专利名称：切花百合组培种苗一次成苗的方法
技术领域：
本发明涉及切花百合组培种苗快繁培养方法，属于植物的组织培养技术领域。
背景技术：
百合是百合科百合属多年生草本鳞茎植物，是世界著名的观赏花卉。近年来，随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，百合已成为我国花卉市场中的重要高档切花种类。关于百合的组织培养，国内外不少研究者开展了大量的工作。据不完全统计，国内外组织培养成功的百合种及品种超过几百种，但均局限于对组培技术中某个环节(如外植体部位，培养基成分，培养条件，种质保存等)的研究，未系统地进行切花百合种苗组培技术研究及规模化生产。光独立(Photoautotrophic)培养，即无糖箱式组培技术的发明主要是解决植物组培快繁阶段的环境调控问题，所以在光独立培养操作中，主要强调培养容器、培养基质、培养操作器具、通入的气体、培养外界环境的无菌要求等等，而且其操作规程较为繁琐，不易于种苗的规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能简化组培种苗的培养程序，并通过培养环境的控制，便于规模化生产优质切花百合组培种苗的一次成苗方法。
本发明所述切花百合组培种苗快繁培养方法的步骤是1、取材及灭菌将准备接种的鳞茎在4～5℃温度下处理6～8周，清洗，剥去鳞茎外皮及外部2～3层鳞片，用75％的酒精浸泡30～60秒，然后在0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中处理15～20分钟，1～2％的次氯酸钠溶液中处理10～15分钟，无菌水洗3～4次后，进行切块或段接种；2、诱导培养在无菌条件下，将处理好的外植体切块或段接种到下列诱导培养基中培养20～25天，使切口产生白色的愈伤组织及小鳞茎突起即不定芽
MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 10～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 5500mg/L3、增殖培养在无菌条件下，将上述诱导出的愈伤组织及不定芽分切后转入下列增殖培养基中，在温度为26±2℃，光照时间10～12小时/天，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养15～20天，使小鳞茎增殖，并抽出叶片，成为幼苗MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.2～0.5mg/L蔗糖30000mg/L琼脂5500mg/L4、光独立生根培养在常规室温下，将增殖培养20天，具1对叶以上，高2.0cm的幼芽切下，插入下列培养基中MS改良培养液萘乙酸(NAA) 0～0.1mg/L蛭石∶培养液 2～3∶1通入气流量为1-5L/min的CO2混合气体，并保持CO2浓度在600～1000ppm，相对湿度80-90％，进行光独立生根培养，培养20天后可得切花百合种苗。
由于本发明的难点之一是在不同的培养阶段，使用不同的培养基及不同的培养方法，因此，各培养基的配方是极其关键的技术，否则难于加快组织培养过程，也难于获得优质种苗。
本发明所述各阶段的培养基是快繁培养阶段使用现有技术中的MS培养液；生根阶段使用不添加有机物和维生素的MS改良培养液；外植体诱导愈伤组织及不定芽阶段使用的培养基为(单位mg/L)MS+(1.0～2.0)6-苄基氨基嘌呤+(0.1～0.5)萘乙酸+30000蔗糖+5500琼脂；不定芽分化及增殖阶段使用的培养基为(单位mg/L)MS+(0.5～1.0)6-苄基氨基嘌呤+(0.2～0.5)萘乙酸+30000蔗糖+5500琼脂；单株生根培养阶段使用的培养基为(单位mg/L)改良MS培养液+(0～0.1)萘乙酸+蛭石(2～3倍)。
