专利名称：：中药青蒿的一种组织培养快速繁殖方法
技术领域：
：本发明涉及植物的繁殖方法，特别涉及中药青蒿(^^m&fl朋，aL.)的一种组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
：从中药青蒿C4WemWfl朋"waL.)中分离得到的抗疟疾有效单体青蒿素，是第一个由我国科学家自主发明并得到全球认可的药物。以青蒿素为基础开发出的抗疟疾药物受到世界卫生组织(WHO)的高度重视。疟疾是当今世界上流行最广，发病率及死亡率最高的热带寄生虫传染病。据世界卫生组织近年统计报告目前全世界有29亿人生活居住在疟疾流行区，每年发病人数3-5亿，死亡人数200-300万，在非洲疟疾己成为头号杀手。为了控制疟疾的蔓延，世界卫生组织强烈推荐以青蒿素为基础的综合治疗(artemisinin陽basedcombinationtherapies,ACTs)，国际市场只寸青蒿类抗疙药需求猛增，这给我国的青蒿素产业带来了机会。目前世界上青蒿素的生产是用种子繁殖中药青蒿，从中药青蒿植株中直接提取青蒿素。中药青蒿虽然分布很广，但是天然中药青蒿中青蒿素含量过低(0.7%以下)。由于中药青蒿自交不亲和的特性，通过种子繁殖的中药青蒿后代在形态上存在明显的差异，青蒿素含量变化也很大，且平均含量有下降的趋势，所以人工栽培时很难得到遗传稳定的高产群体。通过基因工程技术获得的高产中药青蒿株系在推广应用时，也存在着如何保持遗传稳定性的问题。这些问题致使青蒿素的市场价格偏高，严重地限制了青蒿素类药物在贫穷落后的疟疾高发区的推广使用，降低青蒿素类药物成本的关键是提高中药青蒿中青蒿素的含量。
发明内容本发明的目的是提供中药青蒿"Wem^aa朋wL.)的一种组织培养快速繁殖方法。本发明所提供的中药青蒿组织培养快速繁殖方法，是将中药青蒿的顶芽或腋芽在初代培养基中培养，得到无菌苗；所述初代培养基为在MS培养基中添加6-BA和GA得到的培养基，所述6-BA的终浓度为0.1-2.0毫克/升，所述GA的终浓度为0.2-2.0毫克/升。其中，所述6-BA的终浓度优选为0.5毫克/升；所述GA的终浓度优选为1.0毫克/升。所述方法中还包括将所述无菌苗进行继代繁殖的步骤。所述继代繁殖所用的培养基可为在MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，所述6-BA的终浓度可为0.5-2.0毫克/升、优选为1.5毫克/升，所述NAA的终浓度可为0.1-0.5毫克/升、优选为0.2毫克/升。上述方法中还包括将所述无菌苗进行生根培养的步骤。所述生根培养所用的培养基为在MS培养基中添加IBA得到的培养基，所述IBA的终浓度为0.2-1.0毫克/升，优选为0.5毫克/升。所述方法中的培养条件可为在22-30°C，优选为25°C;每天14-16小时光照、8-10小时黑暗光照条件培养，优选为16小时光照、8小时黑暗的光照条件培养，所述光照强度为1500-2500lx，优选为2000lx。本发明以中药青蒿顶芽和腋芽为外植体，利用其专用培养基，开辟了一种快速繁殖中药青蒿并保持亲本植物遗传特性的新方法。本发明方法具有以下优点取材容易，极易获得无菌材料，变异率低、增值系数高，4周增殖倍数能达到56倍，组培苗生根率达到93%以上，移栽成活率高达95%以上，具有很强的工厂化生产能力。利用本发明的方法繁殖高产中药青蒿株系，可使后代的高青蒿素含量稳定，从而提高青蒿素的产量。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。图1为中药青蒿组织培养繁殖的试管苗和对照实生苗在大田栽培条件下的形态比较图2为中药青蒿组织培养繁殖的试管苗和对照实生苗的青蒿素含量比较具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所用的MS培养基的组成如表1所示表lMS培养基组成<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例l、组织培养快速繁殖中药青蒿一、培养基的配制和灭菌初代培养基MS+6-BA0.5mg/L+GA1.0mg/L。