泛醌缺乏的表型效应及其筛选方法

专利名称：泛醌缺乏的表型效应及其筛选方法
背景技术：
(a)发明领域本发明涉及泛醌缺乏的表型效应及其筛选方法。
(b)现有技术描述泛醌(UQ)及其泛醌醇是一种异戊烯化苯醌/苯醌醇脂，它是活性氧物质(ROS)产生的主要部位。它是线粒体呼吸链中的一种辅助因子，在线粒体呼吸链中它被复合物I和复合物II作用还原并且被复合物III作用氧化。在这些过程期间形成了泛半醌物质，该物质不稳定并产生过氧化物。而且，泛醌/泛醌醇是产生ROS的其它酶体系的氧化还原活性辅助因子，例如浆膜NAD(P)H氧化还原酶，又如溶酶体和过氧物酶体电子传递链。在所有这些位置中，在包括泛醌/泛醌醇的氧化还原反应期间都能产生ROS。
另外，泛醌是一种普遍存在的天然抗氧化剂，它存在于生物膜中有助于除去由内源过程或因毒素或放射产生的ROS。遗憾的是，膳食泛醌很少渗透到细胞中，特别是亚细胞器。
许多人类疾病牵涉活性氧物质，包括但不限于糖尿病(Nishikawa等(2000).Nature，404，787-790；Brownlee(2001).Nature 414，813-820)，组织缺氧/再氧化损伤(Li等(2002).Am J Physiol Cell Physiol 282，C227-C241；Lesnefsy等(2001).J.Mol Cell Cardiol 33，1065-1089；Cuzzocrea等(2001).Pharmacological Reviews 53，1，135-159)；帕金森氏病(Betarbet等(2002).Bioessays 24，308-318)；动脉粥样硬化症(Lusis，(2000).Nature，407，233-241)；和阿耳茨海默氏病(Butterfield等(2001).Trends in Molecular Medicine，7，12，548-554；Tabner等(2002)FreeRadical Biology & Medicine，32，11，1076-1083，2002)。
秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)clk-1基因影响许多生理速度，包括胚胎和胚胎后的发育、节律性行为、繁殖和寿命。clk-1编码一种187个氨基酸的蛋白，该蛋白定位到线粒体上并且和酵母蛋白Coq7p(已被证实是UQ生物合成所需的蛋白)是同源的。也已经证实clk-1是UQ生物合成必需的(Jonassen，T.等(2001).Proc Natl Acad SciU S A 98，421-6.；Miyadera，H.等(2001).J Biol Chem 276，7713-6)，因为从clk-1突变体提纯的线粒体完全缺乏UQ9(Miyadera，H.等(2001).JBilo Chem 276，7713-6)(下标指的是类异戊二烯的侧链长度)。相反，这些线粒体积累脱甲氧泛醌(DMQ9)(UQ9合成的中间体)(Miyadera，H.等(2001).J Biol Chem 276，7713-6)。近来的证据表明clk-1编码一种DMQ羟化酶(Stenmark，P.等(2001).J Biol Chem 2，2)。在大肠杆菌中DMQ8能维持分离膜的呼吸作用，尽管速度比UQ8低。同样地，在真核生物线粒体中，DMQ9能够运送电子传递，因为来自clk-1突变体的纯化线粒体(Felkai，S.等(1999).Embo J 18，1783-92)和线粒体酶(Miyadera，H.等(2001).J Biol Chem 276，7713-6)与野生型比较看来似乎是几乎完整的。而且，合成的DMQ2为来自复合物I(较少来自复合物II)的电子传递辅助因子(Miyadera，H.等(2001).J Biol Chem 276，7713-6)。令人感兴趣地，仅DMQ9存在于影响生理速度严重程度无关的全部3个clk-1等位基因中，这表明UQ缺乏不能单独解释Clk-1表型。
最近发现尽管DMQ9存在并具活性，clk-1突变体仍不能在UQ缺乏菌株上生长(Jonassen，T.等(2001).Proc Natl Acad Sci U S A 98，421-6)。虽然膳食UQ通常不能到达线粒体，认为这表明了DMQ9对于正常线粒体功能是不够的，但是膳食细菌UQ8能以痕量到达线粒体并起作用(Jonassen，T.等(2001).Proc Natl Acad Sci U S A 98，421-6)。
提供描述UQ缺乏的表型效应和筛选能影响clk-1活性和/或减轻多细胞生物的UQ缺乏的化合物方法将是非常值得去做的。
发明概要依照本发明提供筛选使得clk1纯合突变体脊椎动物胚胎存活的化合物的方法，该方法包含使杂合clk1受试者个体杂交获得clk1纯合突变体胚胎并且测定clk1纯合胚胎的生存力；其中在所述杂交前用所述化合物处理至少一种杂合受试者；并且其中能活的胚胎表明某种化合物可使clk1纯合胚胎存活。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述受试者是小鼠。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述化合物适于部分或完全功能性替代内源性泛醌。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述化合物通过选自口服、肌肉、静脉内、腹腔内、皮下、局部、皮内和透皮途径的至少一种途径给药。
依照本发明，提供一种适于拯救mclk1纯合细胞系的突变表型的复合物的筛选方法，该方法包含在敲出mclk1细胞系中测定一种突变表型的步骤，其中在所述测定前用所述化合物处理细胞系，并且其中表型水平表明一种适于拯救的化合物。
依照本发明，提供了一种适于部分或完全功能性替代内源性泛醌的化合物的筛选方法，该方法包含在mclk1敲出的纯合ES细胞系中测定一种突变表型的步骤；其中在测定前用化合物处理细胞系；其中表型水平表明适于部分或完全功能性替代泛醌的一种化合物。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述表型是指细胞呼吸作用和/或生长速率。
依照本发明，提供了一种适于在受试者中部分或完全功能性替代泛醌的化合物的筛选方法，该方法包含测定至少一种选自生存力、生育力和全部或部分缺乏coq-3纯合突变蠕虫突变表型的表型的步骤；其中在所述测定前用所述化合物处理所述蠕虫；并且其中至少一种选自生存力、生育力和全部或部分缺少突变表型的表型表明某种化合物适于部分或完全功能性替代受试者泛醌的化合物。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述化合物能到达所述受试者的线粒体中。
依照本发明，提供了一种筛选适于部分或完全功能性替代受试者泛醌的化合物的方法，该方法包含测定至少一种选自生存力、生育力和生长在泛醌缺失型支持体上的clk-1纯合突变蠕虫全部或部分缺乏Clk-1表型的表型的步骤；其中在所述测定前用所述化合物处理所述蠕虫；并且其中至少一种选自生存力、生育力和全部或部分缺乏所述Clk-1表型的表型表明某种化合物适于部分或完全功能性替代受试者的泛醌。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述泛醌缺失型支持体是一种不产生泛醌的细菌。
依照本发明另一个实施方案的方法，其中所述泛醌缺失型支持体是一种产生具有少于8个异戊二烯单元的侧链的泛醌的细菌。
依照本发明另一个实施方案的方法，其中所述化合物在受试者中至少能到达需要泛醌的非线粒体部位。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述细菌选自RKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496、KO229(pSN18)、KO229(Y37A/Y38A)、KO229(R321V)和KO229(Y37A/R321V)。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述细菌在至少一个选自ubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiE、ubiF和ispB的基因上存在突变。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述细菌携带至少一种选自pSN18、Y37A/Y38A、R321V和Y37A/R321V的质粒。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述泛醌的功能替代是指泛醌作为CLK-1的辅助因子的功能。
依照本发明，提供了关于筛选能抑制clk-1活性和/或在受试者中需要用脱甲氧泛醌制造泛醌的其它过程的化合物方法，该方法包含测定至少一种选自生长、生育力和在泛醌缺失型支持体上的野生型蠕虫全部或部分缺乏Clk-1表型的表型的步骤；其中在所述测定前用所述化合物处理所述蠕虫；并且其中至少一种选自全部或部分缺乏生长、缺乏生育力、完全或部分缺乏所述Clk-1表型的表型表明某种化合物能抑制clk-1活性和/或在受试者中需要用脱甲氧泛醌制造泛醌的其它过程。
依照本发明，提供了一种筛选适于完全或部分功能性代替泛醌的化合物的方法，该方法包含测定受试者(其中缺失mclk1和/或已知泛醌生物合成酶基因和/或改变时导致泛醌缺乏或减少的任何其它基因)突变表型的步骤；其中在所述测定前用所述化合物处理所述受试者；并且其中所述表型水平表明某种化合物适于完全或部分功能性代替泛醌。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述受试者是小鼠、ES细胞系或任何缺失mclk1的细胞系或缺失编码已知泛醌生物合成酶任何基因的细胞系和/或缺失改变时导致泛醌缺乏或减少的任何基因的细胞系。
依照本发明，提供了一种不能产生泛醌并且包含基因敲出性mclk1的小鼠；其中所述小鼠表达涉及泛醌缺乏和脱甲氧泛醌存在的表型。
依照本发明，提供了一种包含改变的mclk1的DNA构建物；其中所述DNA构建物有助于产生本发明的mclk1敲出品系小鼠。
依照本发明，提供了一种不能产生泛醌以及包含mclk1敲出基因的ES细胞系；其中所述ES细胞系表达涉及泛醌缺乏和脱甲氧泛醌存在的表型。
依照本发明，提供了一种不能产生泛醌的coq-3突变体；其中突变是指coq-3缺失或泛醌生物合成酶缺失和/或改变时导致泛醌缺乏或减少的任何其它基因的缺失。
依照本发明优选实施方案的突变体，其中所述受试者是一种蠕虫。
依照本发明优选实施方案的突变体，其中所述突变体选自用选自SHP172、SHP1773、SHP1774、SHP1775、SHP1840和SHP1865的PCR引物鉴定的蠕虫。
依照本发明，提供了一种筛选适于完全或部分功能性代替泛醌或脱甲氧泛醌的化合物的方法，该方法包含测定受试者(其中泛醌生物合成酶基因和/或改变时导致泛醌或脱甲氧泛醌缺乏或减少的任何基因发生了改变)突变表型的步骤；其中在所述测定前用所述化合物处理所述受试者；其中表型水平表明某种化合物适于完全或部分功能性代替泛醌或脱甲氧泛醌。
依照本发明，提供了一种适于减少和/或增加多细胞受试者泛醌水平的方法，该方法包含对受试者coq-3进行打靶的步骤。
依照本发明，提供了一种筛选clk-1的遗传抑制基因的方法，该方法包含测定至少一种选自生存力、生育力和在泛醌缺失型细菌上的clk-1突变蠕虫全部或部分缺乏Clk-1突变表型的表型的步骤；其中在测定前所述蠕虫携带所述遗传抑制基因；并且其中至少一种选自生存力、生育力和完全或部分缺乏所述Clk-1突变表型的表型表明存在clk-1的遗传抑制基因。
依照本发明，提供了筛选coq-3的遗传抑制基因的方法，该方法包含测定至少一种选自生存力、生育力和coq-3突变蠕虫全部或部分缺乏突变表型的表型的步骤；其中在测定前所述蠕虫携带所述遗传抑制基因；并且其中至少一种选自生存力、生育力和完全或部分缺乏所述突变表型的表型表明存在coq-3的遗传抑制基因。
依照本发明，提供了筛选适于完全或部分功能性代替泛醌的化合物的方法，该方法包含测定受试者(仅在细胞亚类和/或某生命周期缺失mclk1)的突变表型的步骤，其中在测定前用所述化合物处理所述受试者；并且其中表型水平表明某种化合物适于完全或部分功能性代替泛醌。
