治疗中风的方法

专利名称：治疗中风的方法
治疗中风的方法
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本申请要求享有2006年5月25日提交的美国临时申请60/89149的优 先权，所述临时申请通过引用整体并入本文中。
背景技术：
中风(stroke)是世界范围内致死和致残的主要原因。本年度将有大约 700,000美国人罹患中风。在美国，中风是引起死亡的第三大原因，以及造 成严重的长期残疾(diability)的首要原因。
发明概述
本发明部分基于，我们发现对VLA-1进行调节可以用于治疗缺血性损 伤，例如中风。因此，本发明的一个方面提供了给受试对象治疗中风的方 法。所述方法包括将VLA-1拮抗剂以能够有效地治疗中风的用量给予该受 试对象。"VLA-1拮抗剂"是指能够至少部分地抑制VLA-1的相互作用或其 活性的试剂(例如，任何化合物)。例如，所述试剂能够至少部分地抑制VLA-1 的活性(例如，VLA-1与配体(例如胶原蛋白)的结合)；或者该试剂能够至少 部分抑制编码VLA-1的核酸，从而例如减少VLA-1的蛋白表达。在一个实 施方案中，与没有该试剂的情况相比，所述试剂降低了 VLA-1结合胶原蛋 白(例如胶原蛋白IV)的能力，例如该试剂使得VLA-1/胶原蛋白结合的亲和 力降低了至少2、 3、 5、 10、 20、 50或100倍，并且/或者使得VLA-1/胶原 蛋白结合降低了至少5%,例如至少10%、 25%、 50%、 75%、 90%、 95%或 者更多。
在一个实施方案中，所述VLA-1拮抗剂是抗VLA-1抗体，或者其抗原 结合片段。所述抗VLA-1抗体可以是单克隆抗体，或其抗原结合片段。所 述抗VLA-1抗体可以是全长的(例如，IgG(如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgM、 IgA(如IgAl、 IgA2)、 IgD和IgE)或者可以仅包括其抗原结合片段(例 如，Fab、 F(ab，)2或scFv片段，或者一或多个CDR)。抗体，或其抗原结合
4片段，可以包括两个重链免疫球蛋白和两个轻链免疫球蛋白，或者可以是 单链抗体。该抗体可以任选包括选自K、入、(X、 Y、 5、 S或ILl恒定区基因的
恒定区。在一些实施方案中，所述抗VLA-1抗体包括基本上来自人类抗体 的重链和轻链恒定区，例如人IgGl恒定区或其一部分。在一些实施方案中， 所述抗VLA-1抗体就是人抗体。
在其它一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或人 源化抗体。正如文中探讨到的，这类抗体可以是CDR移植的、人源化的， 或者更概括地说，这些抗体具有来自非人抗体的CDR和在人体中免疫原性 较低的框架区，所述免疫原性较低例如是比天然带有小鼠CDR的小鼠框架 的抗原性更低。
在优选实施方案中，所述抗VLA-1抗体不是天然存在的抗体，而例如 是嵌合的、CDR移植的或者人源化的抗体，且该抗体至少其重链CDR3， 优选所有的重4连CDR,更优选全部三个重链CDR和全部三个轻链CDR来 自非人抗体，例如本文描述的非人抗体。在一个优选实施方案中，CDR和 本文所述CDR有1、 2或3个氨基酸残基不同，例如，重链CDR3可以来 自本文所述来源，但是另 一个CDR可以如本文所述与之不同。
优选的抗VLA-1抗体包括，例如人源化AQC2抗体(例如，ATCC保藏 号为PTA-3274的杂交瘤所产生的)、AJH10 (ATCC PTA-3580)、 hAQC2 (ATCCPTA-3275)、 haAQC2 (ATCC PTA隱3274)、 hsAQC2 (ATCC PTA-3356)、 mAQC2 (ATCC PTA-3273)以及单克隆抗体1B3.(ATCC HB-10536)。在一些实 施方案中，所述抗VLA-1抗体可以与AQC2、 AJHIO、 hAQC2、 haAQC2、 hsAQC2、 mAQC2和/或1B3结合相同的表位。在一些实施方案中，所述抗 VLA-1抗体与AQC2、 AJHIO、 hAQC2、 haAQC2、 hsAQC2、 mAQC2和/ 或1B3竟争结合VLA-1。
在一些实施方案中，抗VLA-1抗体结合VLA-1的(xl亚基，例如，VLA-1 的al-I结构域。
在一个实施方案中，所述抗VLA-1拮抗剂是多肽，例如文中描述的层 粘连蛋白(laminin)或胶原蛋白I、 III或IV;或它们的VLA-1结合肽。在一 个实施方案中，VLA-1拮抗剂是VLA-1肽，例如其al亚基的片段，例如al-I 结构域的片段，其含有氨基酸序列VQRGGR或其带有保守氨基酸替代的类 似氨基酸序列。层粘连蛋白、胶原蛋白或VLA-1肽能够阻断VLA-1的功能，这可通过它们抑制依赖于K562-al而附着胶原蛋白IV的能力来测试，如本
文所述。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是VLA-1核酸表达或翻译的抑制剂， 所述VLA-1核酸例如是双链RNA(dsRNA)分子、反义分子、核酶、三链螺 旋分子、适配体(aptamer)或者它们的任意组合。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是文中描述的小分子(例如，分子量 小于2500Da,优选小于1500Da的化学试剂)，或者是化学物质，例如有机 小分子。
在一个实施方案中，可以将VLA-1拮抗剂以足够降低脑中神经组织的 缺血性损伤的用量和/或时间进行给药。
受试对象通常是哺乳动物，例如人、狗、猫、猴、兔或者农业哺乳动 物(例如，马、牛、猪等等)。例如，受试对象是人，例如男性或女性。受试 对象可以是至少18、 25、 30、 45、 50、 55、 60或70岁。
在一个实施方案中，所述受试对象已发生过中风。中风可以是出血性 中风(hemorrhagic stroke)、缺血性中风(ischemic stroke)或者短暂性缺血发作 (transient ischemic attach, TIA)。
在一个实施方案中，受试对象在接受治疗的48小时内发生过中风，例 如是在接受治疗的2、 3、 5、 8、 12、 20或30小时内。另一个实施方案中， 受试对象在接受治疗的48小时之前，但是是在治疗前的三或两周之内发生 过中风。
在另一个实施方案中，受试对象有中风的危险，例如经历过或者正在 经历产生中风危险的状况。这类状况包括高血压(high blood pressure);吸烟 (tobacco use); 4唐尿病(diabetes mellitus);颈总动月7jc或其它动月7^疾病(carotid or other artery disease); 周边动月永病(peripheral artery disease); 心房顫动(atrial fibrillation);其它心脏病；短暂性缺血发作(TIA); —些血液病(例如，红细 胞计数高；镰刀形细胞贫血病(Sickle cell disease));高胆固醇血症(high blood cholesterol); 不运动和月巴胖(physical inactivity and obesity); 酒精牙聂入过多 (excessive alcohol); —些非法药物；以前发生过中风；或者以前有心脏病发 作。
在一个实施方案中，受试对象表现出一或多个以下症状面部突然麻 木或无力；手臂突然麻木(numbness)或无力(weakness);下肢突然麻木或无力；突然的意识混乱；突然说话困难；突然理解困难；突然一只或两只眼 晴看物困难；突然行走困难；突然的暈眩(dizziness);突然失去平衡或协调 能力；突然没有原因的剧烈头痛。在一些实施方案中，受试对象已被诊断 为发生了中风。
在一个实施方案中，VLA-1 #抗剂的给药量足够将脑神经组织中的梗 死面积(infarct size),相对未经处置的受试对象的梗死面积减少例如至少5、 10、 15、 20、 40、 50、 60、 70或80%或者更多。足以减少梗死面积的用量 可以利用动物模型进行评估，例如按照文中所述进行评估。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂的给药量足以使按照一或多项中风 评价标准(例如文中描述的标准或量表(scale))评价的症状得到至少5、 10、 15、 20、 40、 50、 60、 70、或80%或者更高的改善，或者在所述量表中提 高半级(half-step)或一级(fullstep)。例如，将改良Rankin量表中的评分降低 至少1级，例如降低至少2、 3或4级；以及/或者评分降低到例如4、 3、 2、 l或0。 NIHSS评分可降低至少1级，例如降低至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 14、 16、 18、 20级或更多，以及/或者评分降低到例如15、 13、 12、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1或0。 Barthel指数评分可被提高至少 5级，例如至少10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60级或更多， 以及/或者该评分可提高到例如50、 60、 70、 75、 80、 85、 90、 95或100。
在一个实施方案中，以每天0.025mg/kg到每天30mg/kg，例如0.1到 5mg/kg，例如0.3到3mg/kg的剂量给予VLA-1拮抗剂。在一个实施方案中， 在中风后的14天内至少给予两次所述VLA-1拮抗剂，例如在中风后的14 天内至少妾会予3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13或14次。拮抗剂可 以以每天一次，隔天一次， 一周两次， 一周一次，或一天一次给1天，例 如给2、 3、 4、 5、 6、 7、 14或28天的方案来进行给药。VLA-1拮抗剂可 以经静脉内或肠胃外给药。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂与中风疗法联合给予。例如这类疗 法包括给予第二种试剂，该试剂能给患有中风或存在中风的危险的患者提 供治疗性益处。示范性的第二种试剂包括，例如溶栓剂(例如，链激酶、酰 基化纤溶酶原-链激酶活化因子复合体(APSAC)、尿激酶、单链尿激酶-纤溶 酶原活化因子(scu-PA)、抗炎剂、来自蛇毒的凝血酶样酶类(例如安克洛酶 (ancrod))、凝血酶抑制因子、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)以及上述物质的生物活性变体)；抗凝剂(例如，华法林(warfarin)或肝素)；抗血小板药物(例如， 阿司匹林(aspirin));糖蛋白nb/IIIa抑制剂；糖胺聚糖(glycosaminoglycan); 香豆享、(coumarin); GCSF, 褪黑I: (mela'Lunin);纟田月包凋亡抑制因子(例如, caspase抑制剂)；抗氧化剂(例如NXY-059);以及神经保护剂(例如，NMDA 受体抬抗剂或者大麻素(cannabinoid)拮抗剂)。
在一个优选实施方案中，所述VLA-1拮抗剂和第二种试剂同时给予。 在一个优选实施方案中，首先给予VLA-1拮抗剂，然后给予第二种试剂。 在一个优选实施方案中，首先给予第二种试剂，然后给予VLA-1拮抗剂。