增殖培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L。生根培养基MS+IBA0.5mg/L。以上培养基121.3。C下,灭菌20分钟。二、初代培养取中药黄花蒿"rfe肌'w's3朋mL.)植株的顶芽或腋芽，用70%(体积百分含量)的酒精浸润l分钟，再放入0.1%(质量百分含量)的升汞溶液中灭菌5-10分钟，无菌水冲洗3次后，将顶芽或腋芽转入装有初代培养基的三角瓶(容量250ml)中，每个三角瓶中外植体个数为5个。在下述培养条件下进行培养25°C，每天16小时光照、8小时黑暗的光照条件，光照强度为2000lx。顶芽接种10个，腋芽接种20个。培养4周时，该30个芽均长出5-6个节的无菌苗，该30株无菌苗的高度为5.0-7.0cm，节间长度为0.8-1.2cm。每一株无菌苗为一个株系。三、继代培养取上述30个株系中的25个株系进行继代繁殖，具体方法如下将长出5-6个节的无菌苗剪成茎段，每个茎段带有一个顶芽或一个腋芽，茎段长0.8-1.2cm。将上述茎段接种于增殖培养基中进行培养，培养条件同步骤二。上述茎段中，每个株系带顶芽的茎段各接种1个，带腋芽的茎段各接种4个。培养4周时，每个茎段均长出5-6个节的无菌苗。该无菌苗再按照上述方法每4周继代一次，共继代5次。每次继代中，每个茎段均长出5-6个节的无菌苗，无菌苗的高度为5-7cm，节间长度为0.8-1.2cm。故繁殖系数为5-6。四、生根培养将上述25个株系继代5次的中药青蒿无菌苗，转接到MS基本培养基壮苗培养10天，培养条件同步骤二。将壮苗后的无菌苗转入生根培养基生根培养10天，培养条件同步骤二，得到试管苗，每个株系试管苗的根长3-5cm。其中，每个株系各取1000株进行上述生根培养，结果这25个株系分别有982、991、983、987、999、989、988、989、999、996、980、978、987、992、985、988、990、982、988、992、990、991、987、993、999株生根。该25个株系的生根率为98.2-99.9%。五、试管苗移栽及管理将步骤四所有生根的试管苗先在培养室里开盖锻炼3天，然后从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽到6x6厘米的营养钵中。移栽用的土壤为地疏松，保水性好的土壤，装钵前，用浓度为0.1%的多菌灵进行拌土。移栽后的前3天，大棚的相对空气湿度保持在90-100%。之后，进行浇水、施肥和除草等正常管理。经过3周，苗木高度达到8-10cm，移栽到大田。结果25个株系的移栽成活率(移栽成活率=营养钵中成活的株数/生根的试管苗株数)分别为950、956、976、967、958、973、978、953、968、971、966、962、958、954、970、960、965、959、955、956、963、958、955、965、966。该25个株系的移栽成活率为95.0-97.1%。六、组织培养繁殖的中药青蒿株系的形态和青蒿素的含量测定将步骤五中移栽至大田的幼苗定期进行浇水、施肥和除草等正常管理，培养至生殖生长初期。观察植株形态、测定青蒿素的含量。其中，该25个株系每个株系各测定20株的青蒿素含量。将步骤二中取完外植体的那株母株进行正常培养至种子成熟，收获种子，将该种子作为F,代。每粒种子一个株系，将其中的24个株系在与上述组培苗相同的条件下培养至生殖生长初期。观察植株形态、测定青蒿素的含量。其中，青蒿素含量的测定方法如下取中药青蒿叶片，在50。C下烘干致恒重，研成均匀粉末。准确称量l克干粉，用30ml石油醚(30-60°C)提取2次，减压回收溶剂后，用lml甲醇溶解提取物，通过紫外分光光度计测定青蒿素含量。青蒿素含量(％)=(样品中青蒿素重量/样品重量)xioo。组培苗的田间生长状况如图1A所示，实生苗的田间生长状况如图1B所示，结果表明，中药青蒿组织培养繁殖的试管苗，在大田栽培条件下，表现出形态均匀一致的特性；而中药青蒿实生苗形态上有明显的差异。