专利名称：用于抗SARS冠状病毒治疗的RNAi物质的制作方法
技术领域：
本发明提供用于治疗严重急性呼吸道综合症(SARS)的组合物和方法。更具体地说，本发明描述了以呼吸道感染(包括SARS冠状病毒)为目标的核酸物质(如siRNA分子)及其类似物和其使用方法，用于临床治疗SARS和呼吸道病毒感染、用于生物防御所需的预防和治疗呼吸道感染、用于治疗呼吸道疾病以及用于开发呼吸道疾病和感染的治疗靶点。本发明提供对人肺部疾病(包括遗传疾病、感染性疾病、病理状况和自身免疫疾病)的治疗和方法。本发明还提供siRNA物质和传递方法，以抑制基因在动物疾病模型(例如小鼠和猴)中的表达，作为开发和验证药物靶点功能的工具。
背景技术：
最近，在亚洲、北美和欧洲报道了一种叫做严重急性呼吸道综合症(SARS)的新疾病[1]。到2003年5月15日为止，在全世界已经报道了约7628例SARS，587例死亡。一般而言，SARS始于超过100.4(＞38.0℃)的发烧。其它症状可包括头痛、全身感觉不适及肌体疼痛。一些人还出现了轻微的呼吸道症状。2-7天后，SARS患者可发展为干咳和呼吸困难。大部分的SARS病例都涉及照料SARS患者或与SARS患者生活的人，或者直接接触SARS患者的感染物(例如呼吸道分泌物)的人。SARS传播的可能方式包括接触其它人的皮肤或污染传染性飞沫的物体，然后接触你的眼睛、鼻子或嘴。因为这些疾病的病原学还没有确定，所以当时不能提出特别的治疗建议。经验疗法应包括对任何病原学不清楚的社区获得性肺炎相关生物的覆盖，包括具有抗典型和非典型呼吸道病原体活性的药物。疾病严重程度可影响治疗选择。推荐传染病会诊。
与呼吸道感染的严重挑战相类似，许多肺部和呼吸道疾病没有获得足够治疗，包括哮喘和COPD。这些疾病和其它的呼吸道疾病需要更好的与该疾病相关的生化途径抑制剂。本发明使用设计用于抑制疾病途径中的选定基因并以本发明提供方式传递的siRNA，突破了当前在呼吸道和肺部疾病治疗方面的局限。
发明概述本发明提供用于抑制SARS-冠状病毒(SARS-CoV)活性或其他病毒的新的RNA干扰(RNAi)物质及传递方法。本发明提供对病毒关键蛋白生产的抑制，这些关键蛋白是复制、感染和病毒生命周期的其它关键功能所必需的。本发明还提供对病毒基因组RNA的直接破坏。本发明提供RNAi物质小干扰RNA(siRNA)的序列，其在哺乳动物细胞和动物中具有有效抗病毒活性，可为化学合成或载体表达的、体外转录和载体表达的shRNA、siRNA、miRNA和其它类型的siRNA分子；用于在哺乳动物细胞和动物气道和肺组织中进行siRNA-介导的基因抑制的物质；用于将siRNA有效传递入动物模型气道的物质；SARS-CoV特异性siRNA双链体在哺乳动物中抑制病毒感染和复制的作用机制；编码冠状病毒复制和感染所需的关键蛋白的靶序列；编码和非编码区中用于si-RNA介导的冠状病毒病毒RNA基因组破坏的靶序列；传递核酸物质及类似物给哺乳动物的途径和方法；检测病毒RNA基因组任一部分的基于RNA模板特异性RNA的RT-PCR方法和试剂，用于诊断和预后；以及使用核酸物质及类似物治疗肺部疾病和感染的方法。
更具体地说，本发明提供一种分离的双链RNA分子，其含有的第一链具有对应于SARS病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有的第二链具有与SARS病毒核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列，其中该双链分子抑制SARS病毒核苷酸序列的表达。
第一链和第二链可为单独的互补链，或者可包含在单个分子中，其中该单个分子含有环状结构。SARS病毒的核苷酸序列可为例如nsp1序列、nsp9序列或刺突蛋白序列。
第一链可含有选自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
本发明还提供检测样品中SARS病毒的方法(a)使得自样品的RNA与基因特异性引物接触，并通过逆转录合成第一链cDNA分子，其中所述基因特异性引物含有与SARS序列互补的3′区和与SARS序列不互补的5′序列，接着(b)使用一对引物以PCR扩增第一链cDNA，其中第一个引物与基因特异性引物的5′区互补，其中第二个引物含有SARS基因组中基因特异性引物3′区识别区域上游的序列，以及(c)检测PCR产物。基因特异性引物可与例如SARS nsp1、nsp9或刺突蛋白序列互补。基因特异性引物可含有选自以下的序列GAACAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gac aac ctg ctc ataaa、GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gag gat gggcat cag ca和GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gtgtta aaa cca gaa gg。第一个引物可含有序列GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。第二个引物可含有选自以下的序列GGG AAG TTC AAG GTT ACA AGA ATG TGAGAA、CGG TGT AAG TGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG和CCTTGA CCG GTG CAC CAC TTT TGA TGA TGT。
本发明还提供治疗或预防患者冠状病毒感染(例如SARS病毒感染)的方法给予患者有效量的含分离双链RNA分子的组合物，其中所述RNA分子含有的第一链包含对应于冠状病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有的第二链包含与冠状病毒核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列，其中该双链分子抑制冠状病毒核苷酸序列的表达。第一链和第二链可为单独的互补链，或者可包含在单个分子中，其中该单个分子含有环状结构。SARS病毒的核苷酸序列可为例如nsp1序列、nsp9序列或刺突蛋白序列。第一链可含有选自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。双链RNA分子可含有选自以下的序列SC2、SC5、SC14和SC15。
在以上的治疗或预防方法中，可通过例如鼻内传递或传递入气管，将双链RNA分子传递入患者气道。组合物可在载体中含有双链RNA分子，该载体含无RNA酶的葡萄糖水溶液，例如5％葡萄糖溶液。双链RNA分子的剂量可为1-100mg/kg患者体重。组合物还可以作为无RNA的水溶液在气溶胶或粉末中传递。