本文中，"联合给予"表示将两种或多种试剂(例如，VLA-1拮抗剂和第 二种试剂)同时或在一定时间间隔内给予受试对象，从而使得各种试剂对患 者的作用有重叠。优选第一种和第二种试剂的给药隔得很近，足够产生联 合效应。所述时间间隔可以是隔几个小时、几天或几周。一^:来说，这些 试剂在受试对象体内是同时可生物利用的(concurrently bioavailable)，例如可 以检测到。在优选实施方案中，所述试剂之一(例如第一种试剂)的至少一次 给药是在另一种试剂(例如VLA-1拮抗剂)在受试对象体内还处于治疗水平 时进4亍的。
在一个实施方案中，发明所述方法还包括对受试对象用中风后评价标 准，例如文中描述的中风评价标准或者量表进行评估。在一些实施方案中， 评估是在给予VLA-1拮抗剂后至少1小时，例如至少2、 4、 6、 8、 12、 24 或48小时；或者至少一周、2周、4周、10周、13周、20周或更长时间进 行。可以在下述一或多个时期对受试对象进行评估治疗开始前；治疗过 程中；或者在已经进行了治疗的一或多项内容之后。所述评估可以包括评 估是否需要用同样的VLA-1拮抗剂做进一步治疗，或者是否需要用其它试 剂进行另外的治疗。在一个优选实施方案中，如果达到了预定的评估结果， 可以进行另外的步骤，例如对受试对象进行另 一种治疗或者进行另 一项评 估或检测。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括确认患有中风(例如，缺血 性中风、出血性中风或短暂性缺血发作)或者存在中风症状的受试对象。
本公开文本的一个方面描述了一种处置受试对象的方法，该方法包括 (a)确定患者是否患有缺血，例如中风后缺血；(b)确定中风或其它引发缺血 的事件是否发生在特定时间段内，例如本文描述的时间段内；以及如果(a)和(b)都满足，将VLA-1拮抗剂以能够有效治疗缺血的用量给予受试对象。
本公开文本的一个方面描述了将VLA-1拮抗剂象例如文中描述的那样 用于治疗中风。所述拮抗剂可以是文中描述的VLA-1拮抗剂，例如文中描 述的VLA-1抗体。公开文本的另一个方面描述了 VLA-1拮抗剂在制备象本 文描述的治疗中风的药剂中的用途。所述拮抗剂可以是文中描述的VLA-1 拮抗剂，例如文中描述的VLA-1抗体。
本公开文本的一个方面描述了一种容器，其包括VLA-1拮抗剂，例如 VLA-1抗体，以及带有关于该拮抗剂用于治疗中风的使用说明的标签。
本公开文本的一个方面描述了给受试对象治疗缺血性损伤(例如本文 描述的缺血性损伤)的方法，该方法包括将VLA-1拮抗剂(例如文中描述的 抗VLA-]抗体)，以能够有效治疗缺血性损伤的用量给予受试对象。本公开 文本的另一个方面描述了给受试对象治疗缺血-再灌注损伤的方法，所述方 法包括将VLA-1拮抗剂(例如，本文描述的抗VLA-1抗体)，以能够有效地 治疗缺血-再灌注损伤的用量给予受试对象。
本公开文本的另 一 个方面描述了给受试对象治疗创伤性脑损伤 (traumatic brain injury, TBI)的方法。该方法包括将VLA-1拮抗剂以能够有效 治疗TBI的用量给予受试对象。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是抗VLA-1抗体，或者其抗原结合 片段。所述抗VLA-1抗体可以是单克隆抗体，或其抗原结合片段。抗VLA-1 抗体可以是全长的(例如，IgG(如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgM、 IgA(如 IgAl、 IgA2)、 IgD和IgE)或者可以仅包括其抗原结合片段(例如，Fab、 F(ab，)2 或scFv片段，或者一或多个CDR)。抗体，或其抗原结合片段，可以包括 两个重链免疫球蛋白和两个轻链免疫球蛋白，或者可以是单链抗体。该抗 体可以任选包括选自K、 ？u a、 y、 5、 s或jLi恒定区基因的恒定区。在一些 实施方案中，所述抗VLA-1抗体包括基本上来自人类抗体的重链和轻链恒 定区，例如人IgGl恒定区或其一部分。在一些实施方案中，所述抗VLA-1 抗体就是人抗体。
在其它 一 些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合或人源化 抗体。正如文中的讨论，这类抗体可以是CDR移植的、人源化的，或者更 概括地说，这些抗体具有来自非人抗体的CDR和在人体中免疫原性较低的 框架区，所述免疫原性较低例如是比天然带有小鼠CDR的小鼠框架的抗原
9性更低。
在优选实施方案中，所述抗VLA-1抗体不是天然存在的抗体，而例如 是嵌合的、CDR移植的或者人源化的抗体，该抗体至少其重链CDR3,优 选所有的重链CDR，更优选全部三个重链CDR和全部三个轻链CDR来自 非人抗体，例如本文描述的非人抗体。在一个优选实施方案中，CDR和本 文所述CDR有1、2或3个氨基酸残基不同，例如，如文中所述，重链CDR3 可以来自本文所述来源，但是另 一个CDR可以如文中描述的与之不同。
优选的抗VLA-1抗体包括，例如人源化AQC2抗体(例如，ATCC保存 号为PTA-3274的杂交瘤所产生的)、AJH10 (ATCC PTA-3580)、 hAQC2 (ATCCPTA-3275)、 haAQC2 (ATCC PTA-3274)、 hsAQC2 (ATCC PTA画3356)、 mAQC2 (ATCC PTA-3273)以及单克隆抗体1B3 (ATCC HB-10536)。在一些实 施方案中，所述抗VLA-1抗体可以与AQC2、 AJHIO、 hAQC2、 haAQC2、 hsAQC2、 mAQC2和/或1B3结合相同的表位。在一些实施方案中，所述抗 VLA-1抗体与AQC2、 AJHIO、 hAQC2、 haAQC2、 hsAQC2、 mAQC2和/ 或1B3竟争结合VLA-1。
在一些实施方案中，抗VLA-1抗体结合VLA-1的ctl亚基，例如，VLA-1 的al-I结构域。
在一个实施方案中，所述抗VLA-1拮抗剂是多肽，例如文中描述的层 粘连蛋白或胶原蛋白I、 III或IV;或它们的VLA-1结合肽。在一个实施方 案中，VLA-1拮抗剂是VLA-1肽，例如al亚基的片段(例如al-I结构域的 片段)，其含有氨基酸序列VQRGGR或者带有保守氨基酸替代的类似氨基 酸序列。层粘连蛋白、胶原蛋白或VLA-1肽能够阻断VLA-1的功能，这可 通过例如它们抑制依赖于K562-al而附着胶原蛋白IV的能力来测试，如本 文所述。在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是VLA-1核酸表达或翻译的抑 制剂，所述VLA-1核酸例如是双链RNA (dsRNA)分子、反义分子、核酶、 三链螺旋分子、适配体或者它们的任意组合。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是文中描述的小分子(例如，分子量 小于2500Da,优选小于1500Da的化学试剂)，或者是化学物质，例如有枳』 小分子。
在一个实施方案中，可以将VLA-1拮抗剂以足够治疗TBI的用量和/ 或时间进行给药，例如足够治好(curc)、治愈(heal)、减轻(alleviate)、緩解(relieve)、 改变(alter)、 补救(remedy)、 ？文进(ameliorate)、 改善(improve)或影 响(affect)TBI ,例如本文所述TBI的一或多个症状的用量。
受试对象通常是哺乳动物，例如人、狗、猫、猴、兔或者农业哺乳动 物(例如，马、牛、猪等等)。例如说，受试对象是人，例如男性或女性。受 试对象可以是至少18、 25、 30、 45、 50、 55、 60或70岁。
TBI可以例如是，挫伤、擦伤、撕裂伤或者血肿。在一些实施方案中， VLA-1拮抗剂被用于治疗原发性TBI。在一些实施方案中，VLA-1拮抗剂 被用于治疗或防止继发性TBI。
在一个实施方案中，受试对象在接受治疗的48小时内发生过TBI,例 如是在接受治疗的2、 3、 5、 8、 12、 20或30小时内。另一个实施方案中， 受试对象在接受治疗的48小时之前，但是在治疗前三或两周之内发生过 TBI。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂的给药量足够使得TBI症状，按照 一或多项TBI评估标准来说改善了至少5、 10、 15、 20、 40、 50、 60、 70
或80%或者更多。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是以每天0.025mg/kg到每天 30mg/kg，例如0.1到5mg/kg，例如0.3到3mg/kg的剂量进行给药的。在一 个实施方案中，在中风后的14天内至少给予两次所述VLA-1拮抗剂，例如 在中风后的14天内至少给予3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13或14 次。拮抗剂可以以每天一次，隔天一次， 一周两次， 一周一次或一天一次 给1天，例如给2、 3、 4、 5、 6、 7、 14或28天来进行给药。VLA-1拮抗 剂可以经静脉内或肠胃外给药。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂与TBI疗法联合给予。例如可以将 VLA-1拮抗剂与针对其它损伤和感染的手术和/或疗法一起给予。在一个优 选实施方案中，所述VLA-1拮抗剂和第二种试剂是同时给予的。在一个优 选实施方案中，首先给予VLA-1拮抗剂，然后给予第二种试剂。在一个优 选实施方案中，首先给予第二种试剂，然后给予VLA-1拮抗剂。
在一个实施方案中，发明所述方法还包括对受试对象按照本文描述的 TBI标准进行评估。在一些实施方案中，评估是在给予VLA-1拮抗剂后至 少l小时，例如至少2、 4、 6、 8、 12、 24或48小时；或者至少一周、2周、 4周、0周、13周、20周或更长时间进行。可以在下述一或多个时期对受
li试对象进行评估治疗开始前；治疗过程中；或者在已经进行了治疗的一 或多项内容之后。这里说的评估可以包括评估是否需要用同样的VLA-1拮 抗剂进行进一步治疗，或者是否需要用其它试剂进行另外的治疗。在一个 优选实施方案中，如果达到了预定的评估结果，可以实施另外的步骤，例 如给予受试对象另 一种治疗或者进行另 一种评估或检测。
本公开文本的一个方面描述了将VLA-1拮抗剂如本文所述用于治疗 TBI。所述拮抗剂可以是文中描述的VLA-1拮抗剂，例如文中描述的VLA-1 抗体。公开文本的另一个方面描述了 VLA-1拮抗剂在制备象本文描述的治 疗TBI的药剂中的用途。所述拮抗剂可以是文中描述的VLA-1拮抗剂，例 如文中描述的VLA-1抗体。
本公开文本的一个方面描述了一种容器，其包括VLA-1拮抗剂，例如 VLA-1抗体，以及带有关于该拮抗剂用于治疗TBI的使用说明的标签。
本公开文本的另一个方面描述了给受试对象治疗脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的方法。该方法包括将VLA-1拮抗剂以能够有效治疗SCI的用 量给予受试对象。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是抗VLA-1抗体，或者其抗原结合 片段。所述抗VLA-1抗体可以是单克隆抗体，或其抗原结合片段。抗VLA-1 抗体可以是全长的(例如，IgG(如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgM、 IgA(如 IgAl、 IgA2)、 IgD和IgE)或者可以仅包括其抗原结合片段(例如，Fab、 F(ab，)2 或scFv片段，或者一或多个CDR)。抗体，或其抗原结合片段，可以包括 两个重链免疫球蛋白和两个轻链免疫球蛋白，或者可以是单链抗体。该抗 体可以任选包括选自K、 x、 a、 y、 5、 s或p恒定区基因的恒定区。在一些 实施方案中，所述抗VLA-1抗体包括基本上来自人类抗体的重链和轻链恒 定区，例如人IgGl恒定区或其一部分。在一些实施方案中，所述抗VLA-1 抗体就是人抗体。
