专利名称：氨基酸含量提高的转基因玉米种子的制作方法
技术领域：
本文公开的是氨基酸水平提高的转基因玉米种子、用以产生基因抑制性反义RNA环的重组DNA构建物以及制备和使用表达基因抑制性反义RNA环的这种构建物和转基因植物的方法。
背景某些植物与其他植物相比特定氨基酸水平较低，例如玉米的赖氨酸、甲硫氨酸和色氨酸水平较低。为提高转基因植物的氨基酸水平的努力包括以比天然基因更高的水平表达编码氨基酸合成途径中的蛋白质的重组DNA。一种这样的用以在玉米中产生水平提供的赖氨酸的基因是美国专利第5,288,300号(Glassman等)、第6,459,019号(Falco等)和专利申请公开U.S.2003/0056242 A1中公开的细菌二氢吡啶二羧酸合酶基因，所述专利每一个通过引用整体结合到本文中。一种使氨基酸水平更高的设想包括抑制编码氨基酸分解代谢途径中的蛋白质的基因。
基因抑制包括任何公知的用以抑制基因转录或对应于该基因的mRNA的积累以防止转录物被翻译成蛋白质的方法。更具体的说，美国专利第5,107,065号(Shewmaker等)和美国专利第5,759,829号(Shewmaker等)公开了通过插入带反义方向DNA的重组DNA构建物，调节植物细胞中的基因表达来介导的基因抑制。如Redenbaugh等在“Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr SavrTMTomato”，CRC Press，Inc.(1992)中所公开，用这种反义方向DNA构建物转化以抑制基因的植物可包含排列成反向重复序列的整合DNA，所述反向重复序列通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导转化将几个拷贝的转移DNA(T-DNA)共插入到植物中而产生。反向重复序列插入物可包含部分或全部T-DNA，例如含有完全或部分反义构建物的反向重复序列。当转化构建物是简单的反义DNA构建物时，对包含反向重复序列元件的插入DNA的筛选可提高鉴定对基因沉默有效的转化事件的效率。
美国专利第5,283,184号(Jorgensen等)和美国专利第5,231,020号(Jorgensen等)公开了通过插入带有义方向DNA的重组DNA构建物，调节植物的基因抑制来引发的基因抑制。如Jorgensen等，Mol.Gen.Genet.，207471-477(1987)所公开，在用这种有义构建物通过土壤杆菌转化的植物中，提供基因抑制的插入T-DNA主要组织成反向重复序列结构。另参见Stam等，The Plant Journal，1263-82(1997)和De Buck等，Plant Mol.Biol.46 433-445(2001)，他们采用分离研究支持了Jorgensen的发现，即在许多事件中基因沉默是通过多聚转基因T-DNA来介导的，其中T-DNA排列成反向重复序列。当用简单的有义方向DNA构建物转化时，对包含反向重复序列元件的插入DNA的筛选可提高基因沉默的效率。
例如Shewmaker等在美国专利第5,107,065号中所公开，基因沉默也可通过用两个单独的转录单位从有义和反义方向DNA转录RNA来实现，在所述专利的实施例1中制备了带有义和反义aroA基因的二元载体。国际申请WO 99/53050(Waterhouse等)中公开了类似的构建物。另参见美国专利第6,326,193号，在该专利中，基因导向DNA有效连接到相反(opposing)启动子。
通过提供能够产生可在其至少一部分长度上形成双链RNA的RNA的转化构建物，可在植物中实现基因抑制。EP 0426195 A1(Goldbach等)公开了植物的基因抑制，在该专利中，供转录成发夹RNA的重组DNA构建物为转基因植物提供了对烟草斑萎病病毒的抗性。另参见Sijen等，The Plant Cell，第8卷，第2277-2294页(1996)，其公开了将携有豇豆花叶病毒基因反向重复序列(有义序列紧接着反义序列)的构建物用于转基因植物中来介导病毒抗性。另参见国际公开98/53083(Grierson等)和相关的美国专利申请公开2003/0175965 A1(Lowe等)，它们公开了用包含5′UTR的反向重复序列和紧接着的基因编码序列的双链RNA构建物进行基因抑制。国际公开WO 99/53050(Waterhouse等)和国际公开WO 99/49029(Graham等)中也公开了通过靶基因的双链RNA用以在植物中进行转录后基因抑制的构建物。另参见美国专利申请公开2002/0048814 A1(Oeller)，在该专利中，DNA构建物被转录成带形成发夹的poly(T)-poly(A)尾的有义或反义RNA。另参见美国专利申请公开2003/0018993 A1(Gutterson等)，在该专利中，有义或反义DNA之后紧跟着NOS基因3′非翻译区的反向重复序列。另参见美国专利申请公开2003/0036197 A1(Glassman等)，在该专利中，用以减少靶mRNA表达的RNA包含与靶mRNA有同源性的部分和带与内源RNA不相关的互补RNA区域的部分。