依照本发明优选实施方案的方法，其中所述化合物可用于治疗选自活性氧物质(ROS)介导性疾病、糖尿病、组织缺氧/再氧化损害、帕金森氏症、动脉粥样硬化症和阿耳茨海默氏病的疾病。
在本发明中，术语“泛醌缺失型支持体”表示不能产生泛醌或产生的泛醌的侧链太短不能生效的支持体。认为泛醌的侧链太短不能生效的实例是指泛醌的侧链少于8个异戊二烯单元。
附图简述


图1图解所述coq-3基因及其coq-3缺失(qm188)；图2A-E图解小鼠mclk1基因的定向破坏；图3图解mclk1突变体胚胎严重发育延迟；图4A-C图解mclk1flox等位基因的产生。对新霉素抗性克隆的DNA印迹分析；图5图解比较来自不同物种的COQ-3蛋白(SEQ ID NOS3-6)；图6A-E图解小家鼠(Mus musculus)的mclk-1基因组序列(外显子用黑体表示)(SEQ ID NO15)；图7A-E图解在突变敲出mclk-1等位基因的小家鼠基因组序列(外显子用黑体表示，新霉素盒以小写字母表示)(SEQ ID16)；图8A-E图解mclklflox等位基因序列。(外显子用黑体表示，loxp用斜体表示，插入的DNA片段以下划线强调)(SEQ ID NO21)发明详述依照本发明，提供了在多细胞生物体中泛醌缺乏的表型效应表征。
泛醌对秀丽线虫的发育和繁殖是必需的。
当生长不产生泛醌(UQ)的ubiG大肠杆菌突变株(Jonassen，T.等，(2001).Proc Natl Acad Scl U S A 98，421-6)上时，Clk-1突变体是不能完成发育的。所述ubiG基因产物在泛醌生物合成途径的两个步骤是必需的，并且ubiG突变体不产生任何UQ。进行实验来验证这种生长表型是由clk-1突变体ubiG菌株(GD1)的特定毒性产生的还是由所述泛醌缺乏产生的。为了这个目的，实施了在UQ生物合成缺陷(ubi突变体)的各种大肠杆菌突变体上生长的clk-1突变蠕虫的系统分析。已描述了9种参与UQ生物合成的大肠杆菌酶。除了第一个酶ubiC是一种可溶的分支酸裂解酶，它们都是膜结合性酶。在所述途径中下一个酶是异戊烯基转移酶ubiA(将类异戊二烯侧链连接到醌环上(在大肠杆菌中为8个亚基))。其它酶分为3个类别脱羧酶(ubiD，ubiX)、单加氧酶(ubiB，ubiH，ubiF)和甲基转移酶(ubiG，ubiE)。除了NGM平板包含0.5％葡萄糖使泛醌缺乏菌株的回复遗传最小化，用标准程序培养细菌和蠕虫。为了评价不同细菌菌株上的蠕虫发育，遵循标准方法，在含有所述测试细菌的平板上挑选并漂白成熟的雌雄同体。这个步骤确保在所述测试平板上无OP50细菌污染。将由漂白卵孵化的L1幼虫转移到新鲜平板上，并检查蠕虫的生长。所述使用的细菌菌株基因型描述于表1。检查每一个这些基因的细菌突变株上的所述3个clk-1突变株的生长(表1)。已鉴定了3个clk-1突变体等位基因qm30和qm51(假定无效的)以及e2519(携带一个clk-1基因点突变并显示相对温和的表型。
表1使用的大肠杆菌菌株菌株 基因型OP50 uraRKP1452KmR，ΔubiCA::KmRAN66 thr-1 leuB6 ubiD410IS-16 ubiX，得自THU菌株DM123 Rm1734yigR::KanGD1ubiG::KanDC349 FadR mel adhC81 acdA1AN70 Hfr metB StrR ubiE-401JC7623Δ4-1JC7623，ubiE::KanRJF496 ubiF411 asnB50::Tn5在全部细菌ubi-(突变体)测试菌株上，发现来自所述野生型菌株N2的L1幼虫能完成发育到成虫期，并且这些成虫一次性繁殖数量约为320只，和它们在ubi+细菌(OP50)上繁殖数量相似(表2)。这表明内源合成的泛醌是足够维持野生型表型，并不需要膳食泛醌。检验了许多不为人们所知的涉及UQ合成的蠕虫突变体(dpy-9，eat-2，mau-2)，包括长寿的突变体(daf-2和许多显示没有充分表征的Clk-1类表型的菌株)。在ubi-细菌上突变体的生长决不受损害。相反地，所有3个clk-1突变体在大多数ubi-细菌测试菌株表现相同它们发育非常缓慢或根本不发育，并且不产生后代(表2)。然而，所述clk-1突变体在ubiD、ubiX和ubiH突变体菌株(它们是产生残余量泛醌(大约为野生型的15％)的点突变菌株)上能发育并产生一些后代。因此，相对低水平的细菌UQ8足够使得clk-1突变体生长。
表2在ubi+和ubi-细菌上的野生型和clk蠕虫的生长和一次性繁殖数量分析菌株 基因型 N2(野生型) Clk-1突变体生长后代 生长 后代OP50 ubi+ +323±16 +qm30:94±12qm51:83±10e2519:177±4RKP1452ubiCAKO +331±37 -0AN66 ubiD +313±16 +qm30:82±5qm51:93±6e2519:182±26IS-16 ubiX +336±8+qm30:96±11qm51:83±10e2519:164±8DM123 ubiB KO +312±25 -0GD1ubiG KO +315±15 -0DC349 ubiH +329±16 +qm30:105±6qm51:90±3e2519:168±11JC7623 ubiEKO+313±4-0JF496 ubiF +330±4-0秀丽线虫对泛醌侧链长度敏感泛醌(UQ)是由醌环和种特异性长度的类异戊二烯链组成的。在秀丽线虫中有9个异戊二烯重复，在大肠杆菌中有8个异戊二烯重复，而在酿酒酵母中有6个异戊二烯重复。在哺乳动物中检测出了UQ9和UQ10(下标是指所述类异戊二烯的侧链长度)。UQ10是人体中存在的主要UQ种类，而UQ9是大鼠和小鼠中主要的UQ种类(Danlner，G.and Sindelar，P.J.(2000).Free Radic Biol Med 29，285-94)。所述UQ9和UQ10的不同组织分布呈现在表3中(Danlner，G.andSindelar，P.J.(2000).Free Radic Biol Med 29，285-94)。
表3泛醌在大鼠和人类中的组织分布大鼠 人类UQ9UQ10UQ9/UQ10UQ9UQ10UQ9/UQ10μg/gμg/g(％) μg/g μg/g (％)组织 组织组织 组织心脏202 178 31142.5肝脏131 2114 255 3.5肾脏n.d n.d - 367 4.5脑 37 1934 113 7脾脏23 9 28 125 4肺 17 2 10.5 18 11肠 51 1927 n.d n.d-UQ侧链长度由聚异戊二烯-二磷酸合酶控制。必需基因编码这些酶，然后将这些酶克隆到许多生物体中，包括酿酒酵母(coq1六异戊二烯-二磷酸合酶)、大肠杆菌(ispB八异戊二烯-二磷酸合酶)和荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)(sdsA茄呢醇-二磷酸合酶)。
使用秀丽线虫来评估UQ侧链长度的重要性。用来喂养所述蠕虫的外源性UQ是通过将所述蠕虫暴露在大肠杆菌突变体菌株(敲出原ispB基因并用不同种类的携带在拯救质粒上的ispB替代原ispB基因)中来操作的。ispB的种类指示细菌产生的UQ的侧链长度。N2(Bristol)被用作野生型菌株，然后分析clk-1(qm30)、clk-1(qm51)、clk-1(e2519)和daf-2(e1370)突变体菌株。在表4中描述了使用的细菌菌株基因型。编码突变型ispB的质粒在表5中描述。表6提供了一次性繁殖数量测量结果。计数10个蠕虫的全部后代并且进行两次实验。
表4用于研究UQ侧链长度的影响的细菌菌株的基因型菌株 基因型参考书OP50 Ura Laboratory collectionKO229 ispB::CamrOkada等，1997**Okada等(1997).Journal of bacteriology，179，9，3058-3060表5编码各种ispB的质粒
*Okada等(1997).Journal of bacteriology，179，9，3058-3060
**Kainou等(2001).The Journal of Biological Chemistry 276，11，7876-7883表6一次性繁殖数量分析
不同细菌菌株上的生长速率定性评估在不同细菌菌株上的蠕虫的胚胎后生长。观察到N2和daf-2突变体以相似的速度在所有细菌菌株上生长。然而，clk-1(qm30)突变体在OP50和KO229(pSN18)上有相似的生长速率，但是在其它菌株上延迟了3-5天。同样，在KO229(R321)突变体上的clk-1(e2519)突变体的胚胎后发育延迟了～1天(与OP50相比)。它们在KO229(Y37A/Y38A)上的生长受到的影响不太严重。最后，在KO229(Y37A/Y38A)上clk-1(e2519)开始产卵的时间延迟了1天，在KO229(R321A)和KO229(Y37A/R321A)上延迟了3天。
因此，这些实验显示了在秀丽线虫中对泛醌侧链长度敏感的过程，根据产生短链泛醌的细菌菌株上的clk-1突变体的表现显示。在qm30中不合适的侧链长度严重改变了发育和繁殖，而在e2519中轻微地或根本不改变发育和繁殖。
尽管已知clk-1(e2519)突变体不产生可检测的泛醌的事实，clk-1(e2519)突变体几乎未受影响的观测数据，表明了CLK-1参与不同于泛醌合成的过程。人们也能推断出e2519突变没有明显影响这个附加功能或CLK-1功能。然而，这些过程是泛醌依赖的，因为clk-1(e2519)突变体不能在完全缺乏泛醌的菌株上发育。例如，泛醌能在这些过程中担任氧化还原辅助因子。
内源性泛醌对于秀丽线虫的发育和繁殖是必需的为了检验膳食泛醌对于秀丽线虫的发育是否充足，制作了所述蠕虫基因coq-3的敲出突变(SEQ ID NO1)。coq-3编码一种甲基转移酶(SEQ ID NO2)，分别在酿酒酵母和大肠杆菌中详尽地表征了它的同系物(Coq3p和UbiG)。所述酶在Q合成的两个不同步骤起作用，并且在酵母和细菌突变体中既不产生UQ也不产生DMQ。所述蠕虫COQ-3蛋白的29％与酿酒酵母Coq-3p相同，28％与大肠杆菌UbiG相同(图5和SEQ ID NOS3-6)。一种随机诱变和基于PCR的筛选方法用于鉴定在根据标准规程修改的coq-3上的缺失。所述coq-3基因定位于秀丽线虫的4号染色体上，并且如
图1所示是包含gdi-1基因和NADH-泛醌氧化还原酶基因的操纵子的一部分。coq-3含有5个预知的外显子。所述coq-3中缺失(qm188)除去了2456bp(SEQ IDNO7)，因此除去了外显子3和外显子4(SEQ ID NOS1和8)，并且防止产生任何功能蛋白。为了检验coq-3的基因型，然后用引导区在coq-3基因外或在相当于所述qm188突变中获得的缺失的区域内的多套引物进行PCR分析。为了检验在coq-3基因上存在缺失，用来自单一蠕虫的基因组DNA进行PCR分析。用引物识别序列同时检验每个DNA制品，所述引物识别序列在coq-3基因外(SHP1772(5`-CTGATTTCTTCCAGAGCTCTCTTGCCGCAC3`)(SEQ ID NO9)，SHP1773(5`-AGCATTCCCGAGATGATGCACTCCTTGAGG-3`)(SEQID NO10)，SHP1774(5`-TAGCGACTCTCAGCGACAAGCTTAACC-3`)(SEQ ID NO11)和SHP1775(5`-GAGGCCGGTTCCGAGACGATGGCATCG-3`)(SEQ ID NO12))或在所得到的缺失内(SHP1840(5`-CCTCCTCGCGCACTACACACCATC-3`)(SEQ ID NO13)和(SHP1865(5`-CGAAGCGACGACTGCATCGTAGGC-3`)(SEQ ID NO14))。
图1显示所述引物的定位。当用引物扩增所述整个coq-3基因时，野生型蠕虫获得了一个4.3kb的带。相反地，扩增了一条来自coq-3/coq-3蠕虫的1.8kb的突变体带。当在所述缺失区退火的引物时，野生型和杂合体蠕虫都给出了一条1.1kb的PCR产物，然而用coq-3/coq-3杂合体蠕虫没有检测到带，这进一步证实了所述coq-3/coq-3突变体的纯合体特性。