抗体。正如文中探讨到的，这类抗体可以是CDR移植的、人源化的，或者 更概括地说，这些抗体具有来自非人抗体的CDR和在人体中免疫原性较低 的框架区，所述免疫原性较低例如是比天然带有小鼠CDR的小鼠框架的抗
原性更低。
在优选实施方案中，所述抗VLA-1抗体不是天然存在的抗体，而例如是嵌合的、CDR移植的或者人源化的抗体，且该抗体至少其重链CDR3， 优选所有的重链CDR，更优选全部三个重链CDR和全部三个轻《连CDR来 自非人抗体，例如本文描述的非人抗体。在一个优选实施方案中，CDR和 本文所述CDR有1、 2或3个氨基酸残基不同，例如，如文中所述，重链 CDR3可以来自本文所述来源，但是另 一个CDR可以如本文所述与之不同。
优选的抗VLA-1抗体包括，例如人源化AQC2抗体(例如，ATCC保存 号为PTA-3274的杂交瘤所产生的)、AJH10 (ATCC PTA-3580)、 hAQC2 (ATCCPTA-3275)、 haAQC2 (ATCC PTA-3274)、 hsAQC2 (ATCC PTA-3356)、 mAQC2 (ATCC PTA-3273)以及单克隆抗体1B3 (ATCC HB-10536)。在一些实 施方案中，所述抗VLA-1抗体可以与AQC2、 AJHIO、 hAQC2、 haAQC2、 hsAQC2、 mAQC2和/或1B3结合相同的表位。在一些实施方案中，所述抗 VLA-1抗体与AQC2、 AJHIO、 hAQC2、 haAQC2、 hsAQC2、 mAQC2和/ 或1B3竟争结合VLA-1。
在一些实施方案中，抗VLA-1抗体结合VLA-1的al亚基，例如，VLA-1 的al-I结构域。
在一个实施方案中，所述抗VLA-1拮抗剂是一种多肽，例如层粘连蛋 白或胶原蛋白l、 III或IV;或者是文中描述的层粘连蛋白或者胶原蛋白I、 III或IV的VLA-1结合肽。在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是VLA-1肽， 例如al亚基的片段(例如al-I结构域中的片段)，其含有氨基酸序列 VQRGGR或者带有保守氨基酸替代的类似氨基酸序列。层粘连蛋白、胶原 蛋白或VLA-I肽能够阻断VLA-1的功能，这可通过它们抑制依赖于K562-al 而附着胶原蛋白IV的能力来测试，如本文所述。在一个实施方案中，VLA-1 拮抗剂是VLA-1核酸表达或翻译的抑制剂，所述VLA-1核酸例如是双链' RNA(dsRNA)分子、反义分子、核酶、三链螺旋分子、适配体或者它们的任 意组合。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是文中描述的小分子(例如，分子量 小于2500Da，优选小于1500Da的化学试剂)，或者是化学物质，例如有机 小分子。
在一个实施方案中，可以将VLA-1拮抗剂以足够治疗SCI的用量和/ 或时间进行给药，例如足够治好、治愈、减轻、緩解、改变、补救、改进、 改善或影响SCI ,例如本文所述SCI的一或多个症状的用量。受试对象通常是哺乳动物，例如人、狗、猫、猴、兔或者农业哺乳动 物(例如，马、牛、猪等等)。例如说，受试对象是人，例如男性或女性。受
试对象可以是至少18、 25、 30、 45、 50、 55、 60或70岁。
在一些实施方案中，VLA-1拮抗剂被用于治疗原发性SCI。在一些实
施方案中，VLA-1拮抗剂被用于治疗或防止继发性SCI。
在一个实施方案中，受试对象在接受治疗的48小时内发生过SCI,例
如是在接受治疗的2、 3、 5、 8、 12、 20或30小时内。另一个实施方案中，
受试对象在接受治疗的48小时之前，但是在治疗前三或两周之内发生过
SCI。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂的给药量足够使得SCI症状，按照 一或多项TBI评估标准来说改善了至少5、 10、 15、 20、 40、 50、 60、 70 或80%或者更多。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是以每天0.025mg/kg到每天 30mg/kg，例如0.1到5mg/kg,例如0.3到3mg/kg的剂量进行给药的。在一 个实施方案中，在中风后的14天内至少给予两次所述VLA-1拮抗剂，例如 在中风后的14天内至少给予3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13或14 次。拮抗剂可以以每天一次，隔天一次， 一周两次， 一周一次或一天一次 给1天，例如给2、 3、 4、 5、 6、 7、 14或28天来进行给药。VLA-1拮抗 剂可以经静脉内或肠胃外给药。
在一个实施方案中，VLA-1拮抗剂是与治疗SCI的第二种试剂联合给 予的。所述第二种药剂可以例如是，皮质类固醇或糖皮质类固醇(例如甲基 强的松龙(methylprednisolone))。在一个优选实施方案中，所述VLA-1拮抗 剂和第二种试剂是同时给予的。在一个优选实施方案中，首先给予VLA-] 拮抗剂，然后给予第二种试剂。在一个优选实施方案中，首先给予第二种 试剂，然后给予VLA-1拮抗剂。
在一个实施方案中，发明所述方法还包括对受试对象按照本文描述的 SCI标准进行评估。在一些实施方案中，评估是在给予VLA-1拮抗剂后至 少1小时，例如至少2、 4、 6、 8、 12、 24或48小时；或者至少一周、2周、 4周、10周、13周、20周或更长时间进行。可以在下述一或多个时期对受 试对象进行评估治疗开始前；治疗过程中；或者在已经进行了治疗的一 或多项内容之后。这里说的评估可以包括评估是否需要用同样的VLA-1拮
14抗剂做进一步治疗，或者是否需要用其它试剂进行另外的治疗。在一个优 选实施方案中，如果达到了预定的评估结果，可以实施另外的步骤，例如 给予受试对象另 一种治疗或者进行另 一种评估或检测。
本公开文本的一个方面描述了将VLA-1拮抗剂如本文所述用于治疗 SCI。所述拮抗剂可以是文中描述的VLA-1拮抗剂，例如文中描述的VLA-1 抗体。公开文本的另一个方面描述了 VLA-1拮抗剂在制备象本文描述的治 疗SCI的药剂中的用途。所述拮抗剂可以是文中描述的VLA-1拮抗剂，例 如文中描述的VLA-1抗体。
本公开文本的一个方面描述了一种容器，其包括VLA-l拮抗剂，例如 VLA-]抗体，以及带有关于该拮抗剂用于治疗SCI的使用说明的标签。
术语"治疗(treatment, treat, treating)，，用在本文是指以这样的用量、方式 和/或模式实施一种疗法，从而能够有效改善与某疾病(例如，中风、TBI或 SCI)相关的状况、症状或参数；或者能够降低该疾病的发生、进展或恶化(包 括由例如中风、TBI或SCI等疾病引起的继发性损伤)达到统计学上显著的 程度或者本领域技术人员能够检测到的程度。因此，治疗可以实现治疗上 的和/或预防上的帮助。有效的用量、方式或模式可以随受试对象而变化， 可以针对受试对象确定。本文中，"治疗"还涵盖对有中风危险的受试对象进 行的预防性治疗，这类受试对象例如是已经发生过短暂性缺血发作的受试 对象。在一个优选实施方案中，在缺血性损伤后给予VLA-1拮抗剂。在一 个实施方案中，在受试对象发生过中风后给予VLA-1。
本文中，"能够有效治疗的用量"或者"治疗有效量"是指VLA-1拮抗剂 的用量，在以单个或多个剂量给予受试对象时，能够有效地改善或预防性 地治疗与某疾病相关的状况、症状或参数；或者能够降低该疾病的发生、 进展或恶化达到统计学上显著的程度或者本领域技术人员能够检测到的程 度。例如，就中风而言，"能够有效治疗的用量，，是能够将脑神经组织中的梗 死面积，相对未处置受试对象的梗死面积降低例如至少5、 10、 15、 20、 40、 50、 60、 70或者80%或以上的用量。替代的，"能够有效治疗的用量，，是足 够使症状按照本文描述的 一或多个中风、TBI或SCI评估标准改善了至少5 、 10、 15、 20、 40、 50、 60、 70或者80%或更多的用量。
本文中，"中风，，是个宽泛的术语，指那些由于给大脑供血的一或多个 血管阻塞或出血，导致细胞死亡而造成的状况。"缺血性中风，，用于本文是指由于给大脑供血的一或多个血管阻塞而引起的中风。缺血性中风的类型包 括，例如栓塞性中风、心脏栓塞性中风、血栓性中风、大血管血栓、腔隙 性脑梗死、动脉-动脉中风以及隐发性中风。"出血性中风，，本文中，是指由 于给大脑供血的一或多个血管出血而导致的中风。出血性中风的类型包括， 例如硬脑膜下中风、脑实质中风、硬膜外中风以及蛛网膜下腔中风。
本文中，"创伤性脑损伤"或者"TBI"是指由物理力量或创伤对脑部造成 的伤害。TBI可以是原发性或继发性的。"原发性TBI"在物理外力或创伤之 后立即出现，可以导致例如扩展性血肺、蛛网膜下腔出血、脑水肿、颅内 压增高和脑缺氧。"继发性TBI"可能在物理外力或创伤之后几小时到几天内 发生，会导致严重的继发性后果(例如，中风)。如果患者在格拉斯哥昏迷记 分法(Glasgow Coma Scale, GCS))中评分达到13到15,定义为"轻度"TBI。 轻度TBI可以与在物理外力或创伤后失去知觉(loss of consciousness, LOC)5 分钟或更短，以及/或者在物理外力或创伤后失忆10分钟或更短联系在一 起。当患者在GCS中评分低于13时，TBI界定为"中度到重度"。
本文中，"脊髓损伤"或"SCI"是指发生在脊髓和/或其周围的创伤性损 伤。脊髓可能是被挤压、断离或挫伤，从而造成轴索的物理或生理损伤， 并影响神经电冲动沿受影响的轴索的传导。大量的轴索，包括与之关联的 细胞体可能会死亡，导致大脑和外周神经之间的通讯丧失。因此SCI会造
成突然丧失全部或部分的运动功能，其程度取决于损伤发生的部位。高位(颈
部)SCI会导致完全丧失运动功能、四肢瘫、失去呼吸控制和/或心血管虛脱。 低位(胸部)SCI会导致截瘫，但不涉及到臂部或者呼吸功能异常。
所有专利、专利申请以及参考文献通过整体引用的方式并入本文。有 沖突的情况下，以本申请为准。
附图和以下描述对本发明的 一 或多个实施方案的细节进行了阐述。由 说明书和附图以及权利要求很容易看出本发明的其它特征、针对对象和优点。


图lA是MCAO之后的^f亍为评估图。
图IB是MCAO之后，对照和抗VLA-1抗体处理过的小鼠中发生梗死
的半球百分比图。
16图1C是MCA0之后，对照和抗VLA-1抗体处理过的小鼠中的梗死体积图。
图ID是MCAO之后，对照和抗VLA-1抗体处理过的小鼠中的水肿百 分率图。
图2A是MCAO之后，对照和抗VLA-1抗体处理过的小鼠中梗死体积图。
图2B是MCAO之后，对照和抗VLA-1抗体处理过的小鼠中的水胂百
分率图。
发明详述
本文展示的结果表明有阻断功能的VLA-1抗体能够体内降低脑缺血 (cerebral ischemia)模型中的梗死面积。这些结果包括，给予VLA-1拮抗剂(例 如VLA-1抗体)可以减少CNS中的缺血性损伤，特别是创伤性缺血性损伤。 相应的，单独或与其它疗法联合给予VLA-1拮抗剂(例如VLA-1抗体)可以 用来治疗中风、创伤性脑损伤(TBI)和脊髓损伤(SCI)，以及其它缺血性损伤。
VLA-1
整联蛋白是介导细胞-细胞以及细胞-基质粘着的细胞表面受体超家族。 已知这些蛋白能够提供固着位点，以及发育和组织修复过程中细胞生长、 迁移和分化的信号。它们还被认为可能参与免疫和炎症反应过程。
