌发。
三、大豆体细胞胚的萌发与再生植株将体细胞胚转入到MS培养基中(加0.5-1％的活性炭、5-10％蔗糖、pH＝5.8-6.2)25±1℃光照16小时条件下培养，15-20天继代一次，30-60天体细胞胚萌发，萌发的体细胞胚再转入1/2MS或MS(2倍铁盐、pH＝7.0)培养基中在25±1℃光照23小时条件下培养，经25-35天再生植株。
本发明是以栽培大豆未成熟子叶为外植体诱导体细胞胚胎发生，在固体培养基上诱导体细胞胚增殖，同时，在固体培养基上继代保存，增殖与保存的体细胞胚可正常萌发，进一步再生植株，解决了大豆体细胞胚在固体培养基上增殖和长期继代保存之后诱导植株再生问题。运用本方法在生产上大面积种植的30个大豆品种中已诱导出16个品种产生了可增殖与长期继代保存的球形体细胞胚，占被诱导品种的53.33％。操作方法简单易掌握，省去了恒温摇床等设备，生产成本低。
具体实施例方式实施例1合丰25大豆品种体细胞胚胎发生、球形胚增殖、继代保存与植株再生大田种植合丰25，摘取开花16-20天大豆幼荚经75％乙醇消毒2分钟，0.1％HgCl2消毒15分钟，无菌水冲冼3次，剥开种皮，选取3-5mm子叶去掉胚轴，将子叶近轴面向上接种于MS培养基(附加20mg/L 2，4-D，pH＝6.0)中，在25℃黑暗条件下培养，42天时体细胞胚胎发生率(体细胞胚胎发生子叶数/接种子叶数×100％)为41.36％。
在体细胞胚中挑选没有被周围的愈伤所吞食掉，直径在0.9-1.1毫米的黄绿色、小颗粒状的、成簇的球形胚，转接在MS培养基(附加20mg/L 2，4-D)中在25℃弱光(200Lux)16小时条件下诱导体细胞胚增殖，15天换一次培养基，经60天诱导出增殖的球形胚，诱导百分率(可增殖的球形胚发生的子叶数/体细胞胚胎发生子叶数×100％)为18.40％。
可增殖的球形胚在MS培养基(附加20mg/L 2，4-D，pH＝6.0)中在20℃弱光(200Lux)16小时条件下继代保存，20天继代一次，已继代保存19个月。
诱导大豆体细胞胚再生植株时，将体细胞胚转入到MS基本培养基附加0.5％的活性炭(10％蔗糖、pH＝6.0)的萌发培养基中25℃光照(3200Lux)16小时条件下培养，每18天换一次新鲜的培养基，45天体细胞萌发，萌发率(萌发胚数/被诱导萌发的胚数×100％)为30％。体细胞胚萌发后转入MS(2倍铁盐、pH＝7.0)培养基中在25℃光照(3200Lux)23小时条件下培养，每15天换一次新鲜的培养基，30天植株再生，再生率(再生植株数/已诱导萌发的胚数×100％)为60％。
实施例2东农40大豆品种体细胞胚胎发生、球形胚增殖、继代保存与植株再生大田种植东农40，摘取开花16-20天大豆幼荚经75％乙醇消毒2分钟，0.1％HgCl2消毒12分钟，无菌水冲冼3次，剥开种皮，选取3-5mm子叶去掉胚轴，将子叶近轴面向上接种于MS培养基(附加40mg/L 2，4-D，pH＝6.0)中，在25℃黑暗条件下培养，50天时体细胞胚胎发生率(体细胞胚胎发生子叶数/接种子叶数×100％)为40.34％。
在体细胞胚中挑选没有被周围的愈伤所吞食掉，直径在0.9-1.1毫米的黄绿色、小颗粒状的、成簇的球形胚，转接在MS培养基(附加20mg/L 2，4-D)中在25℃弱光(200Lux)16小时条件下诱导体细胞胚增殖，15天换一次培养基，经50天诱导出增殖的球形胚，诱导百分率(可增殖的球形胚发生的子叶数/体细胞胚胎发生子叶数×100％)为16.50％。
可增殖的球形胚在MS培养基(附加20mg/L 2，4-D，pH＝6.0)中在20℃弱光(200Lux)16小时条件下继代保存，20天继代一次，已继代保存13个月。