美国专利第6,506,559号(Fire等)公开了在植物中产生dsRNA以抑制例如以植物为生的线虫中的基因表达。美国专利申请10/465,800(Fillatti)公开了供用于植物的多基因抑制载体。
转录抑制如启动子反式抑制可通过表达包含启动子的DNA构建物来实现，所述启动子有效连接到靶基因启动子DNA的反向重复序列。Mette等，The EMBO Journal，第18卷，第241-148页，(1999)和Mette等，The EMBO Journal，第19卷，第5194-5201页-148，(2000)公开了可用于这种由启动子反式抑制介导的基因抑制的构建物，这两篇文献通过引用结合到本文中。
公开了在植物中进行基因抑制的材料和方法的所有上述专利、专利申请和国际公开通过引用结合到本文中。
发明概述本发明提供氨基酸含量提高的转基因玉米种子。这种种仁中氨基酸含量提高的转基因玉米在其基因组中整合了重组DNA构建物，所述重组DNA构建物转录出能抑制氨基酸分解代谢途径中的蛋白质的产生的反义方向RNA。
在本发明的一个方面，所述种子具有用以抑制赖氨酸分解代谢途径的蛋白质(例如预聚物(pre-polymer)赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶)的编码基因的重组DNA。供抑制的有用蛋白质靶标是酮戊二酸还原酶。也可通过同时表达氨基酸合成途径中的基因，例如编码赖氨酸合成途径中的二氢吡啶二羧酸合酶的外源基因，来实现氨基酸含量的增加。因此，本发明还提供种子和方法，其中重组DNA用以抑制氨基酸分解代谢途径中的蛋白质，并表达(例如过量表达)氨基酸合成途径中的蛋白质。
本发明的另一个方面提供通过在发育的玉米种子中表达重组DNA构建物，来提高玉米种仁中的氨基酸含量(例如赖氨酸含量)的方法，所述重组DNA构建物用以抑制氨基酸分解代谢途径中的蛋白质的表达，并任选表达氨基酸合成途径中的蛋白质。
本发明的重组DNA构建物包含来自被靶向抑制的基因的反义方向DNA元件。所述构建物还包含转录与至少一部分反义方向RNA互补的RNA的有义方向DNA。在本发明的重组DNA构建物的一个优选方面，有义方向DNA元件比反义方向DNA元件要短，有义方向DNA元件所转录的有义方向RNA与反义方向DNA元件所转录的反义方向RNA的最5′部分互补。这种转录的RNA形成用以抑制氨基酸分解代谢途径中的至少一个靶蛋白质基因的反义方向RNA环。
重组DNA构建物包含与被转录成反义方向RNA(例如形成反义方向RNA环的反义方向RNA)的DNA有效连接的启动子(例如种子特异性启动子)。这种重组DNA可用于生产与对照玉米植物的子代种子相比氨基酸含量提高的玉米种子，所述对照玉米植物例如为野生型祖玉米植物或转基因玉米植物的负分离子，其中氨基酸分解代谢途径中的蛋白质的生产不被抑制。
在本发明的一个优选方面，种子特异性启动子是胚芽特异性启动子或胚乳特异性启动子，重组DNA构建物产生用以抑制赖氨酸分解代谢途径中的蛋白质(例如赖氨酸酮戊二酸还原酶和/或酵母氨酸脱氢酶)的编码基因的反义方向RNA。在本发明的另一个方面，在其基因组中进一步整合了表达氨基酸合成途径中的蛋白质(例如二氢吡啶二羧酸合酶)的重组DNA的转基因玉米中，氨基酸含量得以提高。因此，本发明的一个独特方面提供了使用重组DNA构建物的种子和方法，所述重组DNA构建物用以在植物中产生对赖氨酸酮戊二酸还原酶和/或酵母氨酸脱氢酶进行基因抑制的反义方向RNA环，以及用以表达编码二氢吡啶二羧酸合酶的外源基因。这种构建物以5′至3′顺序包含与反义方向DNA元件有效连接的种子特异性启动子元件、来自前体蛋白质赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶的编码基因的反义方向DNA元件和有义方向DNA元件。有义方向DNA元件比反义方向DNA要短，有义方向DNA元件所转录的有义方向RNA与反义方向DNA元件所转录的反义方向RNA的最5′区段互补。所述DNA元件转录成的RNA形成反义方向RNA环，用以抑制编码赖氨酸酮戊二酸还原酶的天然基因的表达。
附图简述
图1是可在本发明中用以产生反义方向RNA环的重组DNA构建物的示意图。
图2是说明用本发明构建物进行的基因抑制的蛋白质印迹分析。详述SEQ ID NO1是用于转录RNA的重组DNA构建物的核苷酸序列，所述RNA可形成用以抑制转基因植物中一个或多个基因的反义方向RNA环。有关各元件的描述见表1。
