专利名称：非洲蟛蜞菊的繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体地讲，是指一种采用组织培养技术对非洲蟛蜞菊离体培养进行快速繁殖的方法。
背景技术：
植物组织培养是指用植物的任何器官、组织或细胞，在人工控制条件下进行无菌培养生长发育的过程。该技术取材少，培养植物材料成本低，生长周期短，管理方便。利用植物组织培养这种快速繁殖技术，能在短时间内繁衍出大量保持母本生物特性和遗传性状的植株。据了解，我国快速繁殖的植物已有近千种。通常使用的基本培养基有数种，如MS、B5、White、N6等。在组织培养中，植物外植体要在植物生长物质的作用下，经过诱导脱分化、恢复细胞分裂的能力、影响再分化、促进器官形成等过程。植物外植体繁殖系数的大小，直接影响着生产后代植株的数量和质量。
非洲蟛蜞菊(Wedelia prostrata)，又名单花蟛蜞菊，别名貓舌菊、天蓬草舅、地錦花、卤地菊，是菊科的蟛蜞菊属多年生草本。广布于泛热带到暖带海岸，台湾、华南、东南亚、日本一带均有生长。非洲蟛蜞菊可做花坛、护坡地被，是优良的海岸定沙植物；叶可药用；是中小型蝴蝶的蜜源。非洲蟛蜞菊的繁殖主要靠扦插繁殖，但自然繁殖存在着繁殖系数低，受季节限制等问题。通过组织培养可以达到短时间内快速繁殖的目的，提高产量，并且可以克服季节对繁殖的影响。用组织培养技术进行规模化微繁殖，是获得大量优质种苗的有效途径。针对这样的情况我们旨在利用组织培养方法，通过无性繁殖手段来提高非洲蟛蜞菊的繁殖率，为其周年生产提供技术方案。有关非洲蟛蜞菊无性繁殖幼苗的组织培养方法在国内尚未有人报道，国际上也未见报道。
植物组织培养的基本过程为利用植物体离体的器官、组织或细胞，(如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等)在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，诱导出愈伤组织再分化形成不定芽，或者直接由植物离体组织或器官直接分化出丛生芽，然后诱导生根，最后形成完整的植株。再生植株经炼苗后移栽，最终形成商品植株。
(三)发明的内容本发明的目的在于提供一种非洲蟛蜞菊的繁殖方法，它能够明显提高非洲蟛蜞菊的无性繁殖系数，繁殖速度快而且操作简便。
具体地讲，本发明方法包括如下步骤(1)外植体消毒将非洲蟛蜞菊顶芽或侧芽置于65-75％乙醇中浸泡20-60s(表示“秒”，下同)，0.1％升汞中灭菌4-12min(表示“分钟”，下同)，再用无菌水冲洗3-6次；(2)无菌苗的获得将消毒后的非洲蟛蜞菊顶芽或侧芽接种到MS培养基中培养15～30天获得无菌苗，培养条件为温度25±2℃，光照强度1500Lux，光照时间12h·d-1(表示“小时/天”，下同)；(3)诱导丛生芽发生将无菌苗的茎尖或茎段置于配方为MS+0.5-5mg/L 6-苄基氨基嘌呤(简称6-BA)+0-0.5mg/L萘乙酸(简称NAA)的培养基上培养15～35天获得丛生芽(高度一般为1～2cm)，培养条件同步骤(2)；(4)诱导生根将步骤(3)所得到的丛生芽分切成单株，在1/2MS+0-5mg/L吲哚丁酸(简称IBA)或NAA培养基上培养5～20天得到再生植株，培养条件同步骤(2)。
(5)再生植株移栽将步骤(4)获得的再生植株经炼苗后，移栽入蛭石土或者花卉土中，用自来水或者1/4MS培养液浇灌。
上述方法中，在步骤(3)中，培养基的优选方案是MS+1-5.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L NAA，最好是MS+2.0mg/L 6BA+0.5mg/LNAA。步骤(4)中培养基的优选配方是采用1/2MS+0.5-1mg/L IBA或NAA配方，其中IBA或NAA的浓度最好是1.0mg/L。
本发明具有如下的优点和效果1.经实验证明，本发明方法步骤(3)中不定芽的诱导率最高可达100％，每个外植体都可以分化出多个不定芽，其中以2.0mg/L6BA+0.5mg/L NAA的培养基中的不定芽最多，每个外植体有8～10个芽，在步骤(4)中，采用IBA、NAA进行诱导，生根率100％，而且长势良好，保证了试管苗不定根质量。与现有的繁殖技术相比，该方法繁殖效率高，周年可以大量生产，克服了现有技术受季节对繁殖的影响。
2.本发明方法无需专有设备，操作简便。
(四)具体的实施方式实施例1(1)外植体的消毒取非洲蟛蜞菊顶芽或侧芽置于70％乙醇中浸泡30s，0.1％升汞中灭菌6min，再用无菌水冲洗5次；(2)无菌苗的获得将已消毒的非洲蟛蜞菊外植体接种到MS培养基上培养15天，获取无菌苗，培养条件为温度25±2℃，光照强度1500Lux，光照时间12h·d-1(表示“小时/天”，下同)；(3)芽的分化一个月后接种到附加有0.5mg/L 6-BA的MS培养基上，培养15天，不定芽分化率为87.5％，能分化的每个外植体有1～2个不定芽，培养35天，不定芽分化率为100％，能分化的每个外植体有2个不定芽。
(4)根的形成形成的小苗，转接入附加1.0mg/L IBA的1/2MS培养基上，培养5天时，生根率为100％，且每个外植体均有10～11条诱导根，诱导根成放射状，培养10天后，每个外植体的诱导根增至15～16条，培养20天后，诱导根生长变长，爬满瓶底。苗的生长状况良好。
(5)试管苗移栽在诱导根实验培养20天后，将试管苗炼苗后转入蛭石土，以1/4MS培养液浇灌，15天后苗生长良好，成活率100％。