整联蛋白是由两个非共价连接的多肽链(a和(3)构成的异源二聚体蛋白 质。每条链的氨基末端形成一个球形的头，籍此实现两条链之间的连接和 配体结合。球形头通过茎部连接到跨膜片段。位于细胞质内的尾部通常少 于50个氨基酸残基。整联蛋白亚家族最初是根据它们借助P亚基形成异源 二聚体来界定的。含有(31的整联蛋白又称为VLA分子，取自"very late activation"抗原的缩写。VLA-1到VLA-6分别指含有al到a6(即CD49a到 CD49f)的卩l亚家族。纟宗述可参见CW/w/a厂a"<i Mo/ecw/ar //wmwo/ogy, eds. Abul K. Abbas等，W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000。
胶原蛋白(包括I和IV型)以及层粘连蛋白是aipi整联蛋白(即VLA-1) 的已知配体。有研究表明VLA-1参与了细胞附着和在胶原蛋白上的迁移 (Keely等，1995, J. Cell Sci. 108: 595-607; Gotwals等，1996， J. Clin. Invest. 97: 2469-2477);促进胶原蛋白基质的收缩和重组，而该基质是伤口愈合的关键
17成分(Gotwals等，出处同上；Chiro， 1991, Cell 67 : 403-410);以及调节参与 胞外基质重建的基因的表达(Riikonen等，1995, J. Biol. Chem. 270: 1-5; Langholz等，1995, J. Cell Biol. 131: 1903-1915)。 VLA-1拮抗剂
许多试剂都可以用作VLA-1拮抗剂来治疗中风。这类试剂包括针对 VLA-1或者VLA-1的一部分(例如VLA-1的al亚基)的抗体。优选的试剂 包括2001年4月14日提交的美国专利申请60/283,794和2001年7月6日 提交的60/303,689,以及WO 02/083854中公开的抗VLA-1抗体。这些申请 的公开文本通过引用整体并入本文。其它试剂包括能够阻断VLA-1与其配 体之间的相互作用的小分子，例如胶原蛋白或层粘连蛋白，或者能够调节 整联蛋白细胞信号传导从而降低与VLA-1相关的细胞活性或生化功能的小 分子。可以用于本文公开的方法的试剂还包括那些通过例如基因治疗以及 反义技术使得VLA-1表达下降的试剂。
抗VLA-1抗体
示范性的VLA-1拮抗剂包括能够结合VLA-1的抗体。在一个实施方案 中，所述抗体抑制了 VLA-1和VLA-1配体(例如胶原蛋白)之间的相互作用， 其原理是通过物理阻断该相互作用，降低VLA-1和/或VLA-1配体与其结 合物的亲和力，破坏VLA-1复合体或者使其失去稳定性，捕获VLA-1或者 对VLA-1进行定靶降解。在一个实施方案中，所述抗体可以结合到VLA-1 中参与VLA-1/配体结合界面的一或多个氨基酸残基上。这类氨基酸残基可 以通过例如丙氨酸扫描鉴定到。在另一个实施方案中，所述抗体可以结合 到不参与VLA-1/配体结合的残基上。例如，抗体可以改变VLA-1的构型， 从而降低其结合亲和力，或者抗体可以立体地阻碍了 VLA-1/配体结合。在 一个实施方案中，所述抗体可以减少由VLA-1介导的某个过程或活性的活 化。
本文中，名词"抗体"是指这样的蛋白质，其包括至少一个免疫球蛋白 可变区，例如能够提供免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序 列的一段氨基酸序列。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(文中缩写为VH) 和轻(L)链可变区(文中缩写为VL)。在另一个实施方案中，抗体包括两个重 (H)链可变区和两个轻(L)链可变区。名词"抗体"涵盖抗体的抗原结合片段(例 如，单链抗体、Fab片段、F(ab，)2片段、Fd片段、Fv片段以及dAb片段)，还有完全抗体，例如完整和/或全长的IgA、 IgG(例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgE、 IgD、 IgM型(以及它们的亚型)免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻 链可以是K或X型。在一个实施方案中，抗体是糖基化的。抗体可以是对 抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性有贡献，或者不对一种或这
两种活性起作用。
VH和VL区可以进一步划分为超可变性的区域，称为"互补决定 区，，("CDR")，之间分布着更保守的区域，称为"框架区"(FR)。 FR和CDR的 范围已有明确的界定(参见，Kabat, E.A.,等(1991) 6"e，e"c&s o/Pra ez'm 7m附wwo/og/co/ /"tem^'尸z,五必/cw， US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia, C.等(1987) / Mo/. 196:901-917)。本文使用的是Kabat定义。每个VH和VL通常由三个CDR 和4个FR构成，从氨基端到羧基末端按以下顺序排列FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。
"免疫球蛋白结构域"是指来自免疫球蛋白分子的可变或恒定结构域。 免疫球蛋白结构域通常含有两个由大约七个(3链， 一个保守的二硫键形成 的折叠(参见，例如A. F. Williams and A. N. Barclay (1988) Jw". i ev /柳簡，/. 6:381-405)。"免疫球蛋白可变结构域序列"是指能形成足以将构象 中的CDR序列定位成适合抗原结合的结构。例如，所述序列可以包括天然 可变结构域的全部或部分氨基酸序列。例如，该序列可以省略一、二或多 个N-或C-末端氨基酸、内部氨基酸；可以包括一或多个插入或附加的末端 氨基酸；或者可以包括其它改动。在一个实施方案中，包括免疫球蛋白可 变结构域序列的多肽可以与另 一个免疫球蛋白可变结构域序列联合形成目 标结合结构(或"抗原结合位点")，例如能够与VLA-1进行相互作用的结构。
所述抗体的VH或VL链可以进一步包括重链或轻链恒定区的全部或部 分，从而分别形成重或轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，所述抗体是 两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四体。其中重和轻免疫球蛋 白链可以通过二硫键连接。重链恒定区通常包括三个恒定结构域，CHl、 CH2和CH3。轻链恒定区通常包括CL结构域。重链和轻链的可变区含有 与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区一般介导抗体与宿主组织或 因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统 的第一种成分(Clq)。抗体的一或多个区域可以是人的、效杲上是人的(effectively human)、 或者人源化的。例如，可变区的一或多个区域可以是人或效果上是人的。 例如， 一或多个CDR，例如HCCDR1、 HCCDR2、 HCCDR3、 LC CDR1 、 LC CDR2以及LC CDR3可以是人的。每个轻链CDR可以是来自人的。HC CDR3可以是来自人的。 一或多个框架区，例如HC或LC的FR1、 FR2、 FR3和FR4可以是人的。在一个实施方案中，全部框架区是人的，例如来 源于人的体细胞，例如能产生免疫球蛋白的造血细胞或者非造血细胞。在 一个实施方案中，人序列是由例如种系核酸编码的种系序列(germline sequence)。 一或多个恒定区可以是人的、效果上是人的或者人源化的。在 另一个实施方案中，框架区(例如FR1、 FR2和FR3整体；或者FR1、 FR2、 FR3和FR4整体)的至少70、 75、 80、 85、 90、 92、 95或98%或者整个抗 体可以是人、效果上是人的或者人源化的。例如，FR1、 FR2和FR3整体与 人种系片段编码的人的序列有至少70、 75、 80、 85、 90、 92、 95、 98或99% 相同，或者完全相同。
"效果上是人的"免疫球蛋白可变区是这样的免疫球蛋白可变区，其包 含足够数量的人框架氨基酸位点，因此该免疫球蛋白可变区不会在正常人 体内引起免疫原反应。"效果上是人的"抗体是包含足够数量的人氨基酸位 点，因此不会在正常人体内引起免疫原反应的抗体。
"人源化，，免疫球蛋白可变区是被修饰过的免疫球蛋白可变区，因此该 修饰过的形式在人体内引起的免疫反应比未修饰形式小，例如经过修饰包 含了足够数量的人框架氨基酸位点，从而该免疫球蛋白可变区在正常人体 内不会引起免疫原反应。对"人源化"免疫球蛋白的描述包括例如美国专利 6407213和5693762。 一些情况中，人源化免疫球蛋白可以包含在一或多个 框架氨基酸位点上的一个非人源氨基酸。
抗VLA-1抗体还可以是嵌合抗体，例如通过对相关(例如，小鼠、大鼠 或兔子)抗体进行工程化产生的。例如，可以通过重组DNA技术对相关抗 体做改变，使得重链和/或轻链的部分或全部铰链区和/或恒定区被来自另一 物种(例如，人)的抗体中的对应成分所耳又代。 一般来说，工程化抗体的可变
称为嵌合抗体，在给予其铰链和/或恒定区所来源的物种之个体(例如，人) 时，比相关抗体的抗原性要低。制备嵌合抗体的方法是本领域熟知的。优选的恒定区包括，但不限于来源于IgGl和IgG4的恒定区。
可以用于本文所描述方法的示范性抗VLA-1抗体包括，例如单克隆抗体AJH10(ATCCPTA-3580;于2001年8月2日保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)、 hAQC2 (ATCCPTA-3275; 2001年4月18日保藏)、haAQC2 (ATCC PTA陽3274; 2001年4月18曰保藏)、hsAQC2(ATCCPTA-3356;2001年5月4日保藏)以及mAQC2(ATCC PTA-3273)。所有这些抗体均按照布达佩斯条约进行了保藏。其它抗VLA-1抗体包括，例如美国专利5391481和5788966中描述的单克隆抗体1B3 (ATCCHB-10536)和单克隆抗体Ha31/8。抗体的制备
可以通过多种方式来制备与VLA-1结合的抗体，包括例如用动物进行接种，或者象噬菌体展示这样的体外方法。可以将全部或部分VLA-1作为免疫原或者作为选择时的靶分子。例如，VLA-1或其片段，例如VLA-1的al亚基的全部或部分(例如al-I结构域)，可以作为免疫原。在一个实施方案中，被接种的动物包含带有天然、人或部分人免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白制造细胞。在一个实施方案中，非人动物含有人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能制备这样的小鼠株，其小鼠抗体产生有缺陷，而是带有了人Ig基因座的大片段。利用杂交瘤技术，可以生产并选择来自某基因，具有所需特异性的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如XENOMOUSE , Green等(1994) A^. 7:13-21; US 2003-0070185;美国专利5，789,650;以及WO 96/34096。