本发明还提供治疗患者呼吸道疾病的方法给予患者气道双链RNA分子，该RNA分子含有的第一链包含对应于疾病相关基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有第二链包含与该基因核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列，其中疾病相关基因在疾病中表现出不需要的高水平基因表达，其中双链分子抑制疾病相关基因核苷酸序列的表达。疾病相关基因可为病原生物如细菌、病毒或真菌的基因。疾病还可为例如自身免疫炎症或肺癌。
由以下的详述可清楚看出本发明的其它目标、特征和优势。但是，应当理解的是，给出的详述和具体实施例尽管显示本发明的优选实施方案，但仅是说明性的，因为根据此详述，属于本发明精神和范围的各种改变和修饰对本领域技术人员来说是显而易见的。
附图简述
图1显示SARS冠状病毒CUHK-WIUrbani的基因组结构。SARS冠状病毒CUHK-WI毒株(AY278554.1)的基因组序列长29206bp。基因的大小按比例绘出。结构蛋白以实心方框表示。L是前导序列；“p65？”表示推定的MHVp65样蛋白；数字1-13表示非结构(nsp)蛋白，其中nsp8在公开的序列数据中遗漏了。S是刺突蛋白；M是膜糖蛋白；U是未知蛋白。箭头表示非结构多蛋白。黑条显示siRNA-靶向序列的位置。
图2显示29727bp长的SARS冠状病毒Urbani毒株(AY278741.1)的基因组结构。基因的大小按比例绘出。结构蛋白以实心方框表示。S是刺突蛋白；E是包膜蛋白；M是膜糖蛋白；N是核壳磷蛋白。箭头表示非结构多蛋白。编号的黑条显示siRNA-靶向序列的位置。
图3显示不同SARS冠状病毒分离株上siRNA靶的位置。使用基于SARS冠状病毒CUHK-WI设计的靶序列查明其对不同SARS冠状病毒分离株的特异性。第5个和第6个靶序列(刺突蛋白-1和-2)与GZ-01分离株的“错配”只不过是因为提交的GZ01分离株的序列数据不完整；HKU39849上的第3个靶序列(nsp9-A)的错配是因为在HKU39849序列中的13496nt位置有一个碱基对错配，其它分离株的基因组序列不存在此情况。
图4显示向肺系统的核酸传递。经多个途径进行气道传递非常有效。气溶胶、鼻内装置和口-气管传递是传递RNAi分子的非侵入性途径。
图5显示siRNA在肺中对荧光素酶表达的抑制。使用5％葡萄糖或Infasurf，将荧光素酶质粒连同GFP或荧光素酶特异性siRNA经口-气管传递给小鼠。16小时后检测肺匀浆中的荧光素酶活性。
图6显示使用鼻孔传递途径时，荧光标记的siRNA在小鼠呼吸道中的分布。将30μg荧光标记的siRNA双链体的50μl鼻孔传递溶液(5％葡萄糖和12μg/μl Infasurf)经鼻孔传递途径传递入呼吸道。传递后4小时，处死小鼠，分离呼吸道气管和肺。组织的荧光显微镜检测揭示，siRNA在呼吸道和肺中广泛分布，甚至在用PBS清洗组织以去除非特异性粘附至细胞表面的siRNA之后也是如此。
图7显示使用口-气管传递途径时，荧光标记的siRNA在小鼠呼吸道中的分布。将30μg荧光标记的siRNA双链体的50μl口-气管传递溶液(5％葡萄糖和12μg/μl Infasurf)经鼻孔传递途径传递入呼吸道。传递后4小时，处死小鼠，分离呼吸气管和肺。组织的荧光显微镜检测揭示，siRNA在呼吸道和肺中广泛分布，甚至在用PBS清洗组织以去除非特异性粘附至细胞表面的siRNA之后也是如此。
图8显示SARS-CoV基因组中48个siRNA靶向序列的位置。整个基因组约29.7kb，由14个ORF组成，这些ORF在5′端编码复制酶和转录酶，在3′端编码结构蛋白和辅助蛋白。16个双链体靶向ORF1a和ORF1b区，而32个双链体靶向ORF2至ORF9区域。编码刺突蛋白、膜糖蛋白、包膜蛋白和ORF3的区域各有6或7个双链体大规模靶向。粗条表示各个siRNA靶向序列的位置。箭头指向产生强抗-SARS-CoV活性的序列。
图9显示用于细胞培养物转染以测试其抗-SARS-CoV活性的48个siRNA分子。
图10显示siRNA在FRhK-4细胞中的抗病毒效力。A、B和C显示了细胞在SARS-CoV感染作用下的CPE。当健康细胞(A)受到病毒感染时，观察到显著的CPE(B)，相反，细胞先用siRNA双链体转染接着再用病毒感染时，没有出现明显的CPE(C)。
图11显示SARS-CoV的电镜照片，箭头表示感染细胞中的SARS-CoV(D)，相反，在先用siRNA转染保护接着用病毒感染的细胞中，没有可见的病毒(E)。
图12显示相对病毒基因组拷贝检测的选定siRNA双链体的预防效力。对全部48种双链体进行CPE筛选，选择4种siRNASC2、SC5、SC14和SC15，测试其在FRhK-4细胞中作为预防剂的效力。实时定量PCR检测揭示，这些siRNA双链体能够显著(p＜0.01)减少病毒复制。
图13显示培养基中相对病毒量(TCID50)检测的选定siRNA双链体的预防效力。相比于没有预处理的对照组，siRNA预处理组显著(p＜0.01)下降。
图14显示siRNA-介导的预防效力的时程。在SC5 siRNA转染后4、8、16、24、48、60和72小时感染FRhK-4细胞。36小时后，检测病毒滴度，以评价siRNA在不同时间点抗SARS-CoV感染的预防效力。黑条表示未用siRNA预处理的样品的相对病毒基因组拷贝，相反，白条表示预处理的样品。每种样品进行三次平行测试，并图示了标准偏差。
图15显示细胞培养物中用病毒基因组拷贝检测的选定siRNA双链体的治疗效力。用SARS-CoV感染FRhK-4细胞，接着用SC2、SC5、SC14和SC15 siRNA双链体转染。在转染后36小时进行治疗效力检测。每种样品进行三次平行测试，并图示了标准偏差。
图16显示用病毒滴度(TCID50)检测的选定siRNA双链体的治疗效力。每种样品进行三次平行测试，并图示了标准偏差。
图17显示组合siRNA双链体的治疗效力。用SARS-CoV感染FRhK-4细胞，接着用各种组合的活性siRNA双链体转染，之后检测相对病毒基因组拷贝。在转染后36小时，收集细胞和培养基进行Q-RT-PCR和病毒滴度检测。在用组合siRNA双链体处理的感染细胞中观察到显著的抗病毒治疗效力。每种样品进行三次平行测试，并图示了标准偏差。
图18用相对病毒基因组拷贝数显示各种siRNA组合的预防效力。将4种选定siRNA双链体的7种组合转染入FRhK-4细胞，8小时后用SARS-CoV感染。感染后24小时收集样品进行Q-RT-PCR。
图19显示SC2和SC5 siRNA组合的保护效力的时程。黑条表示未用siRNA预处理样品的相对病毒基因组拷贝，相反，白条表示预处理样品。每种样品进行三次平行测试，并图示了标准偏差。
图20显示以CMV驱动荧光素酶和SARS-CoV序列(包括SC2和SC5)融合构建的哺乳动物表达载体pCI-Luc-SC。当SC2和SC5siRNA双链体与该载体共转染入293细胞时，荧光素酶表达水平显著下调。