本文所用的“互补”指由于允许C-G和A-T或A-U键合的比对核苷酸的互补性而能够杂交的多核苷酸，例如DNA的有义链和反义链或者RNA的自身互补链。
本文所用的“载体”指能够在宿主细胞中复制的DNA分子和/或另一个DNA区段可与其有效连接以使被连接区段得以复制的DNA分子。质粒是代表性的载体。
本文所用的“转基因”生物(例如植物或种子)是其基因组已通过整合包含外源遗传物质或天然遗传物质额外拷贝的重组DNA而加以改变的生物，例如通过转化或重组所述生物或祖生物。转基因植物包括衍生自转化过程的原始植物的子代植物，包括将转基因植物与野生型植物或其他转基因植物育种得到的子代。在本发明中具有特殊意义的庄稼植物包括但不限于玉米、大豆、棉花、卡诺拉(油菜)、小麦、水稻、向日葵、红花和亚麻。其他有意义的作物包括生产蔬菜、水果、草和木的植物。
用于植物转化的重组DNA构建物用以在转基因植物中产生成环反义RNA基因抑制剂的重组DNA构建物可由本领域技术人员容易地制备出来。通常，这种DNA构建物最少包含在被靶向抑制的组织中有活性的启动子、其序列与被靶向抑制基因的核苷酸序列互补的可转录DNA元件以及转录终止子元件。被拷贝用于基因抑制构建物中可转录DNA中的被靶向基因元件可为启动子元件、内含子元件、外显子元件、5’UTR元件或3’UTR元件。尽管认为从被靶向抑制基因的序列拷贝的DNA其最小大小为约21或23个核苷酸，但优选更大的核苷酸区段，例如最大达被靶向基因的全长。DNA元件可包含基因的多个部分，例如与UTR、外显子和内含子的连续或分离基因元件互补的核苷酸。这种构建物还可按需包含其他调节元件，编码转运肽、信号肽、选择性标记和可筛选标记的DNA。为形成反义方向RNA环，互补的DNA元件宜不超过反义方向DNA元件的约二分之一长度，常常不超过所述反义方向DNA元件的三分之一长度，例如不超过所述反义方向DNA元件的四分之一长度。各DNA元件组合在一起的总长度可不同。例如，反义方向DNA元件可由500-5000个核苷酸组成，互补DNA元件可由50-500个核苷酸组成。
可设计反义转录单位，以抑制多个基因，其中所述DNA排列为两个或更多个来自不同被靶向抑制基因的反义方向元件，其后是互补的有义方向元件，例如与至少最5′部分的反义元件互补)。
图1示意说明了包含启动子元件、反义方向DNA元件(标示为“a/sDNA”)、互补的有义方向DNA元件(标示为“s DNA”)和提供聚腺苷酸化信号和位点的DNA(标示为“polyA位点”)的重组DNA构建物。所述DNA构建物被转录成包含反义方向RNA区段和与反义方向RNA区段的最5′末端互补的互补RNA区段的RNA。反义RNA的5′和3′末端可自身杂交，形成能闭合成反义方向RNA环的双链RNA区段。例如，如果被转录的反义方向DNA链的最5′末端的核苷酸序列是5′-CGGCATA---，则被转录的反向重复DNA链的最3′末端的序列将是---TATGCCG-3′，其可容易地从提供反义元件的源DNA克隆。有了这种序列，反义方向RNA环将从dsRNA区段的一侧延伸，例如5′-GCCGUAU--------3′-CGGCAUA--------反义方向DNA及其自身互补DNA可为连续的，或被载体DNA所分开，例如最长约100个核苷酸左右的载体DNA分开用于载体装配的限制位点。
重组DNA构建物可用本领域普通技术人员公知的市售材料和方法来装配。一种用以构建转化用DNA构建物和载体的有用技术是GATEWAYTM克隆技术(可获自Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，美国加州)，该技术使用来自λ噬菌体载体构建物的整合酶att系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，而不是限制性内切核酸酶和连接酶。LR克隆反应公开于美国专利第5,888,732号和第6,277,608号，美国专利申请公开2001283529、2001282319和20020007051，所有这些专利通过引用结合到本文中。同样由Invitrogen提供的GATEWAYTM克隆技术操作说明书还给出了有关将任何所需DNA常规克隆到包含可操作植物表达元件的载体中的简要指导。
另一种载体构建方法采用Aslanidis，C.等Nucleic Acids Res.，18，6069-6074，1990和Rashtchian，A.等，Biochem.，206，91-97，1992所公开的不依赖于连接反应的克隆法，其中将带单链5′和3′末端的DNA片断连接到所需的载体中，然后可在体内扩增载体。