由于本发明的难点之二是如何在解决切花百合组培快繁的基础上，简化组培种苗的培养程序，从而为规模化生产奠定坚实的基础。其关键是在种苗的生根阶段采用光独立培养方法，并通过培养环境调控，即控制CO2混合气体浓度、通气时间、光照强度，使培养出来的生根苗不需移栽，直接在室外过渡管理后即可一次成苗。所述光独立培养的步骤是①种苗进入光独立培养的0～5天，保持相对湿度在95％以上；②6～10天开始通入气流量1L/min的CO2混合气体，CO2浓度保持在600～800ppm，相对湿度85-90％；③11～15天，气流量加至3L/min，CO2浓度保持在800～1000ppm，相对湿度在80-85％；④出苗前期，空气流量可调至3～5L/min，20天后出室外继续培养，20～30天后成苗；培养期间光照强度2000～2500Lx(两只日光灯)，每天光照12小时，培养室温度保持20±2℃。
本发明具有下列优点和效果通过对切花百合外植体处理以及提供适宜的诱导及增殖培养基，优化了百合组培快繁技术，并在种苗的生根阶段采用光独立培养技术，简化了组培种苗的培养程序及操作，组培无根苗的切取无需在超净工作环境中进行，通过对现有方法中的CO2混合气体浓度、通气时间、光照强度等关键因素的控制，使培养出的生根苗不需移栽，直接在室外过渡管理后即可一次成苗，在节约成本的前提下，产出的种苗健壮、整齐、品质好，达到优质种苗的标准，适于花卉种苗的规模化生产。
实施例1优选生长健壮、开花性状好的东方百合杂种系(Oriental hybrids)品种“Siberia”、“Sorbonne”的种球作为外植体，在取材前，将准备接种的鳞茎在4～5℃的低温下处理6周，然后经洗衣粉水清洗，剥去鳞茎外皮及外部3层鳞片，切去少许顶部及基部，剥成带部分基盘的单个鳞片，用75％的酒精浸泡60秒，然后在0.1％升汞溶液中处理15分钟，2％的次氯酸钠溶液处理10分钟，无菌水洗3次，进行无菌操作切块接种；2、诱导培养在无菌条件下，将处理好的外植体切块(段)接种到下列诱导培养基中培养20天，使切口产生白色的愈伤组织及小鳞茎突起(不定芽)MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤 1.0mg/L萘乙酸 0.5mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 5500mg/L3、增殖培养在无菌条件下，将上述诱导出的愈伤组织及不定芽分切后转入下列增殖培养基中，在温度为26±2℃，光照时间12小时/天，光照强度1500Lx的条件下，培养20天，使小鳞茎增殖，并抽出叶片，成为幼苗MS基本培养液(同上)6-苄基氨基嘌呤 0.5mg/L萘乙酸 0.5mg/L蔗糖30000mg/L琼脂5500mg/L上述2、3步骤中培养基的制作是将培养基各成分混匀后再进行分装、不透气膜封口，经110～125℃，8～12分钟高压灭菌，取出后在洁净的房间内冷却待用；4、光独立生根培养在常规室温下，将增殖培养20天，具1对叶以上，高2cm左右的幼芽切下，插入下列培养基中MS改良培养液萘乙酸 0.1mg/L蛭石∶溶液＝3∶1培养基中的培养液和蛭石需分别灭菌，将培养液分装到玻璃瓶中，封口，经125℃，10分钟高压灭菌，冷却待用；蛭石喷水后分装，包扎封口后经110℃，20分钟高压灭菌，冷却待用。在使用时，将培养液与蛭石以1∶3的比例混匀，铺在育苗盘中，厚度3～4cm；光独立培养过程是①种苗进入光独立培养的当天计为0天；②0～5天，培养箱内不通气，相对湿度保持在95％以上；③6～10天开始通入气流量1L/min的CO2混合气体，CO2浓度保持在600～800ppm，相对湿度85-90％；④培养11～15天，气流量3L/min，CO2浓度可在800～1000ppm保持不变，相对湿度在80-85％；⑤出苗前期在其它条件不变的情况下，空气流量可调至3～5L/min，20天后可出室外继续培养，不需移栽，20～30天后可成苗。
整个光独立培养均在箱式容器内进行，培养基质为蛭石，不加糖，培养期间光照强度2000～2500Lx(两只日光灯)；12小时/天光照；为保证光照的均匀，每天交错开日光灯；整个培养期间培养室温度保持20±2℃(培养箱内为26±2℃)；混和气体消毒柱采用优氯净作为消毒水，需10～20天更换一次，浓度1/150～250；每出一批苗后，需用浓度为1/150～250的消毒水对培养箱进行清洗；⑩随时保持培养室内的清洁。