图21显示pCI-Luc-SC质粒与SC2和SC5 siRNA双链体通过气管内给予共传递入小鼠肺部后24小时的作用。肺中荧光素酶表达受抑制表示siRNA-介导的序列特异性抑制(knockdown)。
图22显示使用组合siRNA双链体抑制肺中SARS-CoV感染的非人灵长类动物研究的病理组织学数据。用单独的SARS-CoV感染或在不同的时间点通过鼻内传递0.5ml盐水溶液共传递SARS-CoV和siRNA双链体，处理5组测试动物，每组4只猴子。组I用SC2和SC5 siRNA(30mg/剂)组合处理，然后进行SARS-CoV感染。组II用SC2-SC5 siRNA和SARS-CoV共给予(30mg/剂)，接着再给予两剂。组III先用SARS-CoV病毒处理，然后重复传递3次SC2-SC5 siRNA组合。组IV用相同量的对照siRNA处理，接着进行SARS-CoV感染。组V仅用SARS-CoV感染。处死猴子，收集肺组织进行病理组织学分析。组I和组II显示出病理改变比组IV和组V少得多。
图23显示代表病理改变的猴肺病理组织学染色。
发明详述本发明通过使用体内传递的siRNA分子抑制冠状病毒基因表达，提供在哺乳动物中，特别是在灵长类动物和人中，治疗冠状病毒感染的组合物和方法。
更具体地说，本发明提供在肺组织中对基因或基因组物质的抑制。通过抑制病毒的基因或基因组，提供对感染性疾病的治疗或预防疗法。本发明提供短双链RNA寡核苷酸或siRNA，其抑制具有错配序列的基因表达或抑制RNA病毒基因组。本发明还提供核酸(包括RNA或DNA)治疗剂。本发明还提供传递入肺组织的方法。在一个实施方案中，本发明提供冠状病毒病毒特别是SARS冠状病毒的抑制剂。这些呼吸道感染(包括呼吸道病毒感染)的抑制剂可用作治疗性治疗，并可用作预防性治疗。
通过抑制哺乳动物基因提供对疾病的治疗。已经鉴别出许多基因具有引发、保持和恶化肺部疾病的作用。例如，COPD特征为肺部组织炎症和退化，已鉴别出许多基因具有COPD的这些破坏性作用，包括众多的细胞因子和众多的蛋白酶。同样，哮喘特征为气道有害缩窄，已鉴别出许多基因具有该作用，包括离子通道。因此，本发明提供对引发这些作用、维持这些作用和恶化这些作用的哺乳动物基因的抑制。本发明提供的抑制剂提供对肺部疾病的治疗性治疗。
本发明提供由感染物天然或工程改变而产生的呼吸道感染的抑制剂。这种感染物中的天然或工程改变产生新的感染物，引起新的呼吸道感染。这些新的感染需要新的治疗。本发明仅通过获得新感染物的基因组，并鉴定siRNA靶向的独特序列，就提供了抑制这种新感染物的治疗方法。
SARS在亚洲、欧洲和北美的许多实验室中，科学家昼夜不停地研究SARS病因。已经由SARS患者中分离出一种先前不认识的冠状病毒，已对其测序并在猴子模型中进行了测试[2-4]。这种新冠状病毒是引起SARS的第一候选，WHO将其命名为SARS冠状病毒。但是，其它的感染物作为SARS的潜在病因仍在研究中。目前有美国、加拿大、香港、荷兰等地的小组报道的多个SARS-CoV基因组序列[5]。序列信息为设计用于RT-PCR或ELISA的诊断剂提供了关键的知识基础。更重要地是，基于这些序列，我们设计了siRNA双链体，以抑制几种重要的病毒蛋白，理论上它们全部能够破坏正链病毒基因组，因此抑制SARS-CoV的复制过程。产生这种siRNA双链体的成功使得可以开发出传递入患者气道的基于siRNA的疗法，同时用于预防和治疗SARS。SARS-CoV是有义单链RNA，可在人中引发一种流行性最强的感染。SARS-CoV的毒力源自i)其易于通过悬浮颗粒和其它的人-人接触传播，ii)其能够通过经常改变病毒抗原(几乎所有RNA病毒的特征)而逃避保护性免疫，和iii)病毒的新毒株急速涌现。可能存在的SARS-CoV新毒株的威胁是很严重的，因为尽管作了很大的努力，但还没有获得预防和治疗SARS-CoV感染的有效疗法或疫苗，关于该疾病的流行病学、病原学的详情还有很多不清楚。
RNA干扰(RNAi)抑制SARS-CoV感染和复制RNAi是一种作用，通过该作用，双链RNA引导动物和植物细胞中的mRNA序列特异性降解[6-8]。已经证明，一种RNAi小干扰RNA(siRNA，21nt长)双链体有效阻断病毒的体外和体内感染和复制[9-12]。该方法对RNA病毒组、HIV、HCV和流感病毒等特别有用，对各种哺乳动物细胞系统和动物模型系统中的病毒感染产生显著抑制[13-23]。
RNAi对干扰SARS CoV感染似乎很理想。首先，SARS CoV是单链RNA病毒，在其生命周期中没有任何DNA中间体。除了mRNA之外，vRNA和cRNA是siRNA-介导降解的潜在标靶。其次，SARS CoV基因组RNA编码多个蛋白。每种蛋白或者是病毒结构的组成部分，或者在病毒生命周期中起关键作用。干扰任一蛋白的产生似乎对病毒复制和生产产生严重影响。因此，病毒存在多个siRNA靶，针对不同病毒靶的siRNA组合可同时使用。同时使用两个或更多个siRNA可能是防止抗性病毒出现所必须的，类似于HIV治疗中“鸡尾酒”药物的用法。第三，SARS CoV在人中感染上呼吸道和肺的上皮细胞。因此，siRNA可经鼻内或肺部途径便利地给予，这又可产生比全身注射所获得的siRNA浓度高得多的局部siRNA浓度。考虑到在自然感染之初病毒体的数量可能较少，故上气道和肺的上皮细胞可吸收足量的siRNA，以抑制病毒复制或产生，因此潜在地可达到预防或治疗效果。
本文描述了多个在人中靶向SARS CoV感染和复制所必须的关键蛋白编码序列的siRNA双链体。由于SARS CoV的单链RNA基因组结构，所以SARS CoV可直接被siRNA介导的RNA降解致死。为使用这些siRNA双链体在人中预防和治疗SARS CoV感染，必须将siRNA传递入通常出现病毒感染的上气道和肺上皮细胞中。
基于siRNA的治疗抗SARS CoV效力的临床前研究的成功取决于1.siRNA双链体的抗病毒活性；2.siRNA双链体进入动物气道的传递效率和3.临床相关动物模型的可耐受毒性。
设计在培养细胞和动物模型中有效抑制SARS冠状病毒产生的siRNA双链体。为应用这些RNAi双链体在人中预防和治疗SARS CoV感染，必须将siRNA传递入通常出现病毒感染的上气道和肺上皮细胞中。
体外鉴别有效的siRNA分子方法和材料SARS冠状病毒毒株选择使用先前描述的方法[1]，通过用2003年3月在香港感染SARS的患者的鼻咽抽取液(NPA)感染恒河猴胎肾(FRhK-4)细胞，分离SARSCoV毒株HKU-66078分离株(AY304494)。HKU-66078毒株在FRhK-4细胞中的连续传代物始终产生致细胞病变作用(CPE)，滴度为107TCID50/ml。局部长度测序和系统发生学分析显示该毒株与报道的毒株TOR2(AY274119)、FRA(AY291315和AY310120)以及CUHK-WI(AY278554)非常相似。选择该毒株的原因是其高感染性和毒力特性，产生CPE比其他毒株快(数据未公开)。