文献中已描述了多种在植物细胞中有活性的启动子。这些启动子包括存在于植物基因组中的启动子以及来自其他来源的启动子，包括根瘤土壤杆菌(Agrobacteriurn tumefaciens)的肿瘤诱导性质粒上携带的胭脂氨酸合酶(nos)启动子和章鱼氨酸合酶(ocs)启动子，花椰菜花叶病毒(caulimovirus)启动子如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)或玄参花叶病毒启动子。例如，参见美国专利第5,322,938和5,858,742号，其公开了衍生自花椰菜花叶病毒(CaMV35S)的组成型启动子版本；美国专利第5,378,619号，其公开了玄参花叶病毒(FMV)35S启动子；美国专利第5,420,034号，其公开了油菜籽蛋白启动子；美国专利第6,437,217号，其公开了玉米RS81启动子；美国专利第5,641,876号，其公开了水稻肌动蛋白启动子；美国专利第6,426,446号，其公开了玉米RS324启动子；美国专利第6,429,362号，其公开了玉米PR-1启动子；美国专利第6,232,526号，其公开了玉米A3启动子；美国专利第6,177,611号，其公开了组成型玉米启动子；美国专利第6,433,252号，其公开了玉米L3油质蛋白启动子；美国专利第6,429,357号，其公开了水稻肌动蛋白2启动子和内含子；美国专利第5,837,848号，其公开了根特异性启动子；美国专利第6,084,089号，其公开了冷可诱导启动子；美国专利第6,294,714号，其公开了光可诱导启动子；美国专利第6,140,078号，其公开了盐可诱导启动子；美国专利第6,252,138号，其公开了病原体可诱导启动子；美国专利第6,175,060号，其公开了磷缺乏可诱导启动子；美国专利第6,635,806号，其公开了coixin启动子；U.S.2002/0192813 A1，其公开了可用于设计有效的植物表达载体的5′，3′元件和内含子元件；U.S.2004/0216189 A1，其公开了玉米叶绿体醛缩酶启动子和U.S.2004/0123347 A1，其公开了水分亏缺可诱导启动子，所有这些专利通过引用结合到本文中。这些和其他多种在植物细胞中有功能的启动子是本领域技术人员公知的，可供用于本发明的重组多核苷酸中，以便在转基因植物细胞中表达所需的基因。
此外，可改变启动子，使其含有多个“增强子序列”，以帮助提高基因表达。这种增强子是本领域公知的。通过将增强子序列包含于这种构建物中，可增强选定的蛋白质的表达。这些增强子常见于在真核细胞中有功能的启动子中转录起点的5′，但常可插入到编码序列的上游(5′)或下游(3′)。在某些情况下，这些5′增强元件是内含子。水稻肌动蛋白1基因(参见美国专利第5,641,876号)和水稻肌动蛋白2基因的5′内含子、玉米醇脱氢酶基因内含子、玉米热激蛋白70基因内含子(美国专利第5,593,874号)和玉米皱缩1基因作为增强子特别有用。
在本发明的其他方面，需要在植物种子组织中有足够的表达，以实现种子组成的改进。用于种子组成改进的代表性启动子包括来自种子基因的启动子，如来自油菜籽蛋白(U.S.5,420,034)、玉米L3油质蛋白(U.S.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等(1997)Transgenic Res.6(2)157-166)、球蛋白1(Belanger等(1991)Genetics 129863-872)、谷蛋白1(Russell(1997)出处同上)和过氧化物氧还蛋白抗氧化剂(Perl)(Stacy等(1996)Plant Mol Biol.31(6)1205-1216)的基因。
根据本发明制备的重组DNA构建物往往包括通常含有聚腺苷酸化信号和位点的3′元件，尤其是当打算将重组DNA用于蛋白质表达以及基因抑制时。公知的3′元件包括例如U.S.6,090,627(其通过引用结合到本文中)所公开的来自根瘤土壤杆菌基因如nos 3′、tml 3′、tmr 3′、tms 3′、ocs 3′、tr7 3′的3′元件；来自植物基因如小麦(Triticum aesevitum)热激蛋白17(Hsp17 3′)基因、小麦遍在蛋白基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β-微管蛋白基因的3′元件，所有这些植物基因均公开于美国专利申请公开2002/0192813 A1(其通过引用结合到本文中)；以及豌豆(Pisum sativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs 3′)；还有来自宿主植物当中的基因的3′元件。