组培苗的青蒿素测定结果如图2A所示，实生苗的青蒿素测定结果如图2B所示。结果表明，中药青蒿试管苗不同株系的青蒿素含量比较一致，为1.12%±0.23%;中药青蒿实生苗不同株系的青蒿素含量差异很大，为0.84%±0.45%。实施例2、组织培养快速繁殖中药青蒿一、培养基的配制和灭菌初代培养基MS+6-BA0.1mg/L+GA0.2mg/L。增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。生根培养基MS+IBA0.2mg/L。以上培养基121.3。C下，灭菌20分钟。二、初代培养取中药黄花蒿朋/7ML.)的顶芽或腋芽,用70%(体积百分含量)的酒精浸润l分钟，再放入0.1%(质量百分含量)的升汞溶液中灭菌5-10分钟，无菌水冲洗3次后，将顶芽或腋芽转入装有初代培养基的三角瓶(容量250ml)中，每个三角瓶中外植体个数为5个。在下述培养条件下进行培养22°C，每天14小时光照、IO小时黑暗的光照条件，光照强度为15001x。顶芽接种10个，腋芽接种20个。培养4周时，该30个芽均长出4-5个节的无菌苗，该30株无菌苗的高度为4.0-6.0cm，节间长度为1.0-1.4cm。每一株无菌苗为一个株系。三、继代培养取上述30个株系中的25个株系进行继代繁殖，具体方法如下将长出4-5个节的无菌苗剪成茎段，每个茎段带有一个顶芽或一个腋芽，茎段长1.0-1.4cm。将上述茎段接种于增殖培养基中进行培养，培养条件同步骤二。上述茎段中，每个株系带顶芽的茎段各接种1个，带腋芽的茎段各接种3个。培养4周时，每个茎段均长出4-5个节的无菌苗。该无菌苗再按照上述方法每4周继代一次，共继代5次。每次继代中，每个茎段均长出4-5个节的无菌苗，无菌苗的高度为4.0-6.0cm，节间长度为1.0-1.4cm。故繁殖系数为4-5。四、生根培养将上述25个株系继代5次的中药青蒿无菌苗，转接到MS基本培养基壮苗培养10天，培养条件同步骤二。将壮苗后的无菌苗转入生根培养基生根培养10天，培养条件同步骤二，得到试管苗，每个株系试管苗的根长2-4cm。其中，每个株系各取1000株进行上述生根培养，结果这25个株系分别有934、945、958、943、965、958、932、948、955、967、953、941、935、959、943、955、938、934、953、966、952、939、937、955、945株生根。该25个株系的生根率为93.2-96.6%。五、试管苗移栽及管理以及青蒿素的含量测定方法同实施例1，结果与实施例1基本相同。实施例3、组织培养快速繁殖中药青蒿一、培养基的配制和灭菌初代培养基MS+6-BA2.0mg/L+GA2.0mg/L。增殖培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L。生根培养基MS+IBA1.0mg/L。以上培养基121.3t:下，灭菌20分钟。二、初代培养取中药黄花蒿"rte肌'w'a朋/7朋L.)的顶芽或腋芽,用70%(体积百分含量)的酒精浸润l分钟，无菌水冲洗3次后，再放入0.1%(质量百分含量)的升汞溶液中灭菌5-10分钟，无菌水冲洗3次后，将顶芽或腋芽转入装有初代培养基的三角瓶(容量250ml)中，每个三角瓶中外植体个数为5个。在下述培养条件下进行培养30°C，每天16小时光照、8小时黑暗的光照条件，光照强度为25001x。顶芽接种10个，腋芽接种20个。培养4周时，该30个芽均长出5-6个节的无菌苗，该30株无菌苗的高度为6.0-8.0cm，节间长度为1.0-1.2cm。每一株无菌苗为一个株系。三、继代培养取上述30个株系中的25个株系进行继代繁殖，具体方法如下将长出5-6个节的无菌苗剪成茎段，每个茎段带有一个顶芽或一个腋芽，茎段长1.0-1.2cm。将上述茎段接种于增殖培养基中进行培养，培养条件同步骤二。上述茎段中，每个株系带顶芽的茎段各接种1个，带腋芽的茎段各接种4个。培养4周时，每个茎段均长出5-6个节的无菌苗。该无菌苗再按照上述方法每4周继代一次，共继代5次。