VLA-1的非人抗体还可以在啮齿动物中生产。非人抗体可以象例如EP239400、美国专利6602503、 5693761和6407213中描述的那样进行人源化；去免疫性；或者经其它方法修饰成效果上是人的。
EP239400 (Winter等)描述了通过将抗体中一个物种的(特定可变区内的)互补决定区(CDR)取代为另一个物种的互补决定区来改变抗体。通常，利用重组核酸技术将非人(例如小鼠)抗体的CDR取代为人抗体中的相应区域，从而产生编码所需进行了取代的抗体的序列。可以添加所需同种型(一般对CH是y型，对CL是K型)的人恒定区基因片段，将人源化重链和轻链基因在哺乳动物细胞内共表达来产生可溶性人源化抗体。也可以使用其它将抗体人源化的方法。例如，其它决定抗体的三维结构，框架位置在三维结构
21中靠近结合决定簇和免疫原性肽序列的方法。参见，例如WO 90/07861;美国专利5,693,762; 5,693,761; 5,585,089和5,530,101: Tempest等(1991)Aofec/wo/ogy 9:266-271以及美国专利6,407,213。
在一些例子中，直接将CDR转移到人框架上会使得所得抗体失去抗原结合亲和力。这是因为一些相关抗体中，框架区中的特定氨基酸能与CDR相互作用，因此会影响抗体总体上的抗原结合亲和力。在这种情况中，为了保持相关抗体的抗原结合活性，在受体抗体的框架区引入"回复突变"是关键所在。进行回复突变的一般方法是本领域已知的。例如Queen等(同上)、Co等，Pro" Nat. Acad. Sci. USA88 : 2869-2873(1991)以及WO 90/07861(ProteinDesignLabsInc.)描述了一种包含两个关键步骤的方法。首先，通过计算机分析与相关小鼠抗体的V区框架有良好的蛋白序列同源性来选择人V框架区。然后，利用计算机对所述小鼠V区的四级结构进行建模，以便观察可能与小鼠CDR有相互作用的框架氨基酸残基，随后将这些小鼠氨基酸残基叠加到同源人框架上。对于该两步法，设计人源化抗体有几个准则。第一个准则是将来自通常和非人供体免疫球蛋白有同源性的特定人免疫球蛋白之框架作为人受体，或者将许多人抗体的共有序列框架作为人受体。第二个准则是如果在框架的某个特定残基上，人受体残基是不常见的，而供体残基对于人序列是典型的，应当使用供体氨基酸而非受体。第三个则是在紧挨着CDR的位置上要使用供体框架氨基酸残基而非受体。
还可以采用象Tempest, Biotechnology 9: 266-271 (1991)中描述的不同方法。该方法中，分别来源于NEWM和REI重链和轻链的V区框架被用于CDR移植，而未大量引进小鼠残基。采用这一方法的好处是NEWM和REI可变区的三维结构是从X光晶体学得知的，因此可以很容易地对CDR和V区框架残基之间的特异相互作用进行建模。
结合VLA-1的全长人单克隆抗体可以象Boemer等(1991) /147:86-95中描述的，利用体外致敏人脾细胞来生产。这些抗体还可以通过Persson等(1991) iVoc. A^. Jcad t/5L4 88:2432-2436或Huang andStollar (1991)//wm/"o/. MeAo& 141:227-236;以及美国专利5,798,230中描述的库克隆来制备。利用常规噬菌体技术，大的非接种人噬菌体展示文库也可以用于分离可以开发成为人治疗剂的高亲和力抗体(参见，例如Hoogenboom 等 (1998) 7m7丽wotec/wo/ogy 4:1-20; Hoogenboom等 (2000)/,w附Mw/ 7b血y 2:371-8;以及US 2003-0232333)。制备全长人抗体的其它方法包括使用非人动物，其带有失活的内源Ig基因座，转基因带上了未重新排列的人抗体重链和轻链基因。这类转基因动物可以用Il-I或其抗原源性片段进行接种，然后由得到的B细胞制备杂交瘤。这些方法有如下描述，例如涉及含有人Ig微基因座的转基因小鼠的多项GenPharm/Medarex (PaloAlto, CA)出版物/专利(例如美国专利5789650);多项涉及VENOMICE的Abgenix (Fremont, CA).出版物/专利(例如美国专利6，075，181; 6,150,584和6,162, 963; Green等，Nature Genetics 7: 13-21 (1994);以及Mendez等，15 (2):146-56 (1997》;以及多项涉及"transomic"小鼠的Kirin (Japan)出版物/专利(例如，EP 843 961 ， Tomizuka等,Nature Genetics 16: 133-1443 (1997》。抗体和蛋白质的制备
本文描述的抗体和其它蛋白质可以在原核和真核细胞中制备。在一个实施方案中，抗体(例如scFv，s)是在酵母细胞，例如毕赤酵母(尸/c/7/a)(参见，例如Powers等(2001) 7wwm"o/. M"/wcfc 251:123-35)、汉逊酵母Cttmyew/a)或糖酵母(Sflcc/2flraw7ce力中表达的。
抗体，尤其是全长抗体(例如IgG)可以在哺乳动物细胞中生产。用于重组表达的示范性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(包括Urlaub and Chasin (1980)A^/.」cad Scz'. 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，其带有象例如Kaufman and Sharp (1982) Mo/.历o/.159:601-621中描述的DHFR选择标记)、淋巴细胞系(例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞)、COS细胞、K562细胞以及来自转基因动物(例如转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是哺乳动物上皮细胞。
除了编码免疫球蛋白结构域的核酸序列，重组表达载体还可以带有其它核酸序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制原点)和选择标记基因。所述选择标记基因能够帮助选择出导入了所述载体的宿主细胞(参见，例如美国专利4,399，2〗6、 4,634,665和5,179,017)。示范性的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于W/K宿主细胞，用氨曱蝶呤进行选择/扩增)和mo基因(用于G418筛选)。
在示范性的抗体(例如全长抗体或其抗原结合部分)重组表达系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和轻链的重组表达载体导入CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操纵地连接有增强
23子/启动子调控元件(例如,来源于SV40、 CMV、腺病毒等，例如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或者SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)，以便驱动基因的高水平转录。重组表达载体还带有DHFR基因，该基因使得能够利用氨曱蝶呤选择/扩增来选择转染了该载体的CHO细胞。对挑出的转化宿主细胞进行培养，以便表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整抗体。制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化子、培养宿主细胞以及由培养基中回收抗体均采用标准分子生物学技术。例如， 一些抗体可以用蛋白A或蛋白G经亲和层析来分离。
所述抗体还可以含有^f奮饰，例如能够改变Fc功能的修饰，例如减少或去除与Fc受体或Clq,或者这两者之间的相互作用的修饰。例如，可以将人IgGl恒定区的一或多个残基进行突变，例如按照美国专利5648260中的编号方法的残基234和237中的一或多个。其它示范性的修饰包括美国专利5648260中描述的那些。
对于一些含有Fc结构域的蛋白质，可以将抗体/蛋白质生产系统设计成合成其Fc区域被糖基化的抗体或其它蛋白质。例如，IgG分子的Fc结构域在CH2结构域中的天冬酰胺297被糖基化。Fc结构域还可以含有其它的真核细胞翻译后修饰。另外一些例子中，产生的蛋白质未被糖基化。
还可以由转基因动物来产生抗体。例如，美国专利5849992描述了一种在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建的转基因含有乳汁特异启动子和编码目标抗体(例如本文描述的抗体)的核酸序列，以及便于分泌的信号序列。雌性的这类转基因哺乳动物的所产生的乳汁中包含分泌在其中的目标蛋白，例如抗体。可以将蛋白质从乳汁中纯化出来，或者对于一些应用，可以直接使用。
其它部分(other moieties)
本文描述的抗体还可以进一步包含其它能影响其功能的部分。例如，所述抗体可以包含毒素部分(例如，破伤风类毒素或蓖麻蛋白)或者放射性核素(例如mIn或卯Y)来杀伤抗体所寻靶的细胞(参见美国专利6307026)。抗体可以包含一个能够简化分离或检测的部分(例如，生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸标记物等)。抗体还可以包含使血清半寿期延长的部分，例如聚乙二醇(PEG)部分。
多肽拮抗剂除了抗体，可以用于本文所述方法的VLA-1拮抗剂包括能够抑制
VLA-1功能的多肽，例如通过阻断VLA-1与其生理配体，例如胶原蛋白(象胶原蛋白I、 III或IV)或层粘连蛋白之间的相互作用；或者通过调整VLA-1依赖性细胞信号传导而抑制VLA-1的功能。
VLA-1拮抗剂是具有一或多个以下特性的试剂(l)它能够以足够的特异性包被或结合携带VLA-1的细胞表面上的VLA-1抗原，从而抑制VLA-l/VLA-1配体之间的相互作用，例如VLA-1/胶原蛋白相互作用；(2)能以足够的特异性包被或结合携带VLA-1的细胞表面上的VLA-1抗原，从而能对VLA-1介导的信号传导(例如VLA-l/胶原蛋白介导的信号传导)进行修饰，优选能抑制这类信号传导；(3)能以足够的特异性包被或结合VLA-1配体，例如胶原蛋白(例如胶原蛋白I、 III或IV)或层粘连蛋白，从而抑制VLA-l/VLA-1配体之间的相互作用；(4)能以足够的特异性包被或结合VLA-1配体，例如胶原蛋白(例如胶原蛋白I、 III或IV)或层粘连蛋白，从而能对VLA-l-配体介导的VLA-1信号传导(例如胶原蛋白介导的VLA-1信号传导)进行修饰，优选能抑制这类信号传导。在优选的实施方案中，VLA-1拮抗剂具有1和2所述特性中的一种或两种。另 一个优选实施方案中，VLA-1拮抗剂具有3和4所述特性中的一种或两种。
对于本文描述的方法,任何能够与携带VLA-1的细胞表面上的VLA-1抗原结合，并有效地阻断或包被VLA-1抗原的试剂均一皮看作是本文实施例中使用的单克隆抗体的等同物。