经PCR验证，自体受精的coq-3(qm188)/+雌雄同体产生1/4的纯合coq-3(qm188)/coq-3(qm188)后代。这些coq-3纯合体发育缓慢并且与野生型蠕虫比较看来相当小。大多数是不育的，但是大约25％(n＝31)产生一些后代(5-10枚卵)，这些后代在L1期发育停止并在其后迅速死亡。为了测量一次性繁殖数量，计数20个蠕虫的全部后代。这些观测结果表明了用杂合体母体对coq-3纯合体的部分母体拯救效应，因为第一纯合体世代(缓慢发育到成虫期)的表型与第二纯合体世代(在L1时期停止发育)的表型相比不太严重。UQ通过母体供给胚胎或供给coq-3mRNA或蛋白的母体沉积能产生母体效应。
也观察到杂合体coq-3/dpy-4蠕虫的一次性繁殖数量大量减少(185±64；n＝20)，表明所述coq-3表达水平可能受UQ生物合成的限制并且表明所述蠕虫的繁殖能力对内源UQ的生物合成水平降低是非常敏感的。
为了确定所述观测到的表型是单独由coq-3基因突变引起的，用rol-6转化标记通过种系转化将相当于野生型coq-3基因的基因组片段导入coq-3/+杂合体中。然后进行所述显微注射程序以产生标准染色体外阵列。注射一个包含所述coq-3基因组序列的PCR片段(50ng/μL)来分析拯救情况。pRF4质粒(120ng/μL)被用作辅助注射标记来筛选转基因蠕虫。因为coq-3纯合体是致死的，将coq-3/dpy-4蠕虫用于注射。通过在它们的后代中检查Dpy表型的缺失来选择纯合的拯救系，并且经PCR分析进一步证实所述基因型。
纯合型coq-3转基因动物(显示标记表型，Rol)发育正常并且是可育的，表明了观测到的表型是真正由所述coq-3缺失引起的。然而，携带coq-3和rol-6序列的染色体外阵列(extrachromesornal array)不能产生强烈的母体效应。当然，直接产生于携带所述阵列(Rol表型)的母体的阵列(非Rol表型)的纯合动物超过L2时期不能发育。在秀丽线虫种系中来自染色体外阵列(extrachromesornal array)基因的表达有时是沉默和贫乏的。所述母体效应的观测结果表明所述母体在卵母细胞中沉积了基本产物(UQ和/或coq-3mRNA)。在任一情况，在所述种系中coq-3的正确表达对所述效应是必需的。
coq-3突变体的致死性表型表明膳食UQ对蠕虫的生长和发育是不充足的。这和其它体系中的发现是一致的，表明了膳食UQ不能到达线粒体区室，或仅以非常少的数量到达线粒体区室。认为膳食UQ对蠕虫是充足的可能性可解释生长在ubi+细菌上的clk-1突变体可存活表型，以及它们生长在ubi-突变体细菌上的致死表型。然而，所述coq-3突变体表型清楚地表明，即使存在膳食细菌UQ8，内源UQ9和DMQ9(在coq-3突变体中)的总体缺乏，不能用内源DMQ9同等替代内源UQ9(在clk-1突变体中)。
在这方面，尤其关心clk-1突变体通过以ubiF突变体为食不能茁壮成长。当然，将ubiF突变体中UQ的生物合成抑制在如同clk-1突变体中UQ生物合成的同一水平，ubiF细菌因此产生DMQ8。因为DMQ9在线粒体呼吸链中有效率地进行(Miyadera等(2002))，我们的发现证明在需要UQ的非线粒体部位内源DMQ和膳食DMQ都不能替代UQ。
在线粒体和非线粒体部位泛醌都是必需的这里呈现的结果证实在不同的亚细胞区域UQ对秀丽线虫的生长和发育是必需的。首先，在线粒体中内源DMQ9能功能性地替代UQ9。当然，clk-1突变体的线粒体不含有UQ9但是有功能(Miyadera，H，等，(2001).J Biol Chem 276，7713-6)，并且所述coq-3突变体(既不产生UQ9也不产生DMQ9)的表型比clk-1突变体表型严重得多。其次，在非线粒体部位，内源DMQ9或膳食DMQ8或具有短于8个异戊二烯单元的侧链的膳食UQ不能在功能上替代内源UQ9，但是膳食UQ8能在功能上替代UQ9。事实上，具有功能性线粒体并产生DMQ9的clk-1突变体没有膳食UQ8不能发育和生长，甚至在来自ubiF细菌的膳食DMQ8或具有短的侧链的膳食UQ的存在下也如此。
这与对在其它体系中UQ摄取和新陈代谢的大量研究的结果一致，例如啮齿类(Dallner，G.和Sindelar，P.J.(2000).Free Radic Biol Med29，285-94)。在这些实验中的膳食UQ吸收很少(最初摄入的泛醌为2-3％)并且多数分布到浆膜、溶酶体和高尔基体，即使有也仅以极少量出现在线粒体中。如果每一个细胞内源产生UQ，没有确定的有效摄取体系吸收这种非常复杂的脂类。
这些研究阐明在蠕虫生物学中所述内源和膳食UQ的作用。同样，第一次证明UQ在非线粒体部位上对生物体的生存力或生育力的功能重要性。对于线粒体疾病患者，在非线粒体部位上膳食UQ的作用能解释膳食UQ的有利影响(Dallner，G.and Sindelar，P.J.(2000).FreeRadic Biol Med 29，285-94)。例如，发现UQ参与调节在质膜上细胞氧化还原态的反应。经常发现缺陷性线粒体引起的病状增加细胞氧化压力并且膳食UQ能增强浆膜的保护功能。另外，在细菌中发现醌担任细胞氧化还原态的初级信号。在大肠杆菌中，UQ负调节磷酸化状态和ArcB的功能(一种重要的表达全面调节物)。
所述coq-3和clk-1突变体菌株提供遗传体系来鉴定在线粒体和/或非线粒体部位上选择性地替代泛醌的化合物。这类化合物的筛选能根据它们选择性拯救生长在UQ缺乏细菌或非UQ缺乏细菌上的coq-3或clk-1突变体表型的能力进行。例如，能到达线粒体的化合物可拯救coq-3突变体表型。
另一方面，线粒体外部位选择性化合物拯救生长在UQ缺乏细菌上的clk-1蠕虫表型，但是不能拯救在野生型细菌上生长的coq-3动物的致死表型。这种生物可利用的泛醌模拟物的开发受到强烈的医学关注。
小家鼠mclk-1基因破坏的表型结果的研究在小鼠胚胎干(ES)细胞中通过同源重组破坏mclk1基因座，然后用标准方法产生杂合体和纯合体小鼠。用基因组mclk1片段筛选来自小鼠品系129/SvJ DNA(Stratagene)的IFIX II基因组文库，然后获得六个重叠的基因组克隆。将来自两个克隆的基因组DNA片段亚克隆到Bluescript SK并详细表征。将一个包含部分mclk1启动子和外显子I、II、III的7kb Notl-BamHI片段亚克隆到Bluescript SK(pL5)中。用Stul/BamHI消化从pL5除去包含部分外显子II和外显子III的1.6kb片段，然后用来自pMClNeo polyA的1.1kb Xhol平端化BamHI片段组成的新霉素盒替代来产生pL5+Neo。将包含内含子IV和V以及来自5`UTR区域的500bp的2.8kb Pstl-Sacl基因组片段亚克隆到Bluescript(pL15)中。将来自pL15的一个2.5kb EcoRV-Xhol片段插入到pL5+Neo的Smal-Xhol部位来产生最终替代靶向载体pL17。将来自所述靶向载体的Kpnl片段分离并电穿孔到R1胚胎干细胞(ES)中。用DNA印迹分析分析成功靶向的克隆。用BglII消化基因组DNA，然后用3`外部探针(侧接所述靶向载体(Sacl-Xhol片段)的3`区)杂交。一种新霉素探针用来检测基因组中随机整合。将ES克隆注射到CD-1小鼠胚泡，然后获得种系转化。分析2000个抗G14抗性克隆，其中4个克隆是同源重组体。两个具有正确核型的独立靶向ES细胞克隆用于产生纯合(-/-)mclk1小鼠。图2A、C和D显示野生型mclk1基因座和所述靶向载体的图谱，黑盒子代表外显子。所述靶向载体由用新霉素基因替代一部分外显子II和外显子III和IV所组成，在图2中表示为白盒子。指出的限制性内切酶部位是BamHI；B，BglII；E，EcoRI；K，Kpnl；R，EcoRV；S，Sacl；X，Xhol。分别在图6A-E(SEQ ID NO15)和7A-E(SEQ ID NO16)给出了小家鼠野生型mclk-1基因座和突变敲出mclk-1等位基因的基因组序列。
为了基因型的测定，用成熟小鼠的尾巴和胚胎卵黄囊制备DNA。如上所述做DNA印迹分析。做30个循环的PCR(95℃，30秒；58℃，30秒；72℃，30秒)。用于检测野生型mclk1等位基因的引物如下正向(KO5)5`-ggt gaa gtc ttt tgg gtt tga gca t-3`(SEQ ID NO17)；反向(KO6)5`-tgt cta agg tca tcc ccg aac tgt g-3`(SEQ ID NO18)。它们扩增一条302bp的带。用引物KO7(5`-gcc agc gat atg act cag tgg gta a-3`)(SEQ ID NO19)和KO8(5`-cac ctt aat atg cga agt gga cct g-3`)(SEQID NO20)检测所述靶向mclk1等位基因，获得一个397bp的产物。
图2E展示了所述PCR分析。
杂合体(+/-)小鼠是能活和能育的。它们未显示明显的解剖或行为缺陷。然而，杂合体的雄性小鼠和雌性小鼠杂交后，在超过81个后代中没有观察到新生(-/-)小鼠(表7)，表明mclk1的纯合破坏导致胚胎的致死现象。为了测定致死性质，分析了怀孕不同天数的杂合杂交胚胎(表7)。mclk1(-/-)胚胎出现于预期的孟德尔频率为E8.5，然而，所有检测到的mclk1(-/-)胚胎(E13.5)都处于重吸收过程中。所述纯合胚胎也显示了在交配后的9.5天清楚明显的发育延迟(图3)。所述突变体与野生型同窝出生仔畜相比显著地小。
表7来自mclk1杂合杂交的基因型分布时期 总数+/+# +/- -/- n.d.
E8.5 74 18(24％) 40(54％) 14(19％) 2E9.5 85 23(27％) 48(56％) 12(14％) 2E10.5 181 50(28％) 114(63％) 16(9％) 3E11.5 137 35(26％) 84+2*(63％) 12+1*(9％) 2+1*E12.5 66 8(12％) 41+2*(65％) 2+2*(6％) 1+10*新生 81 26(32％) 55(68％) 0 -n.d.未测定。*胚胎被重吸收。#如方法所述通过PCR分析测定所述胚胎的基因型，用DNA印迹测定幼崽的基因型。
E11.5胚胎总RNA的RNA印迹分析显示，当与正常胚胎比较时在杂合胚胎中mclk1 mRNA的数量减少了大约50％，并且在mclk1(-/-)胚胎中检测不到mclk1 mRNA。图2B显示了来自mclk1+/+和+/-小鼠、来自E11.5mclk1+/+，+/-和-/-同窝出生仔畜的组织中总RNA水平的RNA印迹分析。cox1(一个线粒体编码的细胞色素氧化酶亚基(复合物IV))的表达水平被显示为对照之一。所述cox1的表达水平给出了一个测量在指定的组织中氧化磷酸化能力的好方法。用全长小鼠mclk1 cDNA作探针做RNA印迹分析。在纯合胚胎中观察到的减少水平可能是由开始重吸收过程引起的。与野生型同窝出生仔畜相比，在44天大mclk1(+/-)小鼠的肝脏、心脏、肾脏、肌肉、胃和小脑中观测到mclk1转录物减少了大约50％。在从(+/+)和(+/-)小鼠提取的肝脏和心脏提取物中以多克隆抗体的免疫印迹显示出一条约21kDa的带。与(+/+)小鼠相比在(+/-)小鼠中这个信号减少了50％(图2D)。所述结果证实所述mclk1突变是一种无效突变并证明在(+/-)小鼠中减少的蛋白水平的基因剂量效应。用针对mCLK1和针对对照COX1和膜孔蛋白的抗体探查从两天大小鼠的肝脏和心脏中提取的总蛋白。膜孔蛋白是一种在细胞核编码的外部线粒体膜蛋白。用针对来自Molecular Probes的细胞色素氧化酶亚基I(1D6-E1-A8)和IV(20E8-C12)单克隆抗体以及针对来自Calbiochem的人膜孔蛋白31HL的单克隆抗体做蛋白质印迹。