每次继代中，每个茎段均长出5-6个节的无菌苗，无菌苗的高度为5.0-7.0cm，节间长度为0.8-1.2cm。故繁殖系数为5-6。四、生根培养将上述25个株系继代5次的中药青蒿无菌苗，转接到MS基本培养基壮苗培养10天，培养条件同步骤二。将壮苗后的无菌苗转入生根培养基生根培养10天，培养条件同步骤二，得到试管苗，每个株系试管苗的根长3-5cm。其中，每个株系各取1000株进行上述生根培养，结果这25个株系分别有958、965、959、979、982、965、976、961、978、981、968、973、962、958、965、966、967、976、980、970、965、959、978、972、974株生根。该25个株系的生根率为98.8-98.2%。五、试管苗移栽及管理以及青蒿素的含量测定方法同实施例1，结果与实施例1基本相同。权利要求1、青蒿的组织培养繁殖方法，是将中药青蒿的顶芽或腋芽在初代培养基中培养，得到无菌苗；所述初代培养基为在MS培养基中添加6-BA和GA得到的培养基，所述6-BA的终浓度为0.1-2.0毫克/升，所述GA的终浓度为0.2-2.0毫克/升。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述6-BA的终浓度为0.5毫克/升；所述GA的终浓度为1.0毫克/升。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将所述无菌苗在增殖培养基进行继代繁殖的步骤。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述增殖培养基为在MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，所述6-BA的终浓度为0.5-2.0毫克/升，所述NAA的终浓度为0.1-0.5毫克/升。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述6-BA的终浓度为1.5毫克/升；所述NAA的终浓度为0.2毫克/升。6、根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将所述无菌苗在生根培养基进行生根培养的步骤。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述生根培养基为在MS培养基中添加IBA得到的培养基，所述IBA的终浓度为0.2-1.0毫克/升。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述IBA的终浓度为0.5毫克/升。9、根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中的培养条件为在22-3(TC，每天14-16小时光照、8-10小时黑暗光照条件培养，所述光照强度为1500-2500k。10、根据权利要求1至8中任-所述的方法，其特征在于所述方法中的垮养条件为在25'C，每天16小时光照、8小时黑暗的光照条件培养，所述光照强度为2000k。全文摘要本发明公开了中药青蒿的一种组织培养快速繁殖方法。该中药青蒿的组织培养快速繁殖方法，是将中药青蒿的顶芽或腋芽在初代培养基中培养，得到无菌苗；所述初代培养基为在MS培养基中添加6-BA和GA得到的培养基，所述6-BA的终浓度为0.1-2.0毫克/升，所述GA的终浓度为0.2-2.0毫克/升。本发明方法具有以下优点取材容易，极易获得无菌材料，变异率低、增值系数高，4周增殖倍数能达到5～6倍，组培苗生根率达到93％以上，移栽成活率高达95％，具有很强的工厂化生产能力。利用本发明的方法繁殖高产中药青蒿株系，可使后代的高青蒿素含量稳定下来，从而提高青蒿素的产量。文档编号A01H4/00GK101180952SQ20071017943公开日2008年5月21日申请日期2007年12月13日优先权日2007年12月13日发明者刘本叶,叶和春,李国凤,红王,芳颜申请人:中国科学院植物研究所