基因抑制性重组DNA构建物也可与赋予其他具有农学意义的性状的DNA一起叠加(stack)，包括提供除草剂抗性或昆虫抗性的DNA，如用来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)的基因来提供对鳞翅目昆虫、coliopteran、同翅目昆虫、半翅目昆虫和其他昆虫的抗性。植物中对其抗性有用的除草剂包括草甘磷除草剂、膦丝菌素除草剂、oxynil除草剂、咪唑啉酮除草剂、二硝基苯胺除草剂、吡啶除草剂、磺酰脲除草剂、双丙氨酰膦除草剂、磺胺除草剂和草铵膦除草剂。本领域普通技术人员通过参考美国专利申请公开2003/0106096 A1和2002/0112260 A1及美国专利第5,034,322号；第5,776,760号；第6,107,549号和第6,376,754号，能够提供叠加性状，对于昆虫/线虫/病毒抗性，参考美国专利第5,250,515号；第5,880,275号；第6,506,599号；第5,986,175号和美国专利申请公开2003/0150017 A1，以上所有专利通过引用结合到本文中。
转化方法-有多种用重组DNA转化植物细胞的方法是本领域公知的，它们可用于本发明中。两种常用的植物转化方法是土壤杆菌介导转化和微粒轰击。微粒轰击方法阐述于美国专利第5,015,580号(大豆)；第5,550,318号(玉米)；第5,538,880号(玉米)；第5,914,451号(大豆)；第6,160,208号(玉米)；第6,399,861号(玉米)和第6,153,812号(小麦)，土壤杆菌介导转化描述于美国专利第5,159,135号(棉花)；第5,824,877号(大豆)；第5,591,616号(玉米)和第6,384,301号(大豆)，以上所有专利通过引用结合到本文中。对于基于根瘤土壤杆菌的植物转化系统，存在于转化构建物上的另外元件包括T-DNA左缘和右缘序列，用以促进重组多核苷酸掺入到植物基因组中。
一般来说，将重组DNA随机(即在非特异性位置)引入到靶植物系的基因组中是有用的。在特殊的情况下，对重组DNA插入进行导向以便实现位点特异性整合，例如以便取代基因组中的现有基因，以便使用植物基因组中的现有启动子，或者以便在已知对于基因表达有活性的预定位点插入重组多核苷酸，这是有用的。存在几种已知使插入物有功能的位点特异性重组系统，包括美国专利第4,959,317号所公开的cre-lox和美国专利第5,527,695号所公开的FLP-FRT，所述两个专利通过引用结合到本文中。
本发明的转化方法优选在控制环境下在培养基上的组织培养物中实施。“培养基”指用以在体外(即在完整活生物的外部)生长细胞的多种营养物混合物。受体细胞靶标包括但不限于分生细胞、愈伤组织、未成熟胚芽和和配子细胞如小孢子、花粉、精子和卵细胞。设想可将任何可从中再生出能育植物的细胞用作受体细胞。愈伤组织可从组织来源引起，包括但不限于未成熟胚芽、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖成愈伤组织的细胞也是遗传转化的受体细胞。用以产生本发明转基因植物的实用转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚芽的转化和随后能育转基因植物的再生，公开于美国专利第6,194,636号和第6,232,526号，这两个专利通过引用结合到本文中。
转基因植物种子可从能育转基因植物收获，并用来生长本发明的转化植物(包括杂交植物)的子代，以筛选农学性状增强的植物。除了直接用重组DNA转化植物外，也可通过使具有重组DNA的第一植物与缺乏该DNA的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将重组DNA引入到易于转化的第一植物系中，产生转基因植物，后者可与第二植物系杂交，以将重组DNA渐渗到第二植物系中。带有能使农学性状增强(例如产量提高)的重组DNA的转基因植物可与带有能赋予别的性状(例如除草剂抗性或害虫抗性)的其他重组DNA的转基因植物系杂交，以产生带有能赋予两种性状的重组DNA的子代植物。通常，在这种针对组合性状的育种中，供给附加性状的转基因植物是雄性系，携带基础性状的转基因植物是雌性系。这种杂交的子代将分离，这样有些植物将携带产生两种亲代性状的DNA，有些将携带产生一种亲代性状的DNA；这种植物可通过与亲代重组DNA有关的标记来鉴定。可将携带产生两种亲代性状的DNA的子代植物多次回交到雌性亲代系，例如通常6-8代，以产生除具有另一种转基因亲代系的重组DNA外具有与一种原始转基因亲代系基本相同的基因型的子代植物。