通过HPLC测定在mclk1(+/+)、(+/-)、(-/-)胚胎匀浆中泛醌-9(UQ9)和泛醌-10(UQ10)含量。如下制备用于泛醌分析和酶活性测量的无细胞提取液。所述样品在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)中匀浆，然后在4℃以1,000g离心5分钟。上清液用于泛醌含量的测定和酶活性的测量。用牛血清白蛋白作标准品测定蛋白浓度。如所述(Miyadera，H.等(2001).J Biol Chem 276，7713-6)提取泛醌，仅略有修改。简单地说，将用正己烷/EtOH提取的泛醌在氮气下干燥，溶于丙酮，然后置于-80℃。30分钟后，所述样品在4℃以17,000g离心15分钟，然后将上清液在氮气下干燥。将残留物溶于乙醇，旋涡震荡2分钟，然后进行配备保护柱和分析柱(CSC 80，ODS2，C-18，5μm，4.6×250mm)的HPLC(Model 100A，Beckman)。流动相是以2ml/min的流速的甲醇/乙醇(70/30，v/v)。用一个波长检波器(165可调波长检波器，Beckman)在275nm监测洗脱情况。如所述(Miyadera，H.等(2001).J Biol Chem276，7713-6)分光光度法测定泛醌浓度。
对于mclk1+/+胚胎，一个主峰在11.9分钟洗脱出，洗脱时间同标准UQ是一样的。在约17.3分钟的一个较小的峰相当于UQ10。杂合mclk1(+/-)胚胎的醌分布同野生型是一样的。在野生型胚胎和杂合胚胎中UQ9和UQ10的数量是相似的(表8)。然而，在mclk1(-/-)胚胎中观察到既没有UQ9的存在也没有UQ10的存在(表8)。这些突变体胚胎显示主峰比UQ9早洗脱0.46分钟，与DMQ9标准品一致。
表8ES细胞和胚胎中的醌含量醌类型样品 基因 DMQ9UQ9UQ10(ng/mg蛋白) (ng/mg蛋白) (ng/mg蛋白)胚胎+/+ ND 126.7 13.6+/- ND 125.8 14.5-/- 37.1 NDNDES细胞ES1(+/+) ND 265 16.8ES2(+/-) ND 89.5 4.2ES7(-/-) 38.4 NDNDN.D.未检测到。
mclk1(+/+)、(+/-)和(-/-)ES细胞系来自按照标准程序获得的杂合交配的E3.5胚泡。在这些细胞系中观察到醌分布型与同等的突变体胚胎的醌分布型相同，包括浓度(表4)。特别地，在mclk1(-/-)ES细胞系(ES7)中仅检测到DMQ9。
因为秀丽线虫clk-1突变体的情况下，在mclk1突变体中产生的DMQ对维持相对高水平的氧耗(野生型的62％)看来似乎是充足的。令人惊讶的是这种水平的线粒体功能对实现胚胎形成是不够的。然而，许多因素参与严重表型。此外，在几乎所有生物膜中发现了UQ并且已知UQ是线粒体中解偶联蛋白(UCP)的辅助因子，调节渗透性转移孔以及在质膜和溶酶体氧化还原体系中发挥作用。尽管在呼吸链中DMQ能部分替代UQ，但DMQ作为UQ类似物对于UQ某些其它功能是较少有效率的，DMQ引起的损害参与严重表型。最后，最近公开了在细菌中醌是调节响应氧有效性的生长的一级信号。已知在原核生物和真核生物之间保守的感觉环境信号(例如PAS结构功能域蛋白)的极重要的分子机制，mclk1突变体完全缺乏UQ直接影响所述胚胎生长的调节。
研究mclk1基因组织特异性和暂时控制性敲出另外，已经开始了用小家鼠研究mclk1基因组织特异性和暂时控制性敲出。创造了mclk1flox等位基因并且依下列各项产生嵌合小鼠。为了研究mCLK1蛋白在特定细胞中的功能作用，条件基因灭活技术和Cre-loxP介导性重组一起使用。为了产生能被Cre-重组修饰的mclk1等位基因，构建了一个包含大约7.5kb的mclk1基因组DNA靶向载体，其中选择盒(侧接loxP部位)导入外显子4下游而在外显子2上游的第三个loxP部位(参见图4A-C和图8A-E(SEQ IDNO21))。在图4A-C中，一条水平线代表clk1基因组DNA。用空框代表外显子，灰色框为neo-TK表达盒，箭头表明neo和TK的转录方向。黑箭头代表loxP部位。限制性位点是BglII(B)，Bspel(P)，EcoRI(E)，HindIII(H)，Sacl(S)，Swal(W)，Xhol(X)。在ES细胞转染后，通过DNA印迹分析鉴定同源重组。用BglII消化基因组DNA，然后用3`外部探针(侧接所述靶向载体的3`区)(Sacl-Xhol片段)杂交基因组DNA。在通过大量的DNA印迹分析有希望的新霉素抗性克隆之后，3个克隆(30，48和84)显示了正确的同源重组(图4)。图4A展示了mclk1基因座和所述靶向载体的图解表示。描绘了适于DNA印迹的不同探针。图4B列出了用不同酶消化的预期片段大小。图4C显示用不同探针在BglII或EcoRI消化DNA后进行的DNA印迹。
如果存在经外显子4下游loxP部位侧接的选择盒的插入而没有外显子2上游第三loxP部位的插入，获得的一条9kb的带，在图4C中以a*表示。
接着详细描述mclk1flox等位基因的制备。从129/SvJ品系小鼠文库(Stratagene)分离mclk1基因组DNA，然后将包含外显子2、3、4、5和6的大约7.5kb HindIII-Xhol片段亚克隆到pBluescript。将包含loxP部位的引物(3`-CCG GAG CTA GCG AGC TCG GAA TAA CTT CGTATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT TAT GGC GAA TT-5`)(SEQ IDNO11)导入到一个外显子2上游的Bespl部位。在内含子4中将侧接两个loxP部位的包含neor和HSV-tk基因的盒导入Swal部位来产生靶向替代载体pL75。从质粒CDLNTKL(SEQ ID NO12)分离这个盒(一个4.3kbXhol/NotI片段)，然后用Klenow酶填齐凹进的3`末端。
为了产生同源重组体，用HindIII-Xhol靶向载体片段电穿孔到得自129/Sv小鼠的R1 ES细胞(12代)。用DNA印迹杂交确定同源重组体。用BglII消化基因组DNA，然后用3`外部探针(侧接所述靶向载体的3`区)杂交基因组DNA(Sacl-Xhol片段)。其它探针用于检测基因组中的随机插入。于65℃在6×SSC，5×Denhart，0.5％SDS中进行杂交16小时。用3×SSC，0.1％SDS洗印迹两次，然后用1×SSC，0.1％SDS洗印迹两次，每次20分钟。为了产生I型和II型缺失，用25μg包含cre-重组酶基因的pBS185电穿孔到5×106同源重组体细胞，平板培养并用2μM9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤筛选48小时后。用DNA印迹分析存活克隆。用SacII消化基因组DNA，然后用3`外部探针(侧接所述靶向载体的3`区)杂交基因组DNA(Sacl-Xhol片段)。
虽然已描述了本发明连同其具体实施方案，但是应当明确的是，本发明能进一步修正并且本申请包含任何变化、用途或根据本发明基本原理对本发明进行的各种修改，包括虽然偏离本申请公开内容但是属于本发明所属领域已知或常规实践范畴的修改，而且这样的修改同样适用于本发明以上给出的基本特征以及后面权利要求书范围的特征。
序列表<110>MCGILL UNIVERSITYHEKIMI，SiegfriedHIHI，AbdelmadjidLEVAVASSEUR，FrangoiseSHOUBRIDGE，EricGAO，YuanPAQUET，MichelBENARD，Claire<120>辅酶Q缺乏的表型效应及其筛选方法<130>1770-299PCT<150>60/310,231<151>2001-08-07<160>21<170>FastSEQ for Windows Vetsion 4.0<210>1<211>3115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Coq-3敲除突变<400>1atgatccctt cacgaagtgc cagaatcatc gcaaagctac aacgactaca ctcgactact 60tcagccgctt cagtatcttc tattgatgta aaagaggtaa aacatataaa aataagctat120ttatctgtag aaaaattatt ttaggtcgaa aaattcggag acttgtctgc agaatgggct180gatgaactgg gtcccttcca cgcacttcac tcattaaaca ggattcgagt tccttggatt240gtcgataatg ttagaaaaag cgatcagaag gctcctcctc gattagtgga cgttggaagc300ggagggggtc ttttgtcgat tccactggcc agaagtggat tcgatgttac aggaattgat360gcgacgaagc aagctgtaag ggagattttc ccatttttct gggaatttat gcaaaatcag420ctctaagaca tcaaaaacta tgaaaattta tcggttttct cactgaaata ttgtcatttt480ttcaatttct ttgattgaaa ttgcgtttta aattaccaaa aacgatctga tttttaaatt540ttgcaaaaag caaaatgccg cacagaaaag aggcggggcg atttggcaac cctgcggcac600ggttttttct tctgttattt tcgcaaaaat cgccaatttt acacagtttt ttgcaataaa660attttgattt cacttgtttt attcactttc tattaaatat tgtgtgaata tttcatgttt720tgcaaccaat tttgcataaa atgttctcaa aatccaacat ttcagtgaga aaatcgataa780attttaatgt tttggattaa aatagagctg atcttgccta attatactgg gtttaaatga840ataatttcca ggtagaagct gcgaatcagt ccctcacagc gaaacccctt caaattgccg900gaatctcgaa gcgcctccgg ttcgagcata ccagcgtcga ggatttctgt cagaagccac960
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<223>甲基转移酶<400>2Met Ile Pro Ser Arg Ser Ala Arg Ile Ile Ala Lys Leu Gln Arg Leu1 5 10 15His Ser Thr Thr Ser Ala Ala Ser Val Ser Ser Ile Asp Val Lys Glu