切花百合经光独立培养10天左右便可生根。培养20天后移到温室大棚中继续培养，不需移栽。前期注意保持湿度，20～30天后可成苗，进行大田移栽。
实施例2优选生长健壮、开花性戕好的亚洲百合杂种系(Asiatic hybrids)品种“Toro”、“Elle”的种球作为外植体，在取材前，然后经洗衣粉水切去少许顶部及基部，将准备接种的鳞茎在4～5℃的低温下处理8周，清洗，剥去鳞茎外皮及外部2层鳞片，用75％的酒精浸泡30秒，然后在0.1％的汞溶液中处理20分钟，2％的次氯酸钠溶液中处理15分钟，无菌水洗4次后，进行切块(段)接种；2、诱导培养在无菌条件下，将处理好的外植体切块(段)接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中培养25天，使切口产生白色的愈伤组织及小鳞茎突起(不定芽)；MS基本培养液(同上)6-苄基氨基嘌呤 2.0mg/L萘乙酸 0.1mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 5500mg/L3、增殖培养在无菌条件下，将上述诱导出的愈伤组织及不定芽分切后转入单位为mg/L的下列增殖培养基中，在温度为26±2℃，光照时间10小时/天，光照强度2000Lx的条件下，培养15天，使小鳞茎增殖，并抽出叶片，成为幼苗MS基本培养液(同上)6-苄基氨基嘌呤 1.0mg/L萘乙酸 0.2mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 5500mg/L上述2、3步骤中培养基的制作是将培养基各成分混匀后再进行分装、不透气膜封口，经110℃，12分钟高压灭菌，取出后在洁净的房间内冷却待用；4、光独立生根培养在常规室温下，将增殖培养20天，具1对叶以上，高2cm左右的幼芽切下，插入下列培养基中MS改良培养液(同上)蛭石∶溶液＝2∶1培养基中的培养液和蛭石需分别灭菌，将培养液分装到玻璃瓶中，封口，经125℃，10分钟高压灭菌，冷却待用；蛭石喷水后分装，包扎封口后经110℃，20分钟高压灭菌，冷却待用。在使用时，将培养液与蛭石以1∶2的比例混匀，铺在育苗盘中，厚度3～4cm；光独立培养过程及使用的培养容器、培养条件、培养出来的种苗处理等均与实施例1相同。
MS基本培养液成分见下表
MS改良培养液成分见下表
本发明经试验研究，其结果报告如下一、组培快繁技术1.供试材料东方百合杂种系(Oriental hybrids)品种“Siberia”、“Sorbonne”；亚洲百合杂种系(Asiatic hybrids)品种“Toro”、“Elle”；2.试验方法同实施例1；3.试验结果3.1不同激素配比对外植体诱导愈伤组织及不定芽形态发生的影响在供试的6个培养基配比处理中，总体诱导率在70％以上。从表1可见，BA浓度高时诱导愈伤组织的效果好，NAA与BA的浓度比例相当时，有利于不定芽的产生。从总体上来看，在愈伤组织的诱导上处理2的诱导频率最高，达到87.5％，其次为处理4，诱导频率为73.7％；在不定芽的诱导上，处理1的诱导频率最高，为82.4％；NAA浓度较高时(0.5mg/L)及BA浓度较低时有少量根的再生(11.8％)。
表1 不同激素配比对诱导率及形态发生的影响
表2 不同激素浓度对不定芽增殖和分化的影响
3.2愈伤组织和不定芽的增殖与分化，愈伤组织及不定芽在不同浓度培养基中的生长情况见表2(供试材料为亚洲百合“Toro”)。
表3 光独立培养环境控制因子对切花百合培养效果的影响
(注种苗质量评价依照百合组培苗出瓶标准(内定)++++为好；+++为良；++为中；+为差)
从表3可见，最适宜不定芽增殖及正常分化的培养基配比为BA0.5～1.0mg/L+NAA0.2～0.5mg/L，激素的适用范围较宽。但在规模化生产中，主要以种苗的质量为追求目标，要求种苗的低(无)变异性。较高浓度的BA可以提高增殖系数，但不定芽的分化呈丛生状态，生长多不正常，因此在不同的生产阶段，宜适当控制激素的浓度，在保证增殖率的同时保证种苗的质量。