在转化的实施中，通常在任何一个转化实验中都只是将DNA引入到一小部分靶细胞中。用标记基因来提供有效的鉴定系统，以鉴定出通过接受和整合转基因DNA构建物到其基因组中而得到稳定转化的细胞。优选的标记基因提供能赋予对选择剂(如抗生素或除草剂)的抗性的选择性标记。本发明植物可对其有抗性的任何除草剂都是有用的选择性标记选择剂。可将潜在转化的细胞暴露于选择剂。在存活细胞群体中将有这样的细胞，通常其中整合有抗性赋予基因并以足够的水平表达，以允许细胞存活。可对细胞作进一步的测试，以确认外源DNA的稳定整合。常用的选择性标记基因包括赋予对抗生素如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4)或者除草剂如草铵膦(bar或pat)和草甘磷(aroA或EPSPS)的抗性的基因。这种选择性标记的实例在美国专利第5,550,318号；第5,633,435号；第5,780,708号和第6,118,047号中有说明，所有这些专利通过引用结合到本文中。也可采用提供目视鉴定转化体的能力的可筛选标记，例如表达有色或荧光蛋白质如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基因，或者表达已知有多种显色底物的β-葡糖醛酸酶的基因或uidA基因(GUS)。
可在再生培养基中培养暴露于选择剂而存活的细胞或者在筛选试验中被评为阳性的细胞，并让它们成熟为植物。将可发育的小植物转移到植物生长混合液(mix)中，在例如相对湿度约为85％、CO2600ppm、光照25-250微爱因斯坦m-2s-1的环境控制箱中锻炼(harden)，然后再转移到温室或生长箱中以待成熟。取决于起始的组织，鉴定出转化体后，使植物再生约6周至10个月。可用本领域技术人员公知的常规植物育种方法对植物授粉以产生种子，例如转基因玉米常用自花传粉。可针对重组DNA的表达测试再生的转化植物或其子代种子或植物，并针对是否存在农学性状增强进行筛选。
转基因植物和种子使本发明提供的转基因植物种子生长，以产生与对照植物相比性状增强的转基因植物。这种农学性状增强的植物的种子可通过筛选转化植物或后代种子的增强性状来鉴定。出于效率考虑，设计筛选方案，以评估包含重组DNA的多个转基因植物(事件)，例如2-20个或更多的转基因事件的多个植物。
从本文提供的转基因种子生长出的转基因植物显示能导致产量增加的改进农学性状或能使植物价值提高的其他性状，所述植物价值包括例如种子质量提高，如某些氨基酸(例如赖氨酸)水平提高。
许多可存活到能产生种子和后代植物的能育转基因植物的转基因事件可能不显示增强的农学性状。有必要通过针对增强的性状和对其他农学性状的最小影响评估转基因植物，来进行筛选，以从按本文所述进行转化的植物群体中鉴定出农学性状增强的转基因植物。这些试验也可采取多种形式，包括但不限于检测植物化学组成、生物量、生理特性和形态的变化的各种分析。
本发明的方法为本领域普通技术人员提供了用以设计重组DNA构建物、培育转基因植物、筛选种子中氨基酸水平提高和对其他农学性状的不利影响最小的手段，以提供本发明的转基因种子。这种种子可用来生产其基因组中整合了重组DNA构建物的转基因玉米植物，所述重组DNA构建物转录出能抑制氨基酸分解代谢途径中的蛋白质的水平的反义方向RNA。
以下实施例说明本发明的各方面。
实施例1本实施例说明可用来将本发明的重组DNA构建物插入到转基因植物中以实施本发明方法的转化载体的制备。
LKR/SDH基因编码赖氨酸分解代谢途径中的酶——赖氨酸酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶(SDH)的前体蛋白质。LKR的抑制由赖氨酸含量的改变(例如提高)来证明。LKR的抑制通过在植物中表达重组DNA构建物来实现，所述重组DNA构建物能产生从反义方向LKR DNA和有义方向LKR DNA转录而来的稳定化反义RNA，所述反义RNA形成反义方向RNA环。制备包含在根瘤土壤杆菌右缘和左缘之间的两个转录单位的转化载体。一个用于标记的转录单位包含(a)水稻肌动蛋白启动子和水稻肌动蛋白内含子的DNA，(b)拟南芥(Arabidopsis)EPSPS叶绿体转运肽的DNA，(c)根瘤土壤杆菌aroA(草甘磷抗性标记)的DNA，(d)根瘤土壤杆菌NOS终止子的DNA，另一个用于LKR基因抑制的转录单位包含(a)玉米(Zea mays)GLB1启动子的DNA，(b)玉米ADH1内含子的DNA，(c)玉米LKR的反义方向DNA片断，(d)玉米LKR的有义方向DNA片断，(e)玉米GLB1终止子的DNA，SEQ ID NO1是包含上述标记转录单位和基因抑制转录单位的转化载体的DNA序列。有关SEQ ID NO1当中所包含的转化载体各元件的描述见下表1。
表1