20 25 30Val Glu Lys Phe Gly Asp Leu Ser Ala Glu Trp Ala Asp Glu Leu Gly35 40 45Pro Phe His Ala Leu His Ser Leu Asn Arg Ile Arg Val Pro Trp Ile50 55 60Val Asp Asn Val Arg Lys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro Arg Leu Val65 70 75 80Asp Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Leu Ser Ile Pro Leu Ala Arg Ser85 90 95Gly Phe Asp Val Thr Gly Ile Asp Ala Thr Lys Gln Ala Val Glu Ala100 105 110Ala Asn Gln Ser Leu Thr Ala Lys Pro Leu Gln Ile Ala Gly Ile Ser115 120 125Lys Arg Leu Arg Phe Glu His Thr Ser Val Glu Asp Phe Cys Gln Lys130 135 140Pro His Asn Lys Ser Ala Tyr Asp Ala Val Val Ala Ser Glu Ile Val145 150 155 160Glu His Val Ala Asp Leu Pro Gly Phe Ile Gly Cys Leu Ala Glu Leu165 170 175Ala Arg Pro Gly Ala Pro Leu Phe Ile Thr Thr Ile Asn Arg Thr Trp180 185 190Leu Ser Lys Leu Ala Ala Ile Trp Leu Ala Glu Asn Val Leu Lys Ile195 200 205Val Pro Pro Gly Val His Asp Trp Glu Lys Phe Ile Thr Pro Ala Glu210 215 220Leu Thr Ser His Leu Glu Lys Ala Gly Cys Arg Val Thr Ala Val His225 230 235 240Gly Leu Met Phe His Pro Val Gly Asn His Trp Thr Trp Ile Glu Ser245 250 255Thr Gln Cys Asn Tyr Gly Ile Leu Ala Val Lys Asn260 265<210>3<211>267<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>来自秀丽线虫(C.elegans)的Coq-3蛋白<400>3Met Ile Pro Ser Arg Ser Ala Arg Ile Ile Ala Lys Leu Gln Arg Leu1 5 10 15His Ser Thr Thr Ser Ala Ala Ser Val Ser Ser Ile Asp Val Lys Glu20 25 30Val Glu Lys Phe Gly Asp Leu Ser Ala Glu Trp Ala Asp Glu Leu Gly35 40 45Pro Phe His Ala Leu His Ser Leu Asn Arg Ile Arg Val Pro Trp Ile
50 55 60Val Asp Asn Val Arg Lys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro Leu Val Asp65 70 75 80Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Leu Ser Ile Pro Leu Ala Arg Ser Gly85 90 95Phe Asp Val Thr Gly Ile Asp Ala Thr Lys Gln Ala Val Glu Ala Ala100 105 110Asn Gln Ser Leu Thr Ala Lys Pro Leu Gln Ile Ala Gly Ile Ser Lys115 120 125Arg Leu Arg Phe Glu His Thr Ser Val Glu Asp Phe Cys Gln Lys Pro130 135 140His Asn Lys Ser Ala Tyr Asp Ala Val Val Ala Ser Glu Ile Val Glu145 150 155 160His Val Ala Asp Leu Pro Gly Phe Ile Gly Cys Leu Ala Glu Leu Ala165 170 175Arg Pro Gly Ala Pro Leu Phe Ile Thr Thr Ile Asn Arg Thr Trp Leu180 185 190Ser Lys Leu Ala Ala Ile Trp Leu Ala Glu Asn Val Leu Lys Ile Val195 200 205Pro Pro Gly Val His Asp Trp Glu Lys Phe Ile Thr Pro Ala Glu Leu210 215 220Thr Ser His Leu Glu Lys Ala Gly Cys Arg Val Thr Ala Val His Gly225 230 235 240Leu Met Phe His Pro Val Gly Asn His Trp Thr Trp Ile Glu Ser Thr245 250 255Gln Cys Asn Tyr Gly Ile Leu Ala Val Lys Asn260 265<210>4<211>316<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>来自酿酒酵母的Coq-3蛋白<400>4Met Gly Phe Ile Met Leu Leu Arg Ser Arg Phe Leu Lys Val Ile His1 5 10 15Val Arg Lys Gln Leu Ser Ala Cys Ser Arg Phe Ala Ile Gln Thr Gln20 25 30Thr Arg Cys Lys Ser Thr Asp Ala Ser Glu Asp Glu Val Lys His Phe35 40 45Gln Glu Leu Ala Pro Thr Trp Trp Asp Thr Asp Gly Ser Gln Arg Ile50 55 60Leu His Lys Met Asn Leu Thr Arg Leu Asp Phe Val Gln Arg Thr Val65 70 75 80Arg Asn Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Glu Ile Phe Val Pro Gly Phe85 90 95
Asn Tyr Lys Glu Phe Leu Pro Glu Tyr Val Cys Asp Asn Ile Gln Arg100 105 110Glu Met Gln Glu Ser Ile Glu Thr Asn Leu Asp Lys Arg Pro Glu Val115 120 125Ser Val Leu Asp Val Gly Cys Gly Gly Gly Ile Leu Ser Glu Ser Leu130 135 140Ala Arg Leu Lys Trp Val Lys Asn Val Gln Gly Ile Asp Leu Thr Arg145 150 155 160Asp Cys Ile Met Val Ala Lys Glu His Ala Lys Lys Asp Pro Met Leu165 170 175Glu Gly Lys Ile Asn Tyr Glu Cys Lys Ala Leu Glu Asp Val Thr Gly180 185 190Gln Phe Asp Ile Ile Thr Cys Met Glu Met Leu Glu His Val Asp Met195 200 205Pro Ser Glu Ile Leu Arg His Cys Trp Ser Arg Leu Asn Pro Glu Lys210 215 220Gly Ile Leu Phe Leu Ser Thr Ile Asn Arg Asp Leu Ile Ser Trp Phe225 230 235 240Thr Thr Ile Phe Met Gly Glu Asn Val Leu Lys Ile Val Pro Lys Gly245 250 255Thr His His Leu Ser Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Glu Ile Leu Ala Trp260 265 270Phe Asn Asp Asn Tyr Ser Gly Gln Phe Arg Leu Leu Asp Leu Lys Gly275 280 285Thr Met Tyr Leu Pro Tyr Gln Gly Trp Val Glu His Asp Cys Ser Asp290 295 300Val Gly Asn Tyr Phe Met Ala Ile Gln Arg Leu Asn305 310 315<210>5<211>240<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>来自大肠杆菌的Coq-3蛋白<400>5Met Asn Ala Glu Lys Ser Pro Val Asn His Asn Val Asp His Glu Glu1 5 10 15Ile Ala Lys Phe Glu Ala Val Ala Ser Arg Trp Trp Asp Leu Glu Gly20 25 30Glu Phe Lys Pro Leu His Arg Ile Asn Pro Leu Arg Leu Gly Tyr Ile35 40 45Ala Glu Arg Ala Gly Gly Leu Phe Gly Lys Lys Val Leu Asp Val Gly50 55 60Cys Gly Gly Gly Ile Leu Ala Glu Ser Met Ala Arg Glu Gly Ala Thr65 70 75 80Val Thr Gly Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Leu Gln Val Ala Lys Leu
85 90 95His Ala Leu Glu Ser Gly Ile Gln Val Asp Tyr Val Gln Glu Thr Val100 105 110Glu Glu His Ala Ala Lys His Ala Gly Gln Tyr Asp Val Val Thr Cys115 120 125Met Glu Met Leu Glu His Val Pro Asp Pro Gln Ser Val Val Arg Ala130 135 140Cys Ala Gln Leu Val Lys Pro Gly Gly Asp Val Phe Phe Ser Thr Leu145 150 155 160Asn Arg Asn Gly Lys Ser Trp Leu Met Ala Val Val Gly Ala Glu Tyr165 170 175Ile Leu Arg Met Val Pro Lys Gly Thr His Asp Val Lys Lys Phe Ile180 185 190Lys Pro Ala Glu Leu Leu Gly Trp Val Asp Gln Thr Ser Leu Lys Glu195 200 205Arg His Ile Thr Gly Leu His Tyr Asn Pro Ile Thr Asn Thr Phe Lys210 215 220Leu Gly Pro Gly Val Asp Val Asn Tyr Met Leu His Thr Gln Asn Lys225 230 235 240<210>6<211>249<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>来自H.sapiens的Coq-3蛋白<400>6Met Asn Asp Leu Arg Val Pro Phe Ile Arg Asp Asn Leu Leu Lys Thr1 5 10 15Ile Pro Asn His Gln Pro Gly Lys Leu Leu Gly Met Lys Ile Leu Asp20 25 30Val Gly Cys Gly Gly Gly Leu Leu Thr Glu Pro Leu Gly Arg Leu Gly35 40 45Ala Ser Val Ile Gly Ile Asp Pro Val Asp Glu Asn Ile Lys Thr Ala50 55 60Gln Cys His Lys Ser Phe Asp Pro Val Leu Asp Lys Arg Ile Glu Tyr65 70 75 80Arg Val Cys Ser Leu Glu Glu Ile Val Glu Glu Thr Ala Glu Thr Phe85 90 95Asp Ala Val Val Ala Ser Glu Val Val Glu His Val Ile Asp Leu Glu100 105 110Thr Phe Leu Gln Cys Cys Cys Gln Val Leu Lys Pro Gly Gly Ser Leu115 120 125Phe Ile Thr Thr Ile Asn Lys Thr Gln Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Ile130 135 140Val Phe Ser Glu Gln Ile Ala Ser Ile Val Pro Lys Gly Thr His Thr145 150 155 160