实施例2其它操作同实施例1，所不同的是步骤(1)中，取非洲蟛蜞菊顶芽或侧芽置于65％乙醇中浸泡20s，0.1％升汞中灭菌4min，再用无菌水冲洗6次；步骤(2)中，培养时间为20天；步骤(3)中，培养基配方为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培养时间为15天，不定芽分化率为100％，每个外植体有2～3个分化芽，培养35天时，每个外植体平均有3个分化芽；步骤(4)中，培养基改为1/2MS+1.0mg/L NAA，培养5天时，生根率也为100％，每个外植体的诱导根为8～9条，诱导根成放射状生出，且增长状况较好，培养10天后，每个外植体的诱导根增至13～14条，培养20天后，诱导根生长变长，爬满瓶底，苗的生长状况良好；步骤(5)中，蛭石土改为花卉土，以自来水浇灌，15天后，苗生长良好，成活率为100％。
实施例3其它操作同实施例1，所不同的是步骤(1)中，取非洲蟛蜞菊顶芽或侧芽置于75％乙醇中浸泡60s，0.1％升汞中灭菌12min，再用无菌水冲洗3次；步骤(2)中，培养时间为30天；步骤(3)中，培养基配方为MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培养时间为15天时，不定芽分化率为75％，能分化的每个外植体有2～3个分化芽，培养时间为35天时，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～5个分化芽；步骤(4)中，培养基改为1/2MS+0.5mg/L NAA，培养5天时，诱导根成放射状生出，生根率也为100％，每个外植体的诱导根为7～8条，培养10天后每个外植体的诱导根增至9～10条，培养20天后，诱导根生长变长，爬满瓶底。苗的生长状况良好。
实施例4其它操作同实施例1，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培养时间为15天时，不定芽分化率为66.7％，能分化的每个外植体有1～2个分化芽，培养时间为35天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～5个分化芽，且部分外植体会有根生成；步骤(4)中，培养基改为1/2MS+0.5mg/L IBA，培养5天时，根成放射状生出，生根率也为100％，每个外植体的诱导根为9～10条，且增长状况较好，培养10天后每个外植体的诱导根增至13～14条，培养20天后，根长长，布满瓶底。苗的生长状况良好。
实施例5其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+1mg/L 6-BA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～4个分化芽；步骤(4)中，培养基改为1/2MS，5天时，生根率为75％，每个外植体的诱导根为2条，10天后生根率为95.8％，每个外植体的诱导根为2～3条，培养20天后，生根率为100％，每个外植体的诱导根为2～3条，诱导根生长变长。苗的生长状况良好。
实施例6其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培养时间为20天时，不定芽分化率为100％，每个外植体有4～5个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的分化芽增至6～8个；步骤(4)中，培养基改为1/2MS+2mg/L NAA，培养5天后，外植体长出根点，尚无明显生根，底部有愈伤，苗生长良好，培养8天后，根开始成形，生长密集，每个外植体有诱导根9～10个，根较为短，只有1～2mm，生根率为100％，培养15天后，每个外植体有19～20条根，根增长，但最长只有1cm左右。苗长高，长势良好。
实施例7其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培养时间为20天时，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～5个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的分化芽增至8～9个；步骤(4)中，培养基改为1/2MS+5mg/L NAA，培养5天后，外植体底部有愈伤，根点不明显，培养10天后，底部形成愈伤大，愈伤上都有根长出，底部的根点密集，培养15天后，每个外植体有19～20条根，生根率为100％，根增长，但是大部分仅为2～3mm，最长为2cm。苗长高，长势良好。
实施例8其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～4个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至6～9个；步骤(4)中，培养基改为1/2MS+2mg/L IBA，培养5天后，外植体底部有愈伤，长出根点，尚无明显生根，苗生长良好，培养8天后，根生长密集，每个外植体有诱导根14～15个，但是根较为短，只有1～2mm，生根率为100％，培养15天后，每个外植体有22～23条根，根增长，但平均只有1cm左右。苗长高，长势良好。
实施例9