用由表1所列元件制备的载体用于转化玉米植物组织。转基因玉米植物通过土壤杆菌介导转化获得。使得自两个单独的转基因插入事件的转基因植物生长，以产生F1种子。分析每个事件的六颗成熟种子，以确定转化成功和LKR被抑制。将成熟的转基因种子切成碎片，提取蛋白质进行蛋白质印迹分析。参考图2，得自一个事件的种子与野生型相比不显示LKR降低；而得自另一个事件的种子显示发生分离(1∶1半合子∶野生型)，因为六颗种子中有三颗与野生型相比显示实质上的LKR降低。
实施例2本实施例说明赖氨酸增高的转基因玉米。实施例1制备的转化载体通过插入包含种子特异性启动子的转录单位进行修饰，所述启动子有效连接到编码二氢吡啶二羧酸合酶的DNA。更具体的说，所述转录单位包含玉米球蛋白1启动子(bp 48-1440；Kriz，Biochem.Genet.27239-251，1989；Belanger和Kriz，Genetics，129863-872，1991及美国专利第6329574号)、水稻肌动蛋白1内含子(bp 1448-1928；McElroy等，Plant Cell，2163-171，1990)、玉米DHDPS叶绿体转运肽(bp 1930-2100；Frisch等，Mol.Gen.Genet.，228287-293，1991)、棒杆菌(Corynebacterium)DHDPS基因(bp 2101-3003；Bonnassie等，NucleicAcids Research，186421，1990；Richaud等，J.Bacteriol.，166297-300，1986)、玉米球蛋白13′非翻译区(bp 3080-4079；Belanger和Kriz，1991)的DNA。用以抑制赖氨酸酮戊二酸合酶和表达二氢吡啶二羧酸合酶的启动子相邻，以向相反的方向转录RNA。从转基因植物生产出的玉米与典型玉米中基本不含赖氨酸相比，赖氨酸水平更高，例如在3000-4000ppm的范围内。
可按以上公开内容的指导，不必进行过多实验即可制备和使用本文所公开和要求保护的所有材料和方法。虽然本发明的材料和方法已用优选实施方案和说明性实施例进行了描述，但本领域技术人员显而易见的是，可不背离本发明的概念、精神和范围，对本文描述的材料和方法进行各种改变。所有这种对本领域技术人员显而易见的类似替代和修改视为落入后附权利要求书所定义的本发明精神、范围和概念之内。
序列表<110>Malvar，ThomasHuang，ShihshiehLuethy，Michael<120>氨基酸含量提高的转基因玉米种子<130>38-15(53490)B<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>8296<212>DNA<213>人工<220>
<223>质粒中土壤杆菌各缘之间的重组DNA构建物<400>1ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga 60caatctgatc cccatcaagc ttactcgagg tcattcatat gcttgagaag agagtcggga120tagtccaaaa taaaacaaag gtaagattac ctggtcaaaa gtgaaaacat cagttaaaag180gtggtataaa gtaaaatatc ggtaataaaa ggtggcccaa agtgaaattt actcttttct240actattataa aaattgagga tgtttttgtc ggtactttga tacgtcattt ttgtatgaat300tggtttttaa gtttattcgc ttttggaaat gcatatctgt atttgagtcg ggttttaagt360tcgtttgctt ttgtaaatac agagggattt gtataagaaa tatctttaga aaaacccata420tgctaatttg acataatttt tgagaaaaat atatattcag gcgaattctc acaatgaaca480ataataagat taaaatagct ttcccccgtt gcagcgcatg ggtatttttt ctagtaaaaa540taaaagataa acttagactc aaaacattta caaaaacaac ccctaaagtt cctaaagccc600aaagtgctat ccacgatcca tagcaagccc agcccaaccc aacccaaccc agcccacccc660agtccagcca actggacaat agtctccaca cccccccact atcaccgtga gttgtccgca720