细胞培养、转染和病毒感染用96孔板在含10％FCS的MEM培养基中培养FRhK-4细胞。为进行病毒感染，用PBS清洗细胞两次，以3PFU/细胞接种病毒，在无FCS的MEM中温育1小时。然后用MEM清洗细胞两次，在含10％FCS的MEM培养基中于37℃的CO2培养箱中培养24小时或更长时间。感染后约20小时出现CPE，并再在28小时内快速扩散至整个细胞单层。为进行预防研究，在96孔板中用siRNA双链体转染90-95％汇合的FRhK-4细胞，其中siRNA双链体按照生产商的方法以0.3μg/孔与0.5μl Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)混合。转染后8小时，用SARS CoV以3PFU/细胞感染细胞。为进行治疗研究，在96孔板中用SARS CoV以3PFU/细胞感染80％汇合的FRhK-4细胞。在感染后1小时，用siRNA双链体转染细胞，其中siRNA双链体按照生产商的方法以0.3μg/孔与0.5μlLipofectamine 2000混合。转染后4小时，清洗细胞，并在含10％FCS的MEM培养基中培养。
siRNA的设计与合成使用基于TOR2(AY274119)、CUHK-WI(AY278554)和HKU-66078(AY304494)的SARS CoV基因组序列作为模板，设计siRNA靶序列。所有的siRNA双链体都是21个核苷酸(nt)的双链RNA，在两个3′端都含有dTdT突出端，符合Elbashir et al.提出的规则[25]。对照GenBank对靶序列进行BLAST检索，以确保其仅是SARS-CoV基因组独有的。还设计了另外的40个siRNA双链体(图9)，并通过Qiagen(Germantown，MD)合成。
电镜检查收获有或没有SARS-CoV感染的FRhK-4细胞，并在2.5％戊二醛(Electron Microscopy Sciences，Washington，USA)中固定4小时，在1％四氧化锇中后固定1小时。然后将细胞转移至1.5ml试管中，以1,000rpm离心10分钟。一去除上清液，就向细胞沉淀中加入55-60℃的液化2％琼脂(Sigma，St.Louis，USA)溶液。凝胶固化后，制备含细胞沉淀的约1mm3立方体，并在分级乙醇中脱水。将立方体包埋在环氧树脂(Polysciences，Warrington，USA)中。制备70nm厚度的超薄切片，用乙酸双氧铀(Electron Microscopy Sciences，Washington，USA)和柠檬酸铅(Leica Microsystem，Vienna，Austria)染色。在PhilipsEM208S电镜下以80kV检测切片。影像以200nm长度标记。
病毒滴定和实时定量RT-PCR使用基于CPE的TCID50实验，通过滴定培养物上清液中的病毒量测定培养基中的释放病毒。用MEM以10倍连续稀释培养物上清液，并接种96孔板中的FRhK-4细胞。培养3天后评价结果。使用实时定量RT-PCR(Q-RT-PCR)定量毒基因组RNA的胞内拷贝数。用PBS清洗细胞两次，使用QIAamp RNA分离试剂盒(RocheMolecular Biochemicals)提取细胞中的总RNA。使用RNA H+逆转录酶(Invitrogen)和随机引物合成第一链的cDNA。使用2μl各反应的逆转录产物进行PCR。将正向引物(5′-GCATGAAATTGCCTGGTTCAC-3′，终浓度900nM)、反向引物(5′-GCATTCCCCTTTGAAAGTGTC-3′，终浓度900nM)和荧光探针(FAMAGCTACGAGCACCAGACACCCTTCGAAA-TRMA，终浓度250nM)与Master Mix混合，并使用ABl7900 Sequence DetectionSystem(ABI，Foster City，CA，USA)进行实时PCR。PCR运行条件是50℃，5分钟；95℃，10分钟以及40个循环的95℃，15秒和61℃，1分钟。所有的检测都进行3次，以进行统计学分析。
结果选择最有效的siRNA双链体尽管siRNA双链体一般来说能够抑制互补RNA序列，但已知靶向同一基因不同区域的siRNA的沉默效果有显著不同。尽管控制有效siRNA导向基因沉默的规则仍不明确，但siRNA序列的碱基组成可能不是决定抑制靶基因效力的唯一因素。本研究采取的策略是集中在SARS CoV感染和复制的某些关键蛋白的编码区域，同时覆盖整个病毒基因组RNA中的区域，以确保可鉴别出有效抑制SARSCoV的siRNA双链体。选择各21nt的48个序列作为标靶，用于siRNA介导的SARS CoV感染和复制的抑制。根据最近描述的SARS CoV基因组结构[27-29]，在图8显示了各个siRNA靶向的序列在基因组RNA中的位置，各个siRNA靶向序列的详细信息列于图9。
序列分析揭示了SARS CoV基因组的29,740个碱基(FRA分离株，AY310120)的结构[27-29]。核苷酸1-72含有预测的RNA前导序列，之后是跨越192个核苷酸的非翻译区(UTR)[26]。SARS CoV基因组表达始于两个大复制酶可读框ORF1a和ORF1b的翻译，这两个可读框都编码多蛋白，这些多蛋白被加工成一组很少鉴定的复制酶。推测这些复制酶亚单位形成病毒复制复合物，负责在宿主细胞中合成和复制病毒RNA[29]。在它们之中，由nsp-3区编码的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PLpro)对病毒蛋白的成熟很重要，而由nsp-12区编码的RNA依赖性RNA聚合酶在催化病毒RNA合成中起关键作用。由ORF2编码的刺突蛋白位于病毒体表面，负责趋向、受体识别、细胞粘附以及诱导中和抗体。最初，对病毒序列功能作用的理解引致合理设计出8个靶向前导序列、nsp-3、nsp-12和刺突蛋白编码区的siRNA双链体(SC1-SC8)。将siRNA双链体转染入之前刚用SARSCoV感染的FRhk-4细胞。感染后36小时，评价处理细胞的致细胞病变作用(CPE)，以此代表siRNA介导的对病毒感染的保护作用。一个nsp-12特异性siRNA SC5和一个刺突蛋白特异性siRNA SC2显示显著降低CPE(＞80％)，而其它6个双链体仅显示出中等(50％-70％)或最小的CPE下降(＜30％)。
此初始成功促使使用相同的基于CPE的方法，在基因组范围内筛选靶向整个SARS-CoV基因组RNA中不同区域的另外40个siRNA(图8)。令人惊奇的是，仅有两个另外的siRNA双链体，即靶向nsp-13区的SC14和靶向nsp-16区的SC15，显示出类似于用SC2和SC5观测到的降低CPE的效力。在SARS-CoV感染前用SC14 siRNA转染的FRhK-4细胞表现出极深的对CPE的预防性保护作用(
图10)。已经证实，当细胞在HIV病毒感染前用siRNA转染时，合成的siRNA双链体能够降解病毒基因组RNA[30]。因为siRNA在胞质中有效，所以在感染过程中进入细胞的基因组病毒RNA不得不遭遇此初始防御机制。