二、光独立生根培养1.供试材料增殖培养20天的百合增殖瓶苗，具1对叶以上，高2cm左右的无根单株，品种为东方百合品种“Siberia”和“Sorbonne”。
2.方法在常规工作室内(无需超净工作台)将供试材料插入育苗盘，对以下几个培养因子进行试验研究(1)培养基MS大量元素+NAA0；MS大量元素+NAA0.1mg/L；MS大量元素+NAA0.5mg/L；pH均为5.8。(2)通气初始时间第3天；第6天；第9天。每天通气时间与光照时间同步。(3)CO2浓度600-800mg/L；800-1000mg/L；1100-1500mg/L。均在箱式容器内培养；培养基质蛭石，不加糖；整个培养期间室内温度20±2℃，光照12小时/天，光照条件2000-2500Lx(两只日光灯)。
对照培养基MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖3％+琼脂0.6％，pH5.8；培养瓶内培养，培养室温度25±2℃，光照12小时/天，光照强度2000Lx(两只日光灯)；每处理100株。观察不同处理方法材料的生长情况，20天后统计植株平均根数，平均根长，大于2cm的平均叶片数，平均生根率。
3.试验结果3.1光独立培养中培养基NAA浓度对植株生长的影响百合在培养基质中8天开始有根的萌发，植株挺立，长势健壮。从表3可见，培养基质中一定浓度的NAA对百合的生根有促进作用。在适宜的条件下，生根率达90％以上。当NAA浓度为0.1mg/L时，生根率最高，达97％，且根系正常；当NAA浓度为0.5mg/L时，生根率略低，但平均生根数和根系长度两项指标均比浓度为0.1mg/L时略高。在组培种苗的生产中，小植株的生根率是较为重要的因素，而且激素浓度的使用提倡在保证种苗质量的前提下采用较低浓度，所以培养基质中的NAA保持在0.1mg/L是较为适宜的。
3.2光独立培养中通气初始时间对植株生长的影响百合无根苗进入光独立培养系统当天计为第0天。由于培养基质中不加常规组培中作为植株异养生长碳源的糖，植株依靠培养箱中的CO2混合气体进行自养生长，所以在照明开始后，培养箱内的CO2浓度迅速下降，初始的通气时间即CO2气体的补给时间，直接影响植株的生长。初始的通气时间同时关系到培养箱中的湿度控制，是光独立培养中较为关键的控制因子。从表3可见，最佳的初始通气时间为培养的第6天。较早通气(第0或第3天)的培养箱，小植株在培养后期普遍出现叶片发黄，植株生根率低等现象，培养的种苗基本无商品价值。这可能是因为初栽的小植株长势较弱，进行光合作用的能力不强，较高的CO2浓度造成植株的生理代谢异常。同时气体流动导致培养箱内的湿度不易保持，小植株在培养过程中容易萎焉；通气时间较晚(第9天)的培养箱，小植株的各项观察指标均较低，植株生长缓慢，种苗质量明显较差。这可能与CO2混合气体的补给不及时，小植株的光合成受到抑制有关。
3.3光独立培养中CO2浓度对植株生长的影响CO2浓度对小植株的生根及生长有一定的影响。在保证适宜初始通气时间的前提下，800-1000mg/L浓度的CO2最适于植株的生根及正常生长，在不同处理中，其生根率及种苗状况均优于其它浓度的处理。较高浓度的CO2可能会促进植株的光合作用，提高种苗的质量，但试验结果表明，较高浓度的CO2并未取得预想的较好效果。这可能是因为，在同一个光独立培养系统中，人工补加的CO2气体通过强制性通气系统进入箱式容器内，其浓度由限制钢瓶CO2气体流速及各层的流量计来调控，在加大CO2浓度的同时也加大了通气量，在培养初期降低了培养箱内的湿度，影响了小植株的生长。另外，过高的CO2浓度(超过1100mg/L)，超过了小植株生长的CO2饱和点，可能引起细胞原生质中毒，或迫使植物叶片的气孔关闭，一定程度上抑制了光合作用。在利用光独立培养技术进行百合组培种苗生产时，800-1000mg/L浓度的CO2已可满足组培小植株正常生长光合作用的需求。