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1.一种用以生产氨基酸含量提高的转基因玉米的种子，所述种子在其基因组中整合了转录反义方向RNA的重组DNA构建物，所述RNA抑制氨基酸分解代谢途径中的蛋白质的产生，其中所述重组DNA包含有效连接到被转录成所述RNA的DNA的种子特异性启动子，且其中所述种子与其中所述蛋白质的产生不被抑制的对照玉米植物的后代种子相比，氨基酸含量提高。
2.权利要求1的种子，其中所述被转录成所述RNA的DNA包含反义方向DNA元件和有义方向DNA元件，其中有义方向DNA元件比反义方向DNA元件要短，其中有义方向DNA所转录的有义方向RNA与反义方向DNA元件所转录的反义方向RNA的最5′末端互补，其中所述转录RNA形成反义方向RNA环用以抑制所述氨基酸分解代谢途径中的蛋白质。
3.权利要求1的种子，其中所述种子特异性启动子是胚芽特异性启动子或胚乳特异性启动子。
4.权利要求1的种子，其中所述重组DNA构建物产生用以抑制赖氨酸分解代谢途径中的蛋白质的编码基因的RNA。
5.权利要求4的种子，其中所述赖氨酸分解代谢途径中的蛋白质是赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶或两者。
6.权利要求1的种子，所述种子其基因组中进一步整合了表达氨基酸合成途径中的蛋白质的重组DNA。
7.权利要求6的种子，其中所述氨基酸合成途径中的蛋白质是二氢吡啶二羧酸合酶。
8.权利要求3的种子，其中所述氨基酸是赖氨酸，所述氨基酸分解代谢途径中的蛋白质是赖氨酸酮戊二酸还原酶，所述氨基酸合成途径中的蛋白质是二氢吡啶二羧酸合酶。
9.一种用以在植物中产生基因抑制用反义方向RNA环的重组DNA构建物，其中所述构建物以5′至3′顺序包含与反义方向DNA元件有效连接的种子特异性启动子元件和有义方向DNA元件，其中所述有义方向DNA元件比反义方向DNA元件短，其中有义方向DNA所转录的有义方向RNA与反义方向DNA元件所转录的反义方向RNA的最5′区段互补，其中所述DNA元件被转录成能形成反义方向RNA环的RNA，所述RNA用以抑制至少一个基因的表达；其中所述被靶向抑制的基因表达赖氨酸酮戊二酸还原酶。
10.一种提高玉米种子中的赖氨酸水平的方法，所述方法通过在发育的玉米种子中表达权利要求9的重组DNA构建物来进行。
11.一种生产氨基酸水平提高的玉米种子的方法，所述方法包括从转基因种子生长玉米植物，所述转基因种子的基因组中整合了用以抑制氨基酸分解代谢途径中的蛋白质的表达的重组DNA构建物，其中所述重组DNA构建物包含种子特异性启动子，所述种子特异性启动子有效连接到被转录成与所述蛋白质的信使RNA互补的反义方向RNA的DNA，且其中所述转基因玉米与其中所述蛋白质不被抑制的对照玉米植物相比其种仁中氨基酸含量提高。
12.权利要求11的方法，其中所述重组DNA构建物以5′至3′顺序包含与反义方向DNA元件有效连接的所述种子特异性启动子元件和有义方向DNA元件，其中所述有义方向DNA元件比所述反义方向DNA元件短，其中有义方向DNA所转录的有义方向RNA与反义方向DNA元件所转录的反义方向RNA的最5′区段互补，且其中所述DNA元件被转录成能形成反义方向RNA环的RNA，所述RNA用以抑制所述蛋白质的表达。
13.权利要求12的方法，其中所述种子特异性启动子是胚芽特异性启动子和胚乳特异性启动子。
14.权利要求12的方法，其中所述重组DNA构建物产生用以抑制赖氨酸分解代谢途径中的蛋白质的表达的RNA。
15.权利要求14的方法，其中所述赖氨酸分解代谢途径中的蛋白质是赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶或两者。
16.权利要求12的方法，其中所述种子的基因组中进一步整合了表达氨基酸合成途径中的蛋白质的重组DNA。
17.权利要求16的方法，其中所述氨基酸合成途径中的蛋白质是二氢吡啶二羧酸合酶。
18.权利要求12的方法，其中所述氨基酸是赖氨酸，所述氨基酸分解代谢途径中的蛋白质是赖氨酸酮戊二酸还原酶，所述氨基酸合成途径中的蛋白质是二氢吡啶二羧酸合酶。
全文摘要
通过从以5′至3′顺序包含与反义方向DNA元件有效连接的启动子元件和互补DNA元件的重组DNA构建物转录，在转基因生物(例如植物)的细胞中产生反义方向RNA环形式的反义方向RNA基因抑制剂。
文档编号A01H5/00GK1942580SQ200580012014
公开日2007年4月4日 申请日期2005年2月10日 优先权日2004年2月10日
发明者T·M·马尔瓦, 黄士杰, M·H·吕蒂 申请人:孟山都技术有限公司