siRNA靶向引入的基因组病毒RNA的能力暗示siRNA在SARS-CoV感染治疗中具有治疗性用途。电镜图进一步说明了保护FRhK-4细胞抗SARS-CoV感染的作用(
图11)。不过，在48个siRNA双链体中仅有4个显示出显著降低SARS-CoV感染导致的CPE。这4个siRNA双链体的GC含量在38％-48％的范围内。似乎siRNA靶向序列在病毒基因组中的位置直接影响对病毒RNA破坏的效力。更令人感兴趣的是，这4个最有效的抑制剂SC2、SC5、SC14和SC15全部都靶向病毒基因组序列的中段(nt 13500-21600)。它们中的3个直接靶向ORF1b区，这一事实强有力地支持了此编码区对病毒基因组稳定性可能起关键作用的观点。而且，在7个靶向ORF1b区的siRNA双链体中只有3个具有强抑制作用，这表明在编码区中存在序列偏好。
在这3个待认识的双链体中，RNAi易感性更好的序列模式和基序特征还不明了。在本研究中观察到的病毒基因组水平上的位置作用确切机制需要进一步研究来彻底理解。7个靶向刺突蛋白的siRNA双链体中的一个SC2 siRNA能够显著降低SARS-CoV诱发的CPE。这进一步证实了各个ORF中siRNA靶向序列的位置作用可显著不同[25]。
选定siRNA双链体的预防效力HIV-1研究[13-14]和呼吸道合胞体病毒(RSV)研究[30]表明，病毒基因组RNA和mRNA都对预先存在于宿主细胞中的siRNA敏感。为研究靶向SARS CoV的选定活性siRNA的预防效力，在病毒感染前用siRNA双链体转染FRhK-4细胞。通过使用Q-RT-PCR检测胞质病毒基因组拷贝数，并滴定培养基中的病毒量(TCID50)，评价抗病毒效力。
图12显示了在病毒感染前8小时将siRNA双链体SC2、SC5、SC14和SC15转染入FRhK-4细胞时SARS-CoV基因组拷贝数的下降。感染后72小时收集样品，使用Q-RT-PCR检测相对病毒基因组拷贝数。
图13显示了siRNA双链体对培养基中的SARS CoV量的抑制作用。两个检测都证明SC5、SC14和SC15 siRNA双链体能够大量抑制病毒复制，而SC14表现出最强的效力。所观测的预防性抑制作用提供了直接的证据，表明宿主细胞中预先存在的siRNA能够预防SARS CoV感染，并抑制病毒复制。
一个要研究的问题是该siRNA介导的预防性作用在抗SARS CoVsiRNA单独转染后可维持多久。为解决此问题，进行时程研究，以明确siRNA介导的预防活性的持续时间。在相同剂量的SC5 siRNA转染后4、8、16、24、48、60和72小时的时间点，用相同剂量的SARSCoV感染FRhK-4细胞。siRNA介导的抗SARS CoV预防性作用维持达72小时，是研究中的最长时间周期(
图14)，尽管已经报道了相对稳定和持续长时间的siRNA介导的沉默作用[25，31]。在此时程中，预处理组的病毒基因组拷贝数在所有时间点都保持在低水平，相比之下，在没有siRNA的情况下，在感染后8小时病毒基因组拷贝数快速增加。该结果表明，至少在72小时内，siRNA双链体在FRhK-4细胞中保持稳定和活性。这种延长的预防性作用提示，siRNA用作抗SARS CoV感染的预防手段的潜在用途，例如在卫生保健专业人员接触SARS患者前给予其siRNA，因为预防性的siRNA能够在数小时内迅速起作用并维持数天。预防性的抗病毒作用还可以激发起有价值的研究即研究预先存在的siRNA物质可预防病毒感染宿主细胞的机制。
选定的siRNA双链体的治疗效力在病毒复制早期，RNAi方法仅处理基因组RNA。但是，在病毒进入细胞后，复制激活，在感染细胞中新生出成千上万的病毒转录物，病毒基因组RNA和mRNA的降解对RNAi机制来说成为了更艰巨的任务。为评价选定的siRNA双链体的治疗作用，在SARS CoV感染后1小时，使用在预防性研究中使用的相同剂量的siRNA转染FRhK-4细胞。
24小时后，收集细胞和培养基，通过Q-RT-PCR检测胞质病毒基因组拷贝，通过TCID50检测病毒滴度。相对病毒基因组拷贝数(
图15)表明，仅有一个siRNA双链体SC15能够实现显著下降。另一方面，SC5和SC14能够使病毒滴度明显降低(
图16)。显然，对已经感染SARS CoV的细胞siRNA介导的治疗效力远弱于预防效力。
这些数据暗示，siRNA作为治疗剂的效力弱可能是源于降解预先存在的病毒基因组RNA和sg mRNA的任务，以及由病毒感染引起的对siRNA转染的潜在阻碍。为提升靶向SARS CoV的siRNA双链体的治疗效力，合理的方案是增加转染的siRNA的剂量或组合多个靶向病毒基因组RNA多个区域的siRNA双链体。在以下的实验中，增强靶向SARS CoV的siRNA的治疗效力以及预防效力的努力很大程度上集中于这两种方法。
多个siRNA双链体的组合效力尽管有多个关于靶向单个基因或单个序列区域的siRNA介导的抗病毒活性的报道，但有限证据表明多个靶向不同基因或区域的siRNA组合的用途。在增强抗SARS-CoV治疗效力的尝试中，评价组合多个靶向不同病毒基因的siRNA双链体的策略。在4个选定的活性siRNA双链体中选择siRNA组合。用于转染的剂量相同，与siRNA种类的数目和组成无关。
为验证组合多个活性siRNA双链体将提升治疗效力的假说，将7种相同剂量的活性siRNA组合转染入已感染SARS-CoV的细胞。转染后36小时，收集样品，检测病毒基因组拷贝数和病毒滴度。所有组合都显示治疗作用的效力大幅提升根据病毒基因组拷贝数的检测(
图17)，抑制病毒复制达80％，但是，将SC5的剂量增加至2-4倍没有提升对SARS-CoV的抑制效力。
这些数据清楚表明，靶向病毒基因组RNA不同区域的多个siRNA双链体的组合显著增强抗SARS的治疗效力，而增加活性siRNA双链体的剂量可没有任何显著的影响，另外，该结果还提示SARS-CoV感染不影响siRNA转染和功能。在预防效力的研究过程中，如所述方法所描述的一样，在SARS-CoV感染后转染各种组合的活性siRNA双链体。24小时后，收集细胞和培养基进行Q-RT-PCR和TCID50。和对照样品相比，当细胞用各种组合的活性siRNA双链体预处理时，观测到病毒基因组拷贝数显著下降(
图18)。令人感兴趣的是，增加研究中使用的SC2的剂量(3×SC3)对预防效力没有显著提升。在使用组合的siRNA双链体SC2和SC5时，还观测到预防效力延长至72小时(
图19)。
在该研究中观测到的siRNA介导对SARS-CoV复制的抑制可能是源于siRNA能够破坏病毒基因组RNA、失活病毒复制机制和降低感染毒性。尽管已广泛认可了可读框中siRNA的位置作用[13，16]，但还没有完全认识到siRNA对病毒基因组RNA的位置作用。研究结果表明，在非人灵长类动物细胞培养物中siRNA介导的抗SARS-CoV活性既是基因组位置依赖性的，也是基因序列依赖性的。例如，三个最有效的siRNA双链体靶向病毒基因组的中间区域，而SC2和SC5siRNA靶向可读框的前50-200nt。刺突蛋白特异性siRNA SC2同时降低了病毒滴度和病毒基因组拷贝数，尽管刺突蛋白的生物学作用主要在病毒感染方面。