正如文中讨论的，用于本文描述的方法的VLA-1拮抗剂不限于抗体或抗体衍生物，而可以是其它分子，例如能够结合VLA-1的其它蛋白质的可溶性形式，例如VLA-1的天然结合蛋白。这类拮抗剂包括胶原蛋白I、 in或IV;胶原蛋白I、 III或IV的VLA-1结合肽；层粘连蛋白；以及层粘连蛋白的VLA-1结合肽(见例如，Pfaff等，Eur. J. Biochem. 225:975-84， 1994;Colognato-Pyl(e等，J. Biol. Chem. 270: 9398-9406, 1995;以及Colognato等，J.Biol. Chem. 272: 29330-29336, 1997)。例如，胶原蛋白I、 III或IV的VLA-1结合肽可以含有氨基酸序列GFOGER(参见例如，Knight等，J. Biol. Chem.275:35-40， 2000) 、 GROGER (参见例如，Kim等，J. Biol. Chem.280:32512-32520,2005),或类似的进行了保守取代的氨基酸序列。其它拮抗剂包括VLA-1肽，例如含有氨基酸序列VQRGGR的肽或者进行了保守取
25代的类似氨基酸序列；以及模拟肽，例如WO 01/96365、美国专利6326403和6001961中描述过的。这些拮抗剂可以通过与VLA-1的细胞表面结合蛋白进行竟争或其它改变VLA-1功能的方式发挥作用。小分子拮抗剂
除了抗体，可以用于本文所述方法的VLA-1拮抗剂包括任何能抑制VLA-1功能的非抗体化合物，例如该化合物通过阻断VLA-1与其生理配体(例如胶原蛋白)之间的相互作用，或者通过调整VLA-1依赖性细胞信号传导而抑制VLA-1功能。这类化合物的例子是小分子化合物，例如Weitz-Schmidt等，Nat. Med. 7:687-692, 2001中描述过的。鉴定这类化合物可以利用例如组合小分子库、组合抗体库、合理化药物设计以及传统有机合成，随后采用任意本领域已知方法筛选拮抗性来进行。
.在一个实施例中，可以用重组表达的VLA-1或其功能片段来筛选天然、半合成或合成化合物文库。特别有用的文库类型包括组合小有机分子文库、噬菌体展示文库和组合肽文库。
确定文库中的成分是否能与特定多肽结合的方法是本领域所熟知的。概括地说，将多肽靶借助非特异性或特异性结合附着到固体支持面。利用能识别该附着在固体支持物(例如平板或柱子)上的蛋白质的抗体来实现特异结合。替代的，可以通过表位标记物来达成特异结合，例如GST与覆盖谷胱甘肽的固体支持物的结合，或者IgG融合蛋白与蛋白A固体支持物的处合
z口 口 。
替代的，可以在噬菌体，例如M13的表面上表达重组表达的VLA-1或其部分。将处于流动相的文库在能促进靶物质与化合物的特异性结合的条件下进行培育。这样就可以鉴定到与靶物质有结合的化合物。替代的，可以将文库附着到固体支持物上，多肽目标处于流动相中。
化合物与VLA-1靶分子之间的结合可以通过多种方法确认。结合可以通过象竟争性ELISA或RIA这类技术得以鉴定，这类技术中所述化合物与靶分子的结合会降低抗体与同一靶分子的结合。这些方法是本领域所熟知的。另一个方法是用BiaCORE按照厂商提供的方法来测量靶分子和化合物之间的相互作用。 一种优选的方法是自动化高通量筛选，参见例如Burbamn等，Curr OpinChem Biol. 1: 72-8 (1997)和Schullek等，Anal Biochem. 246: 20-9(1997)。
26一旦鉴定到能够结合靶分子的候选化合物，就可以确定该化合物是否
能抑制靶分子的活性。例如说，可以用候选化合物来遴选其抑制K562-II依赖性附着到胶原蛋白IV的能力。参见例如，美国专利申请60/303689和WO 02/083854。在另一个实施例中，候选化合物被用于竟争抗VLA-1抗体与(1)VLA-1表达细胞或(2)含有11|31整联蛋白或其片段(例如(xl-I结构域)之间的结合。
另 一种鉴定VLA-1拮抗剂的方法是利用重組表达的VLA-1的结构进行合理化药物i殳计。参见例如WO 01/73444。
核酸拮抗剂
在一些实施方案中，核酸拮抗剂被用来减少编码VLA-1的内源基因的表达。在一个实施方案中，所述核酸拮抗剂是针对编码VLA-1的mRNA的siRI^A。也可以使用其它类型的阻断性核酸，例如dsRNA、核酶、能形成三链螺旋的核酸、适配体或者反义核酸。
siRNA是'j 、双链RNA (dsRNA),其可选择性地包含突出端。例如，siRNA的双链区长约18到25个核苷酸，例如大约19、 20、 21、 22、 23或24个核苷酸。典型情况中，siRNA序列与靶mRNA是完全互补的。dsRNA,特
例如，Clemens等(2000) Prac. iVa".爿cad Scz'. "&4 97:6499-6503; Billy等(2001) Prac. A^/. C/W 98:14428—14433; Elbashir等(2001) A^a加'e.411:494-8; Yang等(2002) Proc. Ato/. Jcad 5W. UW 99:9942—9947, U.S.20030166282， 20030143204， 20040038278和20030224432。
反义物可以包括，例如大约8到80个核苷石成基(即大约8到80个核香酸)，例如大约8到50个核普碱基，或者大约12到30个核苷碱基。反义化合物包括核酶、外部引导序列(EGS)寡核苦酸(寡核酶)和其它能与把核酸杂交，并调控其表达的短的催化性RNA或催化性寡核苷酸。反义化合物可以包括与靶基因中序列互补的一段至少8个连续核苷碱基。寡核苷酸不需要与其靶核酸序列100%互补才能进行特异性杂交。如果寡核苦酸与耙序列的结合能够干扰靶分子的正常功能，致使它失去用途；并且互补程度足以在特异结合所需要的条件下，寡核苷酸避免与非靶序列发生非特异性结合，该寡核苷酸即是可特异杂交的，其中所述特异结合所需条件，对于体内检测或治疗而言，就是生理条件；对于体外检测，就是做检测时使用的条件。反义寡核苷酸与mRNA(例如编码VLA-1的mRNA)的杂交可以影响到该mRNA的一或多种正常功能。要千扰的mRNA的功能包括所有关键功能，例如RNA到蛋白质翻译位点的移位、由RNA翻译为蛋白质、RNA剪切产生一或多种mRNA以及该RNA可以参与的催化活性。特定蛋白质与该RNA的结合也可以-故反义寡核苷酸与RNA的杂交所影响。
示范性的反义化合物包括能特异性杂交到靶核酸(例如编码VLA-1的mRNA)上的DNA或RNA序列。互补区可以延续大约8到80个核苷碱基。化合物可以包括一或多个带有修饰的核苷碱基。带有修饰的核苷碱基可以包括，例如5-取代的嘧咬，例如5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶；和C5-丙炔嘧。定，例如C5-丙炔胞嘧啶和C5-丙炔尿嘧啶。其它合适的带有修饰的核苦^^基包括N4 -(d -C12)烷氨基胞嘧啶和N N4 -(d -C12) 二烷氨基胞嘧啶。带有修饰的核苷碱基还可以包括7-取代-8-氮杂-7-脱氮嘌呤和7-取代-7-脱氮嘌呤，例如7-碘-7-脱氮噤呤、7-氰-7-脱氮。票呤、7-氨曱酰-7-脱氮噪呤。这类物质的例子包括6-氨基-7-碘-7-脱氮嘌呤、6-氨基-7-氰-7-脱氮嘌呤、6二氨基-7-氨曱酰-7-脱氮嘌呤、2-氨基-6-羟基-7-碘-7-脱氮嘌呤、2-氨基-6-羟基-7-氰-7-脱氮嘌呤和2-氨基-6-羟基-7-氨曱酰-7-脱氮嘌呤。此外，N6—(C,-C12)烷氨基噤呤和N6,N6 -C12) 二烷氨基嘌呤，包括N6 -甲基氨基腺嘌呤和N6,N6-二曱基氨基腺嘌呤也是合适的核苷碱基。类似的，其它6-取代的嘌呤包括，例如6-硫鸟噤呤可以构成合适的修饰核苦碱基。其它适用的核苦碱基包括2-硫尿嘧啶、8-溴腺噤呤、8-溴鸟嘌呤、2-氟腺噤呤和2-氟鸟噪呤。上述修饰核苷碱基的衍生物也是合适的。以上任意一种化合物的取代可以包括C,-C30烷基、C2-C3G烯基、C2-C3G炔基、芳环、芳烷基、杂芳基、盐、氨基、酰胺、硝基、硫、磺酰基、羧基、烷氧基、烷羰基、烷氧基羰基等等。
还有对其它类型的核酸物质的描述。参见例如，美国专利4,987,071、5,116,742和5,093,246; Woolf等(1992)A^//"&4;
朋c/ ZW/i, D.A. Melton， Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, N.Y. (1988); 89:7305—9; Haselhoff and Gerlach (1988) iVa加？334:585-59; Helene, C (1991) j""ca"cw Drag ￡)仏6:569-84; Helene (1992)J朋.U Jcfld 660:27-36;以及Maher (1992)所o^sa， 14:807-15。
本文描述的核酸，例如本文所述反义核酸，可以引入基因构建体作为基因治疗方案的一部分来递送核酸，后者可用于在细胞内表达和产生例如反义核酸这类物质。这些成分的表达构建体可以放入任何生物有效载体来 进行给药，所述载体是任何能将组分基因有效地递送到体内细胞的制剂或 组合物。方法包括将对象基因插入病毒载体，载体包括重组逆转录病毒、
月泉病毒-、A泉伴随病毒(adeno-associated virus)、 l曼病毒(lentivirus)和单纯疱渗 病毒-1,或者重组细菌或真核质粒。病毒载体直接转染细胞；质粒DNA的 递送可以借助例如阳离子脂质体(lipofectin)或其衍生物(例如，抗体偶联物)、 多聚赖氨酸偶联物、短杆菌肽S、人造病毒包膜或其它这类胞内载体，还可 以将基因构建体直接注射或体内CaP04沉淀。
将核酸体内介导到细胞内的 一 种有效方案是利用含有该核酸(例如 cDNA)的病毒载体。用病毒载体感染细胞的好处是大部分的靶细胞都能接收 到核酸。此外，病毒载体内编码的分子，例如病毒载体含有的cDNA所编 码的分子能够在摄取了所述病毒载体核酸的细胞中有效地表达。
逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体可以作为重组基因递送系统用于外 源基因转移到体内，尤其是转移到人体内。这些载体能够有效地将基因递 送到细胞内，然后被转移核酸稳定地整合到宿主的染色体DNA中。制备重 组逆转录病毒和用这类病毒在体外或体内感染细胞的实验方案可以在 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel， F.M.等 (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14或其它常规实验室手册中查 找。合适的逆转录病毒的例子包括本领域技术人员公知的pLJ、 pZIP、 pWE 和pEM。用于制备亲嗜性逆转录系统和兼嗜性逆转录系统的合适的包装病 毒系的例子包括甲Crip，甲Cre,甲2 and ^Am。逆转录病毒曾被用于将多种基 因导入许多不同细胞类型，其中包括体外和/或体内导入上皮细胞(参见例如 Eglitis等(1985) Scz.e"ce 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) /Voc. AW/, ylcad >SW. 85:6460-6464; Wilson等(1988)尸rac. A^/. ^cac/. 5W. (7514 85:3014-3018; Armentano等 (1990)尸rac. 7Va/7. Xcat/. 5W, 87:6141-6145; Huber等(1991) Prac. 7Va", Jcad 88:8039-8043; Ferry
等(1991)尸rac. A^/.爿cad Sc/. 88:8377-8381; Chowdhury等(1991)
5We"ce 254:1802-1805; van Beusechem等(1992) JVoc. A^/. Jcad 175/4 89:7640-7644; Kay等(1992) /fwwa" 77^ra;^ 3:641-647; Dai等(1992) 尸rac. M7f/. /4cad SC. 89:10892-10895; Hwu等(1993) /mm朋o/.