Trp Glu Lys Phe Val Ser Pro Glu Thr Leu Glu Ser Ile Leu Glu Ser165 170 175Asn Gly Leu Ser Val Gln Thr Val Val Gly Met Leu Tyr Asn Pro Phe180 185 190Ser Gly Tyr Trp His Trp Ser Glu Asn Thr Ser Leu Asn Tyr Ala Ala195 200 205Tyr Ala Val Lys Ser Arg Val Gln Glu His Pro Ala Ser Ala Glu Phe210 215 220Val Leu Lys Gly Glu Thr Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Cys Thr Asn225 230 235 240Pro Ala Val His Glu Lys Leu Lys Lys245<210>7<211>660<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>在coq-3(qml88)中缺失2456bp<400>7atgatccctt cacgaagtgc cagaatcatc gcaaagctac aacgactaca ctcgactact 60tcagccgctt cagtatcttc tattgatgta aaagaggtaa aacatataaa aataagctat 120ttatctgtag aaaaattatt ttaggtcgaa aaattcggag acttgtctgc agaatgggct 180gatgaactgg gtcccttcca cgcacttcac tcattaaaca ggattcgagt tccttggatt 240gtcgataatg ttagaaaaag cgatcagaag gctcctcctc gattagtgga cgttggaagc 300ggagggggtc ttttgtcgat tccactggcc agaagtggat tcgatgttac aggaattgat 360gcgacgaagc aagctgtaag ggagattttc ccatttttct gggaatttat gcaaaatcag 420ctcttttctt ttttttttgg aaataaattt gaaaattttc agaatgtact caaaatcgtg 480ccgcccggag tccacgactg ggaaaaattc atcacacccg ccgagctcac ttcacatctc 540gaaaaagcgg gttgccgggt gacggcggtg catggattaa tgtttcatcc ggttggaaat 600cactggacat ggatcgaatc gactcagtgt aattacggaa ttttggcagt gaagaattag 660<210>8<211>807<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>coq-3(qml88)外显子4<400>8atgatccctt cacgaagtgc cagaatcatc gcaaagctac aacgactaca ctcgactact 60tcagccgctt cagtatcttc tattgatgta aaagaggtcg aaaaattcgg agacttgtct120gcagaatggg ctgatgaact gggtcccttc cacgcacttc actcattaaa caggattcga180gttccttgga ttgtcgataa tgttagaaaa agcgatcaga aggctcctcc tcgattagtg240gacgttggaa gcggaggggg tcttttgtcg attccactgg ccagaagtgg attcgatgtt300
acaggaattg atgcgacgaa gcaagctgta gaagctgcga atcagtccct cacagcgaaa360ccccttcaaa ttgccggaat ctcgaagcgc ctccggttcg agcataccag cgtcgaggat420ttctgtcaga agccacacaa taaatcggcc tacgatgcag tcgtcgcttc ggaaattgtc480gaacacgtcg ccgatcttcc cggattcatt ggctgcctcg ctgagctggc tcgccccggt540gccccgctct tcatcacaac tatcaacaga acgtggctga gcaaattggc agctatttgg600cttgcagaga atgtactcaa aatcgtgccg cccggagtcc acgactggga aaaattcatc660acacccgccg agctcacttc acatctcgaa aaagcgggtt gccgggtgac ggcggtgcat720ggattaatgt ttcatccggt tggaaatcac tggacatgga tcgaatcgac tcagtgtaat780tacggaattt tggcagtgaa gaattag807<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SHP 1772<400>9ctgatttctt ccagagctct cttgccgcac 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SHP 1773<400>10agcattcccg agatgatgca ctccttgagg 30<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SHP 1774<400>11tagcgactct cagcgacaag cttaacc 27<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SHP 1775<400>12gaggccggtt ccgagacgat ggcatcg 27<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SHP 1840<400>13cctcctcgcg cactacacac catc24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SHP 1865<400>14cgaagcgacg actgcatcgt aggc24<210>15<211>10597<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>小家鼠野生型mclk-1基因座<222>(1)...(60)<223>n＝任何碱基<400>15nttaggntcc cggcnggggg tttcgggggn attcaaaccc aggttcttta acagggngca 60gggaatgttt ttcaacttct gagctctctc tagctctaat tttttaaaca ctttacttcc120aaaaatttcc agtaataact aggacataca cctcaacatt cttttatctc tttaggacag180atctagaagt ggaatgcacg ggaaaggttc tgaacatttg aaggctttga gagccagatt240taggctgagt attccacagg aatatttaag taccctcact gccgctaagg cccagtactt300gggctcgtct taattttaag ttactgtagt atactaactt gaacactata attatataga360atgggttagt agtttcattt attttacagt agctatgaat caaatacata cccccccgcc420aagggtgcaa actctagttt tcctaaagcc acagtctcta gtgatcctat aataggcact480gattatgcct tgcaggtatg gtttttcccc ttatatactt atctgacttg gaaattttat540ttctattggc tagatctagc tgtcatatta atggatatgc actttaaaat gtttaatgta600tgctactaaa ttttccttcc ctcaacacac agctatgttc atcactaatg tgccctaggc660
catgaataat ccagtaaagg atgaacaatg aagcaaatct caatataaaa attgagaagg 720aacggaaagt aacgggaaac aaactgggaa acccacaatt acaccgaaaa ctggcatgtt 780ttaccaggta attgctgact ttcaggtgta aatcggctct taatagagaa aaataatctc 840cgtaacgtgg aggaaacagt gacctgcggg tcgcctttcc aagacaggga gaaaccctaa 900cctaaactgc ctctccagga cagctctgca tcaaccctaa gagccgaccg ggcgccttca 960ctacgttcca atgatcgaca gggggcagac caaatagagt acgtgaattg gtcatttcta1020accaatcggg tttaatccag ggcctagggg cgtttcctct ggctctcggt ccgcggcatc1080tatgcgtcat caccctgagt cgagagcacg attggcgggg cgtttggacc atagctgcat1140tgtccgcagc gatgagcgcc gccggagcca tagcggctgc ttccgtggga cgcctgcgca1200ctggtgtccg gaggcccttc tcaggtaccg gccgctcggg gtcgtggttc ggcgcggggt1260tcttcgctgg tgactatttg cagtggaggt cacggatgtc acggggagga cgtctatacg1320tcacaagcgc gcgacatggg ggtggggttt gtagtacgtc tagttgattg acaggaatgg1380gtgaacttct gcaggatgcc ctgccggggg aacaagtgat taccagcctg tgatgtgacg1440tcagtgcaag gcacatcaca gtgcaacttg agtgtcctgc agtgtccctc cggtctccac1500tcgggacttt ctcaagcaaa gtagccttcc gacgacagca tcaatctgtt ataaatgcag1560attttcgggt ccccctcatt atccactgga ttgataggtt ttagagtttt aaaaagtgtg1620tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgcgcgcgcg cgtgcgtgcg1680cacaataatt aaattctaga gaggccagaa ttggggtttg aatctgcaac tagagtaaca1740ggcagtttgt gaatccctat atatgggtgc tgggagccca actcaagtca