似乎病毒基因组拷贝数的降低主要是SC2 siRNA的作用，而不是刺突蛋白表达受抑制。以下的事实也支持该结论在32个同时靶向病毒基因组RNA右侧1/3区域和各种sg mRNA的siRNA双链体中，仅有SC2产生显著的抑制作用。显然，大多数靶向sg mRNA的siRNA双链体对病毒复制抑制几乎没有作用。因此，基因组RNA破坏可能是这些抗SARS-CoV siRNA的主要功能。
其它因素I.复制和感染所需的关键蛋白因为在目前对新SARS冠状病毒基因的功能和基因组组成几乎没有了解，所以使用先前已明确的病毒登革热病毒(DEN)的基因组结构信息鉴别新鉴定的冠状病毒基因组序列的关键蛋白的可读框。
选择DEN病毒是因为DEN病毒类似于冠状病毒，因为它们都是正单链RNA病毒，已经报道了DEN病毒复制受到靶向DEN病毒prM基因的siRNA的抑制。根据先前已知的关于DEN病毒基因组结构和公开的SARS冠状病毒基因组序列的信息，鉴别出3个推定的关键蛋白可读框作为siRNA介导抑制的标靶nsp1，用于蛋白成熟的加工酶；nsp9，RNA依赖性RNA聚合酶，对RNA基因组复制和亚基因组mRNA的生产很重要；以及S蛋白(刺突蛋白)，用于受体结合、细胞融合、诱导中和抗体和细胞免疫的表面糖蛋白。
II.设计siRNA双链体使用模板病毒基因组序列SARS-CUHM-WI(AY278554，GI30023518)选择靶向对应基因(可读框)的特异性siRNA双链体。靶基因如下所列靶向的基因nsp1编码蛋白酶，nsp9编码RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，SARS-CUHM-WI和SARS-Tor2的序列相同。
S编码刺突蛋白，该刺突蛋白结合细胞受体、诱导融合、诱导中和抗体和T细胞免疫。其有3bp与SARS-To2不同源，这在设计siRNA双链体时加以避免。
基于Tuschl指导为每种靶基因设计两个siRNA双链体。这些siRNA寡聚物的序列和位置列于下表。图2还显示了带有靶向序列位置的SARS冠状病毒基因组结构图。
表.siRNA靶向的冠状病毒序列所有的靶序列都进行BLAST检索，以检出可能存在的非相关序列的干扰。示于以下的序列都是仅与公开的SARS冠状病毒序列(包括SARS-Urbani和SARS-Tor2毒株)同源的独有序列。
选定的靶在病毒基因组中的位置选择两个siRNA双链体，以靶向每个推定的可读框。
其它的SARS冠状病毒序列保持出现在公开结构域中。选定的靶序列与这些毒株中的大多数在对应区域100％同源，只有HKU39849例外(图3)。
除了以上实施例之外，有效根除冠状病毒感染和复制的特异性RNAi物质还可以靶向SARS冠状病毒中的其它可读框和非编码区。
III.RS-PCR检测SARS冠状病毒设计一种独特的RT-PCR实验检测SARS冠状病毒RNA，该RT-PCR实验叫做RNA模板特异性PCR(RS-PCR)。
a.基于RS-PCR的SARS诊断实验使用引物检测SARS冠状病毒序列。简而言之，该实验使用SARS冠状病毒基因特异性引物(SRT引物)，其含有与SARS冠状病毒序列互补的17nt序列以及附着于其5′的30nt特殊序列，用于由SARS冠状病毒基因的RNA逆转录酶(RT)合成cDNA的第一链。然后使用一对引物进行PCR扩增。正向引物(Forw-引物)识别SARS冠状病毒基因组中SRT引物识别的17nt区域上游的序列。反向引物(Rev-引物)识别附着于SRT引物的特殊序列。在高退火温度(72℃)进行PCR扩增，在该温度只有RT的cDNA可以扩增，但不能扩增任何潜在的DNA污染物。RS-PCR实验可容易地放大至大规模的诊断和预后应用。
b.RS-PCR引物设计引物1正向-nsp1Up(30聚体，推定的nsp1基因编码序列的41-70nt，或冠状病毒序列AY278554的2734-2763nt)，5′---GGG AAG TTCAAG GTT ACA AGA ATG TGA GAA---3′引物2SRT-nsp1Dn(47聚体，在3′的17聚体与推定的nsp1基因编码序列的1041-1025nt或冠状病毒序列AY278554的3734-3718nt互补)。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gacaac ctg ctc ata aa---3′引物3正向-nsp9Up(30聚体，推定的nsp9基因编码序列的35-64nt，或冠状病毒序列AY278554的13381-13410nt)。5′---CGG TGT AAGTGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG---3′引物4SRT-nsp9Dn(47聚体，在3′的17聚体与推定的nsp9基因编码序列的734-718nt或冠状病毒序列AY278554的14080-14064nt互补)。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gaggat ggg cat cag ca---3′引物5正向-SpikeUp(30聚体，推定的刺突蛋白基因编码序列的45-74nt，或冠状病毒序列AY278554的21511-21540nt)。5′---CCTTGA CCG GTG CAC CAC TTT TGA TGA TGT---3′引物6SRT-SpikeDn(47聚体，在3′的17聚体与推定的刺突蛋白基因编码序列的644-628nt或冠状病毒序列AY278554的22110-22094nt互补)。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCGATA gtg tta aaa cca gaa gg---3′引物7(反向-引物)5′-AACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA-3′c.RS-PCR。
以下的方法用于RS-PCR，以检测生物样品中的SARS冠状病毒，所述生物样品例如为细胞裂解物、动物组织和人类患者组织。还可以使用其它的组织。
1).使用RNAwizTM试剂(Ambion)由人样品中分离总RNA。MuLv逆转录酶和RNA酶抑制剂得自Applied Biosystems，RS-PCR中使用得所有其它试剂都得自PE Biosystems。
2).SRT反应将1μg总RNA样品与2μl 10×PCRII缓冲液、4μl 25mM MgSO4、0.5μl 10mM dNTP、1μl RNA酶抑制剂(20U/μl)、1μl 20μm SRT引物、1μl MuLv逆转录酶(50U/μl)和无RNA酶水混合至总体积为20μl。样品于37℃温育30分钟，接着于42℃温育15分钟，然后于94℃加热5分钟。