其它操作同实施例1，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+2mg/L 6-BA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～5个分化芽；步骤(4)中，培养基改为1/2MS+5mg/L IBA，培养5天后，外植体底部有愈伤，根点不明显，培养10天后，底部形成愈伤大，愈伤上都有根长出，底部的根点密集，培养15天后，每个外植体有17～18条根，生根率为100％，根增长，但是平均只有4～5mm，苗长高，长势良好。
实施例10其它操作同实施例1，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～4个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至5～7个。
实施例11其它操作同实施例1，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有4～5个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至5～8个。
实施例12其它操作同实施例1，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有4～6个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至8～10个。
实施例13其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+5mg/L 6-BA，培养时间为20天，不定芽分化率为30％，能分化的每个外植体有1～2个分化芽，培养时间为30天时，不定芽分化率为50％，每个外植体的分化芽增至2个。
实施例14
其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～5个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至5～6个，培养时间为35天时，每个外植体的不定芽增至7～8个。分化芽颜色较浅。
实施例15其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～5个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至5～8个，培养时间为35天时，每个外植体的不定芽为5～9个。分化芽颜色较浅。
实施例16其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有3～5个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至5～8个，培养时间为35天时，每个外植体的不定芽为5～9个。分化芽颜色较浅。
实施例17其它操作同实施例2，所不同的是步骤(3)中，培养基配方为MS+5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，培养时间为20天，不定芽分化率为100％，每个外植体有4～6个分化芽，培养时间为30天时，每个外植体的不定芽增至7～9个，培养时间为35天时，每个外植体的不定芽为8～10个。分化芽颜色较浅。
权利要求
1.一种非洲蟛蜞菊的繁殖方法，其特征在于包括如下步骤(1)外植体消毒将非洲蟛蜞菊顶芽或侧芽置于65-75％乙醇中浸泡20-60s，0.1％升汞中灭菌4-12min，再用无菌水冲洗3-6次；(2)无菌苗的获得将消毒后的非洲蟛蜞菊顶芽或侧芽接种到MS培养基中培养15～30天获得无菌苗，培养条件为温度25±2℃，光照强度1500Lux，光照时间12h·d-1；(3)诱导丛生芽发生将无菌苗的茎尖或茎段置于配方为MS+0.5-5mg/L 6-BA+0-0.5mg/L NAA的培养基上培养15～35天获得丛生芽，培养条件同步骤(2)；(4)诱导生根将步骤(3)所得到的丛生芽分切成单株，在1/2MS+0-5mg/L IBA或NAA的培养基上培养5～20天得到再生植株，培养条件同步骤(2)；(5)再生植株移栽将步骤(4)得到的再生植株炼苗后，移栽入蛭石土或者花卉土中，用自来水或者1/4MS培养液浇灌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(3)中，培养基配方为MS+1-5.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L NAA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(3)中培养基的配方为MS+2.0mg/L 6BA+0.5mg/L NAA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中，培养基的配方为1/2MS+0.5-1mg/L IBA或NAA。
5.如权利要1或4所述的方法，其特征在于步骤(4)中培养基的配方为1/2MS+1.0mg/L IBA或NAA。
全文摘要
非洲蟛蜞菊的繁殖方法，包括五步骤(1)外植体消毒采用65－75％乙醇和0.1％升汞消毒；(2)无菌苗的获得采用MS培养基，培养15～30天，温度25±2℃，光照强度1500Lux，光照时间12h·d
文档编号A01H4/00GK1631106SQ20041007759
公开日2005年6月29日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者谭武贤, 刘吉升, 陈刚, 李玲 申请人:华南师范大学