三、光独立生根培养与常规生根培养成苗率的比较从表4可见，与传统培养方法比较，光独立培养的种苗生根率达到95％以上，且根系发达呈白色，对照植株根系生长相对缓慢，根短且呈黄黑色；植株健壮，过渡成活率达92.7％，较对照的成活率75.3％提高了17.4％；生根苗质量显著优于常规组培生根苗。由于减少了由高温、弱光等引起的组培种苗生理及形态异常，并减少了植株生长调节剂的使用，植株基本无畸形、变异等情况发生，植株生长速度快，生长发育均匀，在工厂化组培种苗的生产中可以减化或省略驯化过程，一次性成苗，提高了种苗质量，更易于大田种植的驯化。在生产成本上具有明显的优势。
表4 常规与无糖组培苗成苗率的比较内容常规组培技术 无糖组培技术种苗生根率(％) 86 96一级过渡成活率(％) 83.4 一次成苗二级过渡成活率(％) 90.3最终成活率(％) 75.3 92.权利要求
1.一种切花百合组培种苗一次成苗的方法，其特征在于它采用下列步骤A、取材及灭菌将准备接种的鳞茎在4～5℃温度下处理6～8周，清洗，剥去鳞茎外皮及外部2～3层鳞片，用75％的酒精浸泡30～60秒，然后在0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中处理15～20分钟，1～2％的次氯酸钠溶液中处理10～15分钟，无菌水洗3～4次后，进行切块或段接种B、诱导培养在无菌条件下，将处理好的外植体切块或段接种到下列诱导培养基中培养20～25天，使切口产生白色的愈伤组织及小鳞茎突起即不定芽MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)10～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L蔗糖30000mg/L琼脂5500mg/LC、增殖培养在无菌条件下，将上述诱导出的愈伤组织及不定芽分切后转入下列增殖培养基中，在温度为26±2℃，光照时间10～12小时/天，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养15～20天，使小鳞茎增殖，并抽出叶片，成为幼苗MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5～1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.2～0.5mg/L蔗糖30000mg/L琼脂5500mg/LD、光独立生根培养在常规室温下，将增殖培养20天，具1对叶以上，高2.0cm的幼芽切下，插入下列培养基中MS改良培养液萘乙酸(NAA) 0～0.1mg/L蛭石∶培养液 2～3∶1通入气流量为1-5L/min的CO2混合气体，并保持CO2浓度在600～1000ppm，相对湿度80-90％，进行光独立生根培养，培养20天后可得切花百合种苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述光独立培养的步骤是①种苗进入光独立培养的0～5天，保持相对湿度在95％以上；②6～10天开始通入气流量1L/min的CO2混合气体，CO2浓度保持在600～800ppm，相对湿度85-90％；③11～15天，气流量加至3L/min，CO2浓度保持在800～1000ppm，相对湿度在80-85％；④出苗前期，空气流量可调至3～5L/min，20天后出室外继续培养，20～30天后成苗；培养期间光照强度2000～2500Lx(两只日光灯)，每天光照12小时，培养室温度保持20±2℃。
全文摘要
本发明提供一种切花百合组培种苗一次成苗的方法，它采用取材及灭菌、诱导培养、增殖培养、光独立生根培养的步骤，在相对应的各培养基中进行组培快繁增殖，用光独立培养技术对分切的单株进行生根培养。本发明能在培养过程中有效避免污染的发生，减少移苗次数，而且在工厂化组培种苗的生产中简化了组培技术的培养程序，一次成苗，成苗率高，同时由于生产的种苗在质进行组量及生产成本上具有明显的优势，在花卉种苗的规模化生产中具有广阔的应用前景。
文档编号A01H4/00GK1613297SQ200310110910
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月7日 优先权日2003年11月7日
发明者屈云慧, 熊丽, 吴丽芳, 杨春梅, 张素芳, 蒋亚莲 申请人:云南省农业科学院园艺作物研究所