3).PCR将10μl SRT产物与4μl 10×PCRII缓冲液、3μl 25mMMgSO4、1μl 10mM dNTP、1μl 20μM正向引物、1μl 20μM反向引物、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)和蒸馏水混合至总体积为50μl。样品于94℃加热2分钟，然后进行35个周期的2步PCR94℃退火1分钟以及72℃延长2分钟。在PCR结束时于72℃再温育10分钟，接着于4℃温育，之后通过在0.8％琼脂糖凝胶上对10μl RS-PCR产物进行电泳分析PCR产物。
表.RS-PCR产物的长度
IV.肺部siRNA传递有多个途径可将核酸有效传递入哺乳动物气道(图4)。我们开发了口-气管传递siRNA双链体和其它有效基因表达操作的核酸(图5)。与此类传递相关的独特制剂包括表面活性剂、脂质体和肽聚合物。也可应用鼻传递和其它类型的气道传递方法，以实现最有效的核酸传递。当将荧光标记的siRNA双链体给予上气道(通过鼻传递)和下气道(通过口-气管传递)时，气管和肺都被点亮，甚至在透彻清洗后也是如此(图6和图7)。
体内验证活性siRNA分子根据在2003年进行的48个SARS特异性siRNA的体外研究[32]可得到以下结果1)选择的几个有效的siRNA在感染细胞中抑制SARS-CoV复制达90％。2)这些有效的siRNA当在病毒感染前48-72小时转染入细胞时，抑制SARS-CoV病毒复制达90％，提示siRNA具有预防效力。3)同时传递几种靶向病毒基因组不同位置的siRNA表现出协同抑制作用。证明所选择的siRNA的用药程式安全性及其抗SARS-CoV效力的关键性步骤是在已建立的SARS动物模型中进行体内实验。
在将siRNA介导的SARS-CoV抑制研究直接转移到非人灵长类动物之前，我们首先通过融合含SC2和SC5靶序列的SARS-CoV序列片段和荧光素酶cDNA，构建替代质粒pCI-Luc-SC(图20)。当我们将pCI-Luc-SC连同SC2和SC5 siRNA共转染入293细胞时，与对照siRNA双链体相比，pCI-Luc-SC的荧光素酶表达受到显著抑制(未列出数据)。我们证实此替代方案在体外运行良好之后，接着我们通过气管内给予将质粒和SC2-SC5 siRNA双链体共传递入小鼠肺中。当收集肺组织并将检测的荧光素酶活性与对照siRNA比较时，荧光素酶表达受到显著抑制(图21)。此结果为以下事实提供了强有力的支持siRNA在动物气道中有活性，能够抑制靶基因表达。
尽管正在探索某些替代的动物模型，但非人灵长类动物模型仍是广为接受的标准，原因仅仅是其与人在遗传学和生理学方面类似。SARS的病程由三个阶段组成病毒复制、免疫功能亢进和肺部破坏；siRNA用药程式控制SARS疾病发展的最佳阶段是第一个阶段。因此，在所提出的体内实验中，我们测试了siRNA用药程式在实验性SARS疾病早期的效力。为避免由大量接触siRNA而可能引起的无法耐受的毒性，在使用多剂量时，我们在感染后5天内施用siRNA(p.i.)。该研究的主要目标是测试siRNA抗SARS的效力，并研究测试剂量的siRNA试剂在猴子模型中的毒性模式。动物实验以及随后的测定在Institute of Laboratory Animal Science，CAMS(ILAS)的设备上进行。所有的实验方案都满足中国卫生部制定的相关法规。
测试系统动物、病毒株和动物分组恒河猴SARS模型体系由ILAS建立。该模型显示猴子感染分离自中国SARS患者的SARS-CoV毒株。感染的猴子出现SARS样症状、病理学和血液学模式。我们使用和ILAS相同的SARS-CoV毒株攻击猴子，并将siRNA传递入呼吸道。在首个实验中，使用5组动物(共20只猴子)(表1)。分组原则是组1(G1)指定用于观察预防效力，G2和G3用于观察治疗效力，不同之处在于首剂siRNA是否与病毒感染同时施用。G4周作治疗性siRNA的对照，使用不相关的siRNA；而G5是未治疗组，用病毒攻击健康动物。表2概述了使用的siRNA的总量。
病毒攻击通过不同传递途径的比较研究，经ILAS选择的鼻吸入和喷雾给予SARS CoV。
siRNA的传递将siRNA与合适体积的溶解溶液(5％葡萄糖的无RNA酶水溶液)混合。尽管在siRNA有效传递入猴肺方面没有可利用的文献，但最近的小鼠研究表明肺特异性siRNA传递可通过鼻内给予实现，而不需要病毒载体或转染剂。我们通过鼻吸入和喷雾传递siRNA溶液，与病毒攻击所使用的相同。
表1.治疗组
表2.使用的试剂
评价siRNA的效力和毒性siRNA对SARS-CoV病毒复制、症状、病理学和生理学指标的抑制作用反映出siRNA抗SARS的效力。siRNA的毒性主要由临床体征和/或病理学显示，基本上可由动物对施用的siRNA剂量的耐受能力反映。
SARS-CoV病毒的复制在感染后第0(恰好在攻击前)、4和7天，麻醉猴子，并取出鼻/咽拭样和血样。拭样用于检测病毒基因组mRNA拷贝数(通过实时定量RT-PCR，Q-RT-PCR)和分离SARS-CoV(通过感染容纳细胞)；血样用于Q-RT-PCR。在处死猴子时(感染后第7天两只，感染后第11天两只)，收集肺和血样进行病毒分离。用于Q-RT-PCR的引物先前已描述。如上所述通过用拭样或血样感染容纳细胞(例如Vero细胞)进行病毒分离。在组织培养物上经过1-3次盲传之后可出现CPE。记录CPE，通过Q-RT-PCR测试每次传代的组织培养物的上清液。根据出现的CPE，对比同一代的某些组织培养物上清液样品的病毒滴度，病毒滴度以TCID50表示。这有希望显示出测试组和对照组之间的某些动态差异。作为参照，Q-RT-PCR实验可检测89％SARS患者的89％，病毒分离可采用组织培养物中1轮以上的传代物。
临床体征和肺功能每天记录，包括呼吸道症状、体温、气管支气管淋巴结大小。另外，分析动脉血，还检测脉搏血氧。
组织学测试在感染后第7天和第11天，分别处死每组的两只猴子。对肺组织切片进行传统的组织学和免疫组织学检查(包括原位杂交，FISH)。
常规血检在取拭样的同时取血样。检测常规血检的主要项目，例如WBC、DC、RBC、GB、HCT、MCV、MCH和RDW。
肝酶活性检查进行常规的肝活性检查，例如血清ALT、血清胆红素、凝血酶原、白蛋白、LDH等。
初步结果以30mg/剂的剂量和4次重复给药传递siRNA双链体是安全的。治疗的猴子在给药后没有出现可见的症状，所治疗猴肺的损伤不是由siRNA传递引起，而是由SARS-CoV感染引起。向猴肺重复鼻内给予0.5ml含siRNA药物的溶液非常有效(图22)。根据组I和组IV或V之间的动物肺病理状况对比(图23)，观测到siRNA双链体在猴肺中的预防效力。
根据组I和组IV或V之间动物肺病理状况对比，向猴肺中共给予siRNA双链体和SARS-CoV产生抗SARS-CoV活性。显然，我们在细胞培养研究中观测到的抗SARS-CoV活性在此猴子实验中得到进一步证实。这些结果表明基于siRNA的抗SARS-CoV疗法对SARS治疗有效，具有高度的特异性和安全性。