150:4104-4115;美国专利4,868,116和4,980,286; PCT申请WO 89/07136;
29PCT申请WO 89/02468; PCT申请WO 89/05345;以及PCT申请WO 92/07573)。
另一个病毒基因递送系统利用了由腺病毒衍生的载体。参见例如， Berkner等 (1988)肠rec—酒6:616; Rosenfeld等 (1991) 252:431-434;和Rosenfeld等(1992) CW/68:143-155。合适的腺病毒载体来 源于腺病毒林Ad型5dl324或者其它腺病毒抹(例如,Ad2,Ad3,Ad7等)， 这些都是本领域技术人员已知的。
再一种可用于递送目标基因的病毒载体系统是腺伴随病毒(AAV)。参见 例如，Flotte等(1992) ^m. i e^z>, Ce〃. Mo/.所o/. 7:349-356; Samulski等 (19S9) Wra/. 63:3822-3828 ; 和McLaughlin等 (1989) 乂 M>ol. 62:1963-1973。
适配体
适配体是能用于识别并特异结合包括细胞表面蛋白质在内的几乎任何 分子的短寡核香酸序列。指数扩增适配体的系统进化技术(SELEX)非常强 大，可以用来很容易地鉴定到这类适配体。许多有治疗和诊断意义的蛋白 质，例如生长因子和细胞表面抗原都可以给它们制备适配体。这些寡核苷
(2006) Handb Exp Pharmacol. 173:305-26)。 Macugen⑧是获得批准的一种适配 体制剂，这也是第一个被批准用于常见眼睛疾病的抗血管生成试剂。 人工转录因子
人工转录因子也可以用于调节VLA-1的表达。可以根据例如其结合编 码VLA-1的内源基因中的一段序列的能力来设计或者从文库中选择人工转 录因子，这段序列例如是调控区，例如启动子。例如，可以通过体外(例如 利用噬菌体展示，美国专利6534261)或体内选择，或者在识别编码的基础 上设计(参见例如，WO 00/42219和美国专利6，511,808)来制备人工转录因 子。产生不同锌指结构域文库的方法可以参见例如Rebar等(1996) M"/wA ￡/"歸/ 267:129; Greisman and Pabo (1997) Sc/ewce 275:657; Isalan等(2001) tVW,历ofec/wo/ 19:656;和Wu等(1995)尸rac iVa"」c^/. <SW. OS/i 92:344。
任选的，可以将人工转录因子融合到转录调控结构域上，例如融合到 激活结构域上来激活转录，或者融合到阻遏结构域来抑制转录。特別是可 以利用阻遏结构域来降低编码VLA-1的内源基因的表达。人工转录因子本身可以由 一个递送到细胞内的异源核酸编码，或者该蛋白本身净皮递送到细
胞内(参见例如，美国专利6534261)。包含编码人工转录因子的序列的异源 核酸可以可操纵地连接在一个可诱导启动子上，从而例如能够精细地调节 位于或者靠近发生中风损伤或文中描述之其它损伤的部位的细胞(例如神经 元或神经胶质细胞)内的人工转录因子水平。 缺血性损伤(ischemic injury)
缺血是指对某组织的供血减少或消失。本文描述的方法可以用于治疗 与缺血相关的损伤，或者"缺血性损伤"。缺血性损伤包括发生在例如肾、肝、 肺、胰、骨骼肌、小肠、心脏和脑部的损伤。缺血性损伤可以是与以下状 况相关，或者就是由它们引起的例如急性心肌梗死(acute myocardial infarction)、 选才奪'1"生血管成形术(elective angioplasty)、 冠d犬动月永#吝桥术 (coronary artery bypass graft)、 涉及心脏搭桥(cardiac bypass)或者器官或组织 移植的手术(例如，心脏移植)、移植后的组织排斥、移植物抗宿主病、中风、 头夕卜伤(head trauma)、 溺水(drowning)、脓毒症(sepsis)、 心脏骤停(cardiac arrest) 、 4木克(shock)、 动月永辣5才羊石更4匕(atherosclerosis)、 高血压(hypertension)、 可卡因诱发的心脏病、吸烟诱发的心脏病、心脏衰竭(heart failure)、肺动脉 高压(pulmonary hypertension)、 大出血(hemorrhage)、 毛细血管'渗漏综合4正 (capillary leak syndrome)(例如儿童和成人呼吸窘迫综合征)、多系统器官功 能衰竭、低胶体膨胀压状态(a state of low colloid oncotic pressure)(例如饥饿 (starvation),神经性厌食症(anorexia nervosa)或或者肝功能衰竭并血清蛋白 产量下降)、过敏反应、体温过低(hypothermia)、冷伤(cold injury)(例如，由 于低温液体灌注(hypothermic perfusion)或者冻伤(frostbite)造成的)、肝肾综 合征(hepatorenal syndrome)、 震颤儋妄(delirium tremens)、 撞伤(a crush injury)、 肠系月莫血管供血不足(mesenteric insufficiency)、夕卜周血管病变 (peripheral vascular disease) 、 j 皮4亍(claudication)、 》克伤(burn)、 电死 (electrocution)、 药物过量i秀发的血管名于张(excessive drug—induced vasodilation)、 药物过量i秀发的血管4欠缩(excessive drug—induced vasoconstriction)、放射照射(例如，在做荧光镜透视或放射性成像的过程中) 或者接触高能量，例如经受了激光照射。药物过量诱发的血管舒张可以是 由例^口^肖普盐(nitroprusside)、 hydralazone、 dyazoxide、 4丐通道阻断剂,或者 普通麻醉药引起的。药物过量诱发的血管收缩可以是由例如新福林(neosynephrine)、 异丙肾上腺素(isoproterenol)、 多巴胺(dopamine)、 多巴酚 丁胺(dobutamine)或可卡因(cocaine)引起的。 在夬血-再灌注损伤
"缺血-再灌注损伤，，是指到身体某部位的血流暂时停止后，重新恢复(再 灌注)而引起的损伤。例如，缺血-再灌注损伤可以在一些手术过程中发生， 例如主动脉瘤修复和器官移植。在临床上，缺血-再灌注损伤可以表现为以 下并发症，例如包括成人呼吸窘迫综合征在内的肺功能障碍、肾功能障碍、 消耗性凝血病(包括血d、板减少、纤维蛋白沉积到微血管构筑和弥散性血管 内凝血)、短暂和长期脊髓损伤、心率失常和急性缺血情况、包括急性肝细 胞损伤和坏死的肝功能障碍、胃肠功能障碍(包括大出血和/或梗死)，以及 多系统器官功能障碍(multisystem organ dysfimction, MSOD)或者急性全身性 j^寸生窘迫纟宗合^正(systemic inflammatory distress syndromes, SIRS)。 这种4员4另 可发生在供血中断的身体部位，或可发生在局部缺血时，供血充足的部位。
中风
中风是用于描述由于血管的疾病或损伤而导致的急性脑损伤的一个宽 泛的名词。中风可以划分为至少两个主要类型出血性中风(血液渗漏到正 常血管之外造成的)和缺血性中风(缺乏供血造成的大脑缺血)。可以引起缺 血性中风的事件包括血栓形成、栓塞和系统性低灌注(及由此产生的局部缺 血和在夹氧)。
由于缺氧和继发性事件，中风通常会导致神经元死亡和脑损伤。因为 缺少供血或其它损害而死亡的脑区域被称为梗死。在一些情况中，可以利 用本文描述的疗法，通过例如减少引发神经元死亡或损伤的继发性事件使 得梗死的面积减少或最小化。
脑动脉壁上逐渐累积的血栓所造成对大脑动脉的障碍通常称为大脑血 栓形成。在脑栓塞中，阻碍大脑动脉的闭塞物质出现在血液循环的下游(例 如，栓塞由心脏被带到脑动脉)。因为要分辨中风是由血栓还是栓塞引起的 很困难，就用名词血栓栓塞症来包括这两种类型的中风。系统性低灌注可 以是由血液流量下降、红细胞压积下降、血压低或者心脏不能充分地泵血 造成的。
溶栓剂，例如组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)曾被用于治疗血栓栓塞型
32据信最有效的是在急性中风后尽快给予(优选在3小时以内)，以便至少部分
恢复缺血区域的大脑血流并维持神经元的活性。可以用VLA-1拮抗剂来代 替溶栓剂或者与溶栓剂联合给予，从而给发生了血栓栓塞性中风的受试对 象带来治疗上的帮助。
由于溶栓剂会恶化出血情况，它们被禁止用于出血性中风。然而， VLA-1拮抗剂对于出血性中风也能提供治疗性益处。
此外，VLA-1拮抗剂可以作为预防性中风疗法给予，或者作为疗法的 一部分给予发生过TIA或者显示出TIA症状的受试对象。如果中风的症状 持续了24小时以下，受试对象完全恢复了，该受试对象被认为是经历过短 暂性缺血发作(TIA)。 TIA的症状包括语言、视力、感觉或运动能力的暂时 性受损。因为TIA经常被认为是全面中风的前奏，罹患TIA的受试对象是 接收预防性中风疗法的对象，例如单独给予VLA-1拮抗剂；或者与另一种 药剂，例如抗凝血剂(例如香豆素和肝素)或抗血小板剂(例如阿司匹林和噻 氯匹定(ticlopidine))联合给予。
其它中风疗法
中风疗法可以包括使用一或多种VLA-1拮抗剂，该拮抗剂可以与一或 多种中风疗法联合使用。这些疗法可以同时给予，也可以分别给予，例如 在特定间隔的时间，例如同样的48、 24、 12、 6、 2或1小时内。此外，治 疗可以采用不同的给药方式。
可以与VLA-1拮抗剂联合给药的治疗包括溶栓剂(例如，链激酶、乙 酰化的纤溶酶原-链激酶活化因子复合体(APSAC)、尿激酶、单链尿激酶-纤 溶酶原活化因子(scu-PA)、抗炎药、来自蛇毒的凝血酶样酶类，例如安克洛 酶、凝血酶抑制剂、组织纤溶酶原活化因子(t-PA)以及上述物质的生物活 性变体)；抗凝剂(例如，华法林或肝素)；抗血小板药物(例如，阿司匹林)； 糖蛋白nb/IIIa抑制剂；糖胺聚糖；香豆素；GCSF;褪黑素；caspase抑制 剂；抗氧化剂(例如NXY-059,参见Lees等，(2006) M五"g/. ■/ Med 354， 588-600);神经保护剂(例如，NMDA受体拮抗剂和大麻素拮抗剂)；抗-CD18 抗体；抗CDlla抗体；抗ICAM-1抗体；抗VLA-4抗体；抗TWEAK抗 体；抗TWEAK-R抗体；颈总动脉内膜切除(carotid endarterectomy);血管成 形术(angioplasty);支架植入；以及替代性医学(例如，针灸(acupuncture)、中 药(traditional Chinese medicine) 、 4丁4i(meditation)、才姿乂挛(massage)、 高压牵、
33治疗(hyperbaric oxygen treatment)或者4亍为亏1导(conductive pedagogy))。
联合治疗的具体例子包括，将VLA-1拮抗剂与另一种疗法(例如t-PA) 在受试对象出现中风症状后不久，同时给予该对象。第二天，可以进一步 开始每天给予受试对象抗血小板药物以防未来再发生中风，迟一些再给予 附加的VLA-1拮抗剂来保持VLA-1拮抗剂的生物利用度。另一个例子，发 生过TIA的受试对象可以在作出TIA诊断后立即开始VLA-1拮抗剂治疗， 其剂量提供至少一个周的生物效果，然后第二天开始抗血小板治疗。 中风的危险因素
中风的危险因素可以用于鉴别那些能被给予预防剂量的VLA-1拮抗剂 的受试对象，或者应当进行监测看是否有需要用VLA-1拮抗剂进行治疗的 进一步症状。在一些情况中，如果有一、二、三或四或者更多种例如以下 列出的危险因素，应对受试对象进行治疗。
高血压高血压(140/90 mm Hg或更高)是中风的一个非常重要的危险 因素。