诱导大豆体细胞胚再生植株时，将体细胞胚转入到MS基本培养基附加0.5％的活性炭(10％蔗糖、pH＝6.0)的萌发培养基中25℃光照(3200Lux)16小时条件下培养，每15天换一次新鲜的培养基，45天体细胞萌发，萌发率(萌发胚数/被诱导萌发的胚数×100％)为20％。体细胞胚萌发后转入MS(2倍铁盐、pH＝7.0)培养基中在25℃光照(3200Lux)23小时条件下培养，每15天换一次新鲜的培养基，30天植株再生，再生率(再生植株数/已诱导萌发的胚数×100％)为45％。
表1 部分大豆品种体细胞胚胎发生率与可增殖球形胚诱导率序号 大豆品种 体细胞胚胎发生率(％) 可增殖球形胚诱导率(％)1 黑农3525.51 10.22 黑农4057.14 15.03 合丰2541.36 18.44 合丰3955.87 15.65 东农4040.34 16.56 东农L13 42.71 22.17 东农163 0.290.08 东农434 3.150.09 东农1168 77.62 18.310 东农32310 32.47 6.511 东农40567 0.000.012 吉林262.500.013 吉林359.430.014 吉林3616.54 16.815 吉林3858.70 0.016 吉农9 23.27 0.017 开育1035.47 0.018 开育112.365.219 铁丰2918.00 0.020 内豆4号 32.72 0.0
权利要求
1.一种大豆未成熟子叶体细胞胚增殖、继代保存和植株再生方法，其特征在于包括以下步骤(1)、大豆体细胞胚胎发生的诱导以MS培养基附加10-40mg/L 2，4-D(pH＝5.8-6.2)在25±1℃黑暗条件下诱导大豆未成熟子叶体细胞胚胎发生，培养30-60天可见体细胞胚胎发生。(2)、大豆体细胞胚的增殖与继代保存在产生的体细胞胚中挑选没有被周围的愈伤所吞食掉，直径在0.9-1.1毫米的黄绿色、小颗粒状的、成簇的球形胚，转接在MS培养基附加10-40mg/L 2，4-D(pH＝5.8-6.2)在25±1℃弱光16小时条件下诱导体细胞胚增殖，每隔12-16天换一次新鲜的培养基，继续挑选黄绿色、小颗粒状的、成簇的球形胚培养，去掉愈伤组织与大颗粒球形胚。(3)、大豆体细胞胚的萌发与再生植株将体细胞胚转入到MS培养基中(加0.5-1％的活性炭、5-10％蔗糖、pH＝5.8-6.2)25±1℃光照16小时条件下培养，15-20天继代一次，30-60天体细胞胚萌发，萌发的体细胞胚再转入1/2MS或MS(2倍铁盐、pH＝7.0)培养基中在25±1℃光照23小时条件下培养，经25-35天再生植株。
2.根据权利要求1所述的大豆未成熟子叶体细胞胚增殖、继代保存和植株再生方法，其特征在于继代保存时，将成簇的球形胚接于MS培养基附加10-40mg/L 2，4-D(pH＝5.8-6.2)在20±1℃弱光16小时条件下培养，15-30天继代一次，可多次继代，直到需要使其再生植株时诱导球形胚萌发。
全文摘要
一种大豆未成熟子叶体细胞胚增殖、继代保存和植株再生方法，涉及农作物组织培养方法技术领域，由大豆体细胞胚胎发生的诱导，大豆体细胞胚的增殖与继代保存，大豆体细胞胚的萌发与再生植株步骤完成。本发明是以栽培大豆未成熟子叶为外植体诱导体细胞胚胎发生，在固体培养基上诱导体细胞胚增殖，同时，在固体培养基上继代保存，增殖与保存的体细胞胚可正常萌发，进一步再生植株，解决了大豆体细胞胚在固体培养基上增殖和长期继代保存之后诱导植株再生问题。
文档编号A01H4/00GK1415191SQ02144578
公开日2003年5月7日 申请日期2002年11月5日 优先权日2002年11月5日
发明者王罡, 王萍, 季静, 吴颖 申请人:中国人民解放军军需大学