tttgcaagtg1800cagtacacat tcttaactgc tgagccttct tttgagccgt agagtctctg tttttatcaa1860gcctctcatg ggactgtttg tattgcaaaa tatggtaagc tttgaatttg gaatggagag1920aggtaggttt ggattcaggt ctgattcatc cgagctgccc cagaaaatcg tggtcatttt1980cttgaaacta aatcttcaag cattagattt ctattttgcc tgaaggcaat attgtttgga2040ggtttgagat gtgtttttgt ttaactacaa cttattaagt aatttaattg aaactacatc2100cttttggtaa ataataagcc agaattgcct gcccccaaat ggatgagtaa tcaccccccc2160cacacacaca caccaccacc accaccacca ccaccaccaa taccttgaga acagctatga2220aacttcatta gatattgttg tgtgtgcctt ccaaggcttg agtccaaggc tgtttttctt2280tctggaagag aagartgctt agcaagtgtt tggatattat tcaagacatg ccagttatag2340agatgtttcc cttggtgata atgattcaga agagactttt taagagcctc ttagtatgta2400atttatgtgt ccataagcca cttaaaatct tctcatttgc cacttaaaat ctcccagata2460ccatggctgg aacagcacgc ttgagagctt ctagctctgc gattcagctt tattttaaag2520tgtgtaacaa ggcagtcagg tctcagggat gtggatttta aggttccttg ctaacccagt2580gaacaggtta acaataagaa tcacttgttt tcatttatga agtaacttag tttcctttgt2640ttcatatacc ctcatgataa taataataat aaaaaaccct taagtgtgtg tctccttaaa2700aaaataaaac tagccttgct actgggtagg ttttaatttg gttttgagac agcctctagc2760gctggctgac ctggaccttg cttgttcacc aggatatcct tcaattcaca gagctctgcc2820aactcatgct gggattaata cctatactga tttcttaggt aaaaggacaa atactaccct2880ctcccagtca ttgagtgcag aagttgtgtt ttagagaaca ttccagtgtg ttctcagtta2940taaagaatcc tgtttatcac acctcaaaag ccagccatat aaacttggcc cacctgctca3000gctccttgtt attcttcttt taaaaaaaag atttatttta tatatgtgaa cacactgtag3060ctgtcttcag acacaccaga agagggaatc agatcccatt acaaatggtc ctgagccacc3120atgtagttgc tgggaattga cctcaggacc tctggaagag cagtcagtgc ttttaaccgc3180tgagccacct ccccaggccc cttgttattc cttaatatac tttttaaaaa ggagtactgg3240gttgccttga actttctttg ctaaaaagta agagcacaag caaacaagat tgtgttgaga3300aatacaactg gctcaccaag tctgtctcca gaccctgctt tctgcaagga gacaagctgg3360ccagaagcat aagcccttga acttggacac agaaatgcaa caagttcctg attgtgtccc3420atcactgtcc cataaaatat gggcctcaaa ccgtagagcc ccactgtctg aagacagttt3480ggaatggttg gtgtcttaca ctcggcagga gagctgaggt gccgtgtctg ctccacagac3540
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<221>小家鼠突变敲除的mclk-1等位基因<222>(1)...(60)<223>n＝任何碱基<400>16nttaggntcc cggcnggggg tttcgggggn attcaaaccc aggttcttta acagggngca 60gggaatgttt ttcaacttct gagctctctc tagctctaat tttttaaaca ctttacttcc120aaaaatttcc agtaataact aggacataca cctcaacatt cttttatctc tttaggacag180atctagaagt ggaatgcacg ggaaaggttc tgaacatttg aaggctttga gagccagatt240taggctgagt attccacagg aatatttaag taccctcact gccgctaagg cccagtactt300gggctcgtct taattttaag ttactgtagt atactaactt gaacactata attatataga360atgggttagt agtttcattt attttacagt agctatgaat caaatacata cccccccgcc420aagggtgcaa actctagttt tcctaaagcc acagtctcta gtgatcctat aataggcact480gattatgcct tgcaggtatg gtttttcccc ttatatactt atctgacttg gaaattttat540ttctattggc tagatctagc tgtcatatta atggatatgc actttaaaat gtttaatgta600tgctactaaa ttttccttcc ctcaacacac agctatgttc atcactaatg tgccctaggc660catgaataat ccagtaaagg atgaacaatg aagcaaatct caatataaaa attgagaagg720aacggaaagt aacgggaaac aaactgggaa acccacaatt acaccgaaaa ctggcatgtt780ttaccaggta attgctgact ttcaggtgta aatcggctct taatagagaa aaataatctc840cgtaacgtgg aggaaacagt gacctgcggg tcgcctttcc aagacaggga gaaaccctaa900
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<221>mclk-1 flox等位基因
<222>(1)...(60)<223>n＝任何碱基<400>21nttaggntcc cggcnggggg tttcgggggn attcaaaccc aggttcttta acagggngca 60gggaatgttt ttcaacttct gagctctctc tagctctaat tttttaaaca ctttacttcc 120aaaaatttcc agtaataact aggacataca cctcaacatt cttttatctc tttaggacag 180atctagaagt ggaatgcacg ggaaaggttc tgaacatttg aaggctttga gagccagatt 240taggctgagt attccacagg aatatttaag taccctcact gccgctaagg cccagtactt 300gggctcgtct taattttaag ttactgtagt atactaactt gaacactata attatataga 360atgggttagt agtttcattt attttacagt agctatgaat caaatacata cccccccgcc 420aagggtgcaa actctagttt tcctaaagcc acagtctcta gtgatcctat aataggcact 480gattatgcct tgcaggtatg gtttttcccc ttatatactt atctgacttg gaaattttat 540ttctattggc tagatctagc tgtcatatta atggatatgc actttaaaat gtttaatgta 600tgctactaaa ttttccttcc ctcaacacac agctatgttc atcactaatg tgccctaggc 660catgaataat ccagtaaagg atgaacaatg aagcaaatct caatataaaa attgagaagg 720aacggaaagt aacgggaaac aaactgggaa acccacaatt acaccgaaaa ctggcatgtt 780ttaccaggta attgctgact ttcaggtgta aatcggctct taatagagaa aaataatctc 840cgtaacgtgg aggaaacagt gacctgcggg tcgcctttcc aagacaggga gaaaccctaa 900cctaaactgc ctctccagga cagctctgca tcaaccctaa gagccgaccg ggcgccttca 960ctacgttcca atgatcgaca gggggcagac caaatagagt acgtgaattg gtcatttcta1020accaatcggg tttaatccag ggcctagggg cgtttcctct ggctctcggt ccgcggcatc1080tatgcgtcat caccctgagt cgagagcacg attggcgggg cgtttggacc atagctgcat1140tgtccgcagc gatgagcgcc gccggagcca tagcggctgc ttccgtggga cgcctgcgca1200ctggtgtccg gaggcccttc tcaggtaccg gccgctcggg gtcgtggttc ggcgcggggt1260tcttcgctgg tgactatttg cagtggaggt cacggatgtc acggggagga cgtctatacg1320tcacaagcgc gcgacatggg ggtggggttt gtagtacgtc tagttgattg acaggaatgg1380gtgaacttct gcaggatgcc ctgccggggg aacaagtgat taccagcctg tgatgtgacg1440tcagtgcaag gcacatcaca gtgcaacttg agtgtcctgc agtgtccctc cggtctccac1500tcgggacttt ctcaagcaaa gtagccttcc gacgacagca tcaatctgtt ataaatgcag1560attttcgggt ccccctcatt atccactgga ttgataggtt ttagagtttt aaaaagtgtg1620tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgcgcgcgcg cgtgcgtgcg1680cacaataatt aaattctaga gaggccagaa ttggggtttg aatctgcaac tagagtaaca1740ggcagtttgt