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权利要求
1.一种分离的双链RNA分子，所述分子包含的第一链含有对应于SARS病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，包含的第二链含有与所述SARS病毒所述核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列，其中所述双链分子抑制所述SARS病毒所述核苷酸序列的表达。
2.权利要求1的RNA分子，其中所述第一链和第二链是单独的互补链。
3.权利要求1的RNA分子，其中所述第一链和第二链包含在单个分子中，其中所述单个分子包含环状结构。
4.任一前述权利要求的RNA分子，其中所述SARS病毒的核苷酸序列选自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
5.权利要求4的RNA分子，其中所述第一链包含选自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
6.一种检测样品中SARS病毒的方法，所述方法包括(a)使得自所述样品的RNA接触基因特异性引物，并通过逆转录合成第一链的cDNA分子，其中所述基因特异性引物包含的3′区与SARS序列互补，其包含的5′序列与SARS序列不互补；接着(b)使用一对引物以PCR扩增所述第一链的cDNA，其中第一个引物与所述基因特异性引物的所述5′区互补，其中第二个引物含有SARS基因组中所述基因特异性引物所述3′区识别区域上游的序列，以及(c)检测所述PCR的产物。
7.权利要求6的方法，其中所述基因特异性引物与SARS nsp1、nsp9或刺突蛋白序列互补。
8.权利要求7的方法，其中所述基因特异性引物含有选自以下的序列GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gac aac ctgctc ata aa、GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gag gatggg cat cag ca和GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATAgtg tta aaa cca gaa gg。
9.权利要求8的方法，其中所述第一个引物含有序列GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。
10.权利要求6的方法，其中所述第二个引物含有选自以下的序列GGG AAG TTC AAG GTT ACA AGA ATG TGA GAA、CGG TGTAAG TGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG和CCT TGA CCG GTGCAC CAC TTT TGA TGA TGT。
11.一种治疗或预防患者冠状病毒感染的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的含分离双链RNA分子的组合物，其中所述RNA分子含有的第一链包含对应于冠状病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，含有的第二链包含与所述冠状病毒所述核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列，其中所述双链分子抑制所述冠状病毒的所述核苷酸序列的表达。
12.权利要求11的方法，其中所述冠状病毒是SARS病毒。
13.权利要求12的方法，其中所述第一链和第二链是单独的互补链。
14.权利要求12的方法，其中所述第一链和第二链包含在单个分子中，其中所述单个分子包含环状结构。
15.权利要求12-13任一项的方法，其中所述SARS病毒的核苷酸序列选自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
16.权利要求15的方法，其中所述第一链包含选自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
17.权利要求15的方法，其中所述双链RNA分子含选自以下的序列SC2、SC5、SC14和SC15。
18.权利要求12的方法，其中所述双链RNA分子传递入所述患者的气道中。
19.权利要求18的方法，其中所述传递入所述气道中通过鼻内传递或通过传递入气管实现。
20.权利要求12的方法，其中所述组合物包含载体中的所述双链RNA分子，所述载体含无RNA酶的葡萄糖水溶液。
21.权利要求20的方法，其中所述葡萄糖溶液含约5％葡萄糖。
22.权利要求12的方法，其中所述双链RNA分子的剂量为1-100mg/kg所述患者体重。
23.权利要求12的方法，其中所述组合物作为无RNA的水溶液在气溶胶或粉末中传递。
24.一种治疗患者呼吸道疾病的方法，所述方法包括给予所述患者气道双链RNA分子，所述双链RNA分子含有的第一链包含对应于所述疾病相关基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列，含有的第二链包含与所述基因所述核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列，其中所述疾病相关基因在所述疾病中表现出不需要的高水平基因表达，其中所述双链分子抑制所述疾病所述相关基因的所述核苷酸序列的表达。
25.权利要求24的方法，其中所述疾病所述相关基因是病原生物基因。
26.权利要求25的方法，其中所述病原生物为细菌、病毒或真菌。
27.权利要求24的方法，其中所述疾病为自身免疫炎症或肺癌。
28.权利要求12的方法，其中使用至少两种双链RNA分子，所述双链RNA分子靶向SARS病毒的至少两种不同核苷酸序列。
29.权利要求28的方法，其中所述两种核苷酸序列选自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
全文摘要
本发明提供用于治疗严重急性呼吸道综合症(SARS)的组合物和方法。更具体地说，本发明描述了以呼吸道感染(包括SARS冠状病毒)为目标的核酸物质如siRNA分子及其类似物和其使用方法，用于临床治疗SARS、呼吸道病毒感染、用于生物防御所需的预防和治疗呼吸道感染、用于治疗呼吸道疾病以及用于开发呼吸道疾病和感染的治疗靶点。
文档编号A01N43/04GK1922330SQ200480017121
公开日2007年2月28日 申请日期2004年4月26日 优先权日2003年4月25日
发明者Q·Q·唐, P·Y·卢, F·Y·谢, Y·刘, J·徐, M·C·沃德尔 申请人:因特拉迪格姆公司