gaatccctat atatgggtgc tgggagccca actcaagtca tttgcaagtg1800cagtacacat tcttaactgc tgagccttct tttgagccgt agagtctctg tttttatcaa1860gcctctcatg ggactgtttg tattgcaaaa tatggtaagc tttgaatttg gaatggagag1920aggtaggttt ggattcaggt ctgattcatc cgagctgccc cagaaaatcg tggtcatttt1980cttgaaacta aatcttcaag cattagattt ctattttgcc tgaaggcaat attgtttgga2040ggtttgagat gtgtttttgt ttaactacaa cttattaagt aatttaattg aaactacatc2100cttttggtaa ataataagcc agaattgcct gcccccaaat ggatgagtaa tcaccccccc2160cacacacaca caccaccacc accaccacca ccaccaccaa taccttgaga acagctatga2220aacttcatta gatattgttg tgtgtgcctt ccaaggcttg agtccaaggc tgtttttctt2280tctggaagag aagartgctt agcaagtgtt tggatattat tcaagacatg ccagttatag2340agatgtttcc cttggtgata atgattcaga agagactttt taagagcctc ttagtatgta2400atttatgtgt ccataagcca cttaaaatct tctcatttgc cacttaaaat ctcccagata2460ccatggctgg aacagcacgc ttgagagctt ctagctctgc gattcagctt tattttaaag2520tgtgtaacaa ggcagtcagg tctcagggat gtggatttta aggttccttg ctaacccagt2580gaacaggtta acaataagaa tcacttgttt tcatttatga agtaacttag tttcctttgt2640ttcatatacc ctcatgataa taataataat aaaaaaccct taagtgtgtg tctccttaaa2700
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1.一种筛选使clk1纯合突变脊椎动物胚胎能够存活的化合物的方法，该方法包括以下步骤使杂合clk1个体杂交得到clk1纯合突变体胚胎，然后测定clk1纯合胚胎的生存力；其中在所述杂交之前用所述化合物处理至少一个所述杂合体。
2.权利要求1的方法，其中所述胚胎是小鼠。
3.权利要求1的方法，其中所述化合物适于部分或完全功能性代替内源性泛醌。
4.权利要求1的方法，其中所述化合物通过至少一种选自以下的途径应用口服、肌肉内、静脉内、腹膜内、皮下、局部、皮内和透皮给药途径。
5.一种筛选适于拯救mclk1纯合细胞系突变表型的化合物的方法，该方法包括以下步骤测定mclk1敲出细胞系的突变表型，其中在所述测定之前用所述化合物处理细胞系，并且其中所述表型水平表明某种化合物适于拯救所述突变表型。
6.一种适筛选于部分或完全功能性替代内源性泛醌的化合物的方法，该方法包含测定mclk1敲出纯合ES细胞系突变表型的步骤；其中在所述测定之前用所述化合物处理所述细胞系；并且其中所述表型水平表明某种化合物适于部分或完全功能性替代泛醌。
7.权利要求6的方法，其中所述表型是细胞呼吸和/或生长速率。
8.一种筛选适于部分或完全功能性替代受试者泛醌的化合物的方法，该方法包含评价至少一种选自以下的表型的步骤生存力、生育力和coq-3纯合突变蠕虫全部或部分缺乏突变表型；其中在所述评价之前用所述化合物处理所述蠕虫；并且其中所述至少一种选自以下的表型表明某种化合物适于部分或完全功能性替代所述受试者的泛醌生存力、生育力和全部或部分缺乏所述突变表型。
9.权利要求8的方法，其中所述化合物能达到所述受试者的线粒体。
10.一种筛选适于部分或完全功能性替代受试者的泛醌的化合物的方法，该方法包括评价至少一种选自生存力、生育力和生长在泛醌缺失型支持体上的clk-1纯合突变蠕虫全部或部分缺乏Clk-1表型的表型的步骤；其中在所述评价之前用所述化合物处理所述蠕虫；并且其中所述至少一种选自生存力、生育力和全部或部分缺乏所述Clk-1表型表明某种化合物适合部分或完全功能性替代所述受试者的泛醌。
11.权利要求10的方法，其中所述泛醌缺失型支持体是不产生泛醌的细菌。
12.权利要求10的方法，其中所述泛醌缺失型支持体是一种产生短于8个异戊二烯单元的侧链的泛醌的细菌。
13.权利要求10的方法，其中所述化合物至少能到达所述受试者需要泛醌的非线粒体部位。
14.权利要求10和13任一项的方法，其中所述细菌选自RKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496、KO229(pSN18)、KO229(Y37A/Y38A)、KO229(R321V)和KO229(Y37A/R321V)。
15.权利要求10、13和14任一项的方法，其中所述细菌在至少一个选自ubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiE、ubiF和ispB的基因上存在突变。
16.权利要求10、13-15任一项的方法，其中所述细菌携带至少一种选自pSN18、Y37A/Y38A、R321V、Y37A/R321V的质粒。
17.权利要求10-16任一项的方法，其中所述功能性代替泛醌是指泛醌作为CLK-1辅助因子的功能。
18.一种筛选能抑制受试者clk-1活性和/或需要由脱甲氧泛醌制造泛醌的其它过程的化合物的方法，该方法包含测定至少一种选自以下的表型的步骤生长、生育力以及在泛醌缺失型支持体上的野生型蠕虫完全或部分缺乏Clk-1表型；其中在所述测定之前用所述化合物处理所述蠕虫；并且其中至少一种选自完全或部分缺乏生长、缺乏生育力以及完全或部分缺乏所述Clk-1表型的表型表明某种化合物能抑制受试者clk-1活性和/或需要由脱甲氧泛醌制造泛醌的其它过程。
19.权利要求18的方法，其中所述泛醌缺失型支持体是一种不产生泛醌的细菌。
20.权利要求18的方法，其中所述泛醌缺失型支持体是一种产生短于8个异戊二烯单元的侧链的泛醌的细菌。
21.权利要求18的方法，其中所述细菌选自RKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496。
22.权利要求18的任何一种方法，其中所述细菌在至少一个选自ubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiE和ubiF的基因上存在突变。
23.权利要求18和22任一项的方法，其中所述细菌携带至少一种选自pSN18、Y37A/Y38A、R321V、Y37A/R321V的质粒。
24.一种筛选适于完全或部分功能性代替泛醌的化合物的方法，该方法包含测定受试者突变表型的步骤，所述受试者缺失mclk1和/或缺失已知的泛醌生物合成酶基因和/或缺失当改变时导致泛醌缺乏或减少的任何其它基因；其中在所述测定前用所述化合物处理所述受试者；并且其中所述表型水平表明某种化合物适于完全或部分功能性代替泛醌。
25.权利要求24的方法，其中所述受试者是小鼠、ES细胞系或缺失mclk1或缺失编码已知的泛醌生物合成酶基因的任何基因和/或缺失当改变时导致泛醌缺乏或减少的任何其它基因的任何细胞系。
26.一种不能产生泛醌并包含基因敲出性mclk1的小鼠；其中所述小鼠表现出泛醌缺乏和脱甲氧泛醌存在的相关表型。
27.一种包含改变的mclk1的DNA构建物，其中所述DNA构建物可用于产生权利要求26的mclk1敲出品系小鼠。
28.一种不能产生泛醌并包含基因敲出性mclk1的ES细胞系，其中所述ES细胞系表现出泛醌缺乏和脱甲氧泛醌存在的相关表型。
29.一种不能产生泛醌的coq-3突变体对象，其中突变是coq-3缺失或泛醌生物合成酶缺失和/或当改变导致泛醌缺乏或减少的任何其它基因的缺失。
30.权利要求29的突变体，其中所述对象是一种蠕虫。
31.权利要求30的突变体，其中所述突变体选自用选自SHP172、SHP1773、SHP174、SHP1775、SHP1840和SHP1865的PCR引物鉴定的蠕虫。
32.一种筛选适于完全或部分功能性代替泛醌或脱甲氧泛醌的化合物的方法，该方法包含测定受试者突变表型的步骤，所述所试者体内的泛醌生物合成酶基因发生了改变和/或改变时导致泛醌或脱甲氧泛醌的缺乏或减少的任何其它基因发生了改变；其中在所述测定前用所述化合物处理所述受试者；并且其中表型水平表明某种化合物适于完全或部分功能性代替泛醌或脱甲氧泛醌。
33.权利要求32的方法，其中所述受试者是一种蠕虫。
34.一种减少和/或增加多细胞对象的泛醌水平的方法，该方法包含对所述对象的coq-3进行打靶的步骤。
35.一种筛选clk-1的遗传抑制基因的方法，该方法包含测定至少一种选自生存力、生育力以及在泛醌缺失型支持体上生长的clk-1突变蠕虫完全或部分缺乏Clk-1突变表型的表型的步骤；其中在所述测定之前所述蠕虫携带有所述遗传抑制基因；并且其中所述至少一种选自生存力、生育力以及完全或部分缺乏所述Clk-1突变表型的表型表明存在clk-1的遗传抑制基因。
36.权利要求35的任何一种方法，其中所述细菌选自RKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496、KO229(pSN18)、KO229(Y37A/Y38A)、KO229(R321V)和KO229(Y37A/R321V)。
37.权利要求35任一种方法，其中所述细菌在至少一个选自ubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiE、ubiF和ispB的基因上存在突变。
38.权利要求35任一种方法，其中所述细菌携带至少一种选自pSN18、Y37A/Y38A、R321V和Y37A/R321V的质粒。
39.一种筛选coq-3的遗传抑制基因的方法，该方法包含测定至少一种选自生存力、生育力以及完全或部分缺乏coq-3突变蠕虫突变表型的表型的步骤；其中在所述测定之前所述蠕虫携带有所述遗传抑制基因；并且其中所述至少一种选自生存力、生育力以及完全或部分缺乏所述突变表型的表型表明存在coq-3的遗传抑制基因。
40.一种筛选适于完全或部分功能性代替泛醌的化合物的方法，该方法包含测定受试者突变表型的步骤，所受试者仅在部分细胞和/或生活周期某几个时期缺失mclk1，其中在所述测定前用所述化合物处理所述受试者；并且其中所述表型水平表明某种化合物适于完全或部分功能性代替泛醌。
41.权利要求1-25、32和35-40任一项方法，其中所述化合物可用于治疗选自以下的疾病活性氧物质(ROS)介导性疾病、糖尿病、缺氧/再氧化损伤、帕金森氏病、动脉硬化症和阿耳茨海默氏病。
全文摘要
本发明涉及一种筛选使clk1纯合型突变体胚胎存活的化合物的方法；一种筛选适于拯救mclk1纯合型细胞系的突变表型的化合物的方法；一种筛选适于部分或完全功能性替代内源性泛醌的化合物的方法；一种筛选能抑制clk－1活性和/或需要用脱甲氧泛醌制造泛醌的其它过程的化合物的方法；一种不产生泛醌的小鼠；包含改变的mclk1的DNA构建物；一种不产生泛醌的ES细胞系；一种不产生泛醌的coq－3突变体；一种筛选适于完全或部分功能性代替泛醌或脱甲氧泛醌的化合物的方法；一种减少和/或增加多细胞研究对象中泛醌水平的方法；一种筛选clk－1的遗传抑制基因的方法；以及一种coq－3的遗传抑制基因的筛选方法。
文档编号A01K67/033GK1564944SQ02819741
公开日2005年1月12日 申请日期2002年8月7日 优先权日2001年8月7日
发明者S·赫基米, A·希希, F·勒瓦瓦瑟, E·索布里奇, Y·高, M·帕奎特, C·贝纳 申请人:麦克吉尔大学, 克隆诺根公司