吸烟吸烟是中风的一个主要并且可以防止的危险因素。香烟烟雾中 的尼古丁和一氧化碳会减少血液中的氧气量。它们还会损害血管壁，使得 更可能形成血块。使用一些种类的避孕药结合吸烟极大地提高中风的危险。
糖尿病糖尿病的定义是两次测得空腹血装葡萄糖(血糖)浓度 126mg/dL或更高。糖尿病虽然是可以治疗的，患有该病还是会提高中风的 危险。许多糖尿病患者同时有高血压、高血脂，超重。另外的这些因素进 一步提高了中风的危险。
颈总动脉或其它动脉疾病脖子上的颈总动脉负责给大脑供血。由于 动脉硬化而沉积的脂肪使得颈总动脉变窄(斑块在动脉壁上逐渐积累)，可能 被血块阻塞。颈总动脉疾病又称为颈总动脉狭窄。
外周动脉疾病患有外周动脉病的受试对象得颈总动脉病的可能更大， 因此他们发生中风的危险更高。外周动脉病是运血到腿和手臂肌肉的血管 变窄。它是由动脉壁上斑块脂肪累积引起的。
心房纤维颤动会提高中风的危险。心脏的上心室不能有效地跳动，而 是颤动，这会使得血液聚集而形成血块。如果血块裂开，进入血流并停留 在通向大脑的动脉，就会造成中风。
其它心脏疾病患有冠心病或心脏衰竭的受试对象比心脏功能正常的人有更高的中风危险。扩张性心肌病(心脏扩大)、心瓣膜病和一些类型的先 天性心脏病也会增加中风的危险。
短暂性缺血发作(TIA): TIA是"警告性中风"，它会产生类似中风的症 状但没有持续性的损伤。识别出TIA并进行治疗能够减少严重中风发作的危险。
一些血液病红细胞数目高会使血液变稠，更可能产生血块。这一点 会增加中风的危险。镰刀形细胞病(又称为镰刀形细胞贫血)是一种主要影响 非裔美国人的遗传病。"镰刀形，，红细胞携带氧气到人体组织和器官的能力较 低，容易粘在血管壁上，就会阻塞通向脑部的动脉，引起中风。
高胆固醇血症血液中的总胆固醇水平高(240 mg/dL或更高)是引起心 脏病的一个主要因素，而心脏病会增加中风的危险。高水平LDL胆固醇(高 于100mg/dL)和甘油三酯(血脂，150mg/dL或更高)会增加曾发生过冠心病、 缺血性中风或短暂性缺血发作(TIA)的人群的中风危险。低水平(低于 40mg/dL)HDL胆固醇也会增加中风的危险。
不运动和肥胖不爱运动、肥胖或者兼具两者会增加发生高血压、高 胆固醇血症、糖尿病、心脏病和中风的危险。
物质滥用(excessive substance abuse):饮用过量酒精和静脉用毒品也会 增加中风的危险。
年龄增长尽管所有年龄段的受试对象，包括儿童都会发生中风，随 着年龄增长，中风的危险增加。例如，发生中风的危险在55、 60、 65、 70、 80或85岁以上大增。
性别中风在男性中比女性中常见。多数年龄组中，男性比女性在具 体一年中发生中风的更多。但是，女性占全部因中风死亡的一半以上。怀 孕妇女中风的危险更高。
遗传(家族史)如果父母、祖父母、姐妹或兄弟曾发生中风，该人中风 的可能性更高。类似的， 一些人种上的背景会导致更高的中风危险。
中风或心脏病突发史(prior stroke or heart attack):曾发生中风或心脏病 突发的受试对象后来再发生中风的可能性要高的多。
中风评估标准
VLA-1拮抗剂对患有中风或有中风危险的受试对象的治疗能力可以例
如采用多种标准来进行客观或主管的评价。有许多评估工具可以提供这种评价。
示范性的就医前(prehospital)中风评估工具包括Cincinnati Stroke Scale 和Los Angeles Prehospital Stroke Screen (LAPSS)。紧急评估量表包4舌例如 Canadian Neurological Scale (CNS)、 Glasgow Coma Scale (GCS)、Hempispheric Stroke Scale 、 Hunt & Hess Scale 、 Mathew Stroke Scale 、 Mini-Mental State Examination (MMSE)、 NIH Stroke Scale (NIHSS)、 Orgogozo Stroke Scale、 Oxfordshire Community Stroke Project Classification (Bamford)以及 Scandinavian Stroke Scale。功能性^平估量表包4舌Stroke Specific Quality of Life Measure (SS-QOL)。々史果i平估工具包4舌American Heart Association Stroke Outcome Classification (AHA SOC)、 Barthel Index 、 Functional Independence Measurement (FIMTM)、 Glasgow Outcome Scale (GOS)以及Health Survey SF-36 & SF-12TM。其它诊断和筛选测试包括Action.Research Arm Test、 Blessed-Dementia Scale、 Blessed-Dementia Information-Memory-Concentration Test、用于诊断血管性痴呆的DSM-IV标准、Hachinl(ski Ischaemia Score、 Hamilton Rating Scale for Depression用于诊断血管性痴呆的NINDS — AIREN 标准、Orpington Prognostic Score 、 Short Orientation-Memory-Concentmtion Test、 Thrombosis In Myocardial Infarction grading scheme 、 MRI 成像(例如，弥散及灌注成像技术(Henninger等，Stroke 37:1283-1287, 2006)、 弥漫加权(DWI) MRI技术和血流敏感》兹共振技术，例如，液体衰减反转恢 复(FLAIR))、功能和光谱成像(Koroshetz, Ann. Neurol. 39:283-284, 1996) 以及PET (Heiss等，Cerebrovasc. Brain Metab. Rev. 5:235-263， 1993)。
评估可以在给予VLA-1拮抗剂之前和/或之后进行。
创伤性脑损伤
本文描述的VLA-1拮抗剂可以用于治疗创伤性脑损伤。物理外力造成 的对脑的伤害统称为创伤性脑损伤(TBI)。因为脑结构和/或功能的变化，TBI 的后果导致正常的大脑程序发生改变。两种基本的脑损伤类型是开放性脑 损伤和闭合性脑损伤。在开放性脑损伤中，物体(例如子弹)穿透卢贞骨，破坏 脑组织。闭合性脑损伤通常是由于头部的快速运动，大脑前后晃动，脱离 了颅骨内部而造成的。闭合性脑损伤是两者中最常见的，通常是由涉及机 动车的事故或者坠落导致的。在闭合性脑损伤中，强力或剧烈晃动损伤了 大脑。这一快速运动的压力撕开拉扯着神经纤维或轴突，切断了大脑不同
36部位之间的连接。多数情况中，随之产生的血块或血胂可能会沖到大脑上 或其周围，使头内部压力升高。开放性和闭合性脑损伤都会对大脑产生严 重伤害，因此急需医学救护。
根据击中头部的外力的类型，可以造成以下的不同损伤大脑在颅骨 内震荡、脑震荡、颅骨破裂、挫伤、硬膜下血肿或弥漫性轴索损伤。虽然 每个人的经历不同，许多TBI患者都会面临同样的问题。有记载的可能性 包括难以集中精力、解决问题不力、短期和长期记忆力问题以及运动或感 觉技能受损；甚至不能独立完成日常生活技能，例如吃^1、穿衣或洗澡。 对于脑损伤最被广泛接受的观点将其分为原发性和继发性事件。原发性脑 损伤被认为在发生刺激的时候或多或少已经完全，而继发性损伤在发生创 伤后的几小时到几天还会发展。
原发性损伤通常与紧急状况有关，例如汽车事故或任何造成暂时失去 意识或颅骨发生破裂的事件。挫伤，或类似瘀青的损伤经常出现在发生刺 激的位置。闭合性脑损伤后大脑在颅骨内的移动和旋转给大脑中长的连接 神经纤维或轴索造成剪切损伤，称为弥漫性轴索损伤。挫裂伤定义为大脑 在颅骨内旋转越过嵴造成的对额叶和顶叶或者血管的撕裂。损伤使得小血 管破裂时会产生血肿或血块。血肿和血块可以出现在颅骨和大脑之间(硬膜 上或硬膜下血肿)，或者在脑容物内部(脑内血肿)。任一情况中，如果血肿 足够大都会挤压或者移动大脑，伤害到脑干内的敏感结构。它们还会提高 ,贞骨内的压力，最终使大脑供血停止。
人们逐渐认识到细胞水平的延迟性继发性损伤是造成脑损伤后組织丧 失的主要原因。损伤组织内发生一系列生理、血管和生化事件。这个过程 涉及到许多系统，包括神经肽、电解质(例如《丐、镁)、兴奋性氨基酸、花生 四烯酸代谢物(例如前列腺素和白三烯)可能发生变化，以及形成氧自由基。 这种继发性组织伤害是脑损伤人群可能经历的多数严重长期不良影响的基 础。减少伤害的程序可能产生从康复到正常或接近正常状态，或者永久性 残疾这才羊的不同。
有越来越多的证据表明弥漫性血管损伤是脑损伤的一个主要部分。血 管反应似乎是两个阶段的。根据创伤的严重程度，早期变化包括血压开始 升高，脑血管的自动调节丧失，以及血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)暂时
失效。血管变化在损伤后大约6小时达到顶点，但也可能持续6天。这些血管变化的临床意义还不清楚，但可能是与延迟大脑肿胀有关，后者在特 别是较年轻人群常见。
脑挫伤产生脑坏死的过程同样很复杂，也会持续几个小时。毒性过程 包括释放氧自由基、破坏细胞膜、离子通道开放，涌入钙离子、释放细胞 因子以及游离脂肪酸代谢成可能引起血管痉挛和缺血的高度反应性物质。 几乎所有继发性损伤在某个时刻都会形成自由基。自由基的首要目标是细 胞膜上的脂肪酸。被称为脂质过氧化的过程会以几何进展的方式破坏神经 元、神经胶质和血管细胞膜。如果不受限制，脂质过氧化会在细胞膜表面 蔓延，最终导致细胞死亡。因此，自由基能破坏内皮细胞、中断血脑屏障(BBB)
并直接损伤脑细胞，造成水肿以及神经元和神经胶质的结构变化。BBB被 打破会造成脑水肿，使脑细胞暴露在血液携带的伤害性产物中。
(脑外的)继发性系统伤害可能随之S1起对大脑的进一步破坏。这种情况 在所有严重程度的脑损伤之后都是非常常见的，特别是如果与多个损伤有 关。因此，发生脑损伤的人群在脑损伤之后的几天内，反复出现低血氧、 血压；心脏和肺部变化；发烧；凝血紊乱以及其它不良变化等一系列状况。 发生不良事件时，大脑血管可以借助正常的调节机制得到放松，从而保证 充足的供氧、供血，而当这一机制因为最初的创伤受损时，就会出现这些 状况。
即时评估的方案在其效率和可靠性方面有局限性，而且经常是侵入式 的。计算机辅助的X射线断层(Computer-assisted tomography, CT)扫描是目 前被认可的评价TBI的标准诊断程序，因为该技术可以鉴定到许多与原发 性脑损伤相关的异常，而且普遍可以提供，花费相对较低(Marik等Chest 122:688-711 2002; McAllister等 Journal of Clinical and Experimental Neuropsychology 23:775-791 2001)。但是，不同医院在给送急诊的TBI患者 使用CT扫描做诊断和管理方面不同，CT扫描结果本身可能也不能很好地 指示TBI受试对象的神经精神症状，特别是轻度TBI损伤的情况(McCullagh 等Brain Injury 15:489-497 2001)。
对TBI的即时治疗通常包括手术控制脑部或周围的流血，监测和控制
脑损伤的患者经常存在一些很微妙的症状，治疗有可能因此延迟了几天甚 至几周。患者一经决定寻求医学救护，就可以采用观察、神经学检测、核
38》兹共4展(magnetic resonance imaging, MRI)、 正电子断层(positron emission tomography, PET)扫描、单光子发射CT (single-photon emission, SPECT)扫描、 监测脊髓液中神经递质的水平、电脑X-射线断层(CT)扫描以及X-射线来确 定患者损伤程度。损伤类型和严重程度决定进一步的护理。
VLA-1拮抗剂可以单独或者与另一种治疗联合使用，从而给发生TBI 的受试对象带来治疗上的帮助。此外，VLA-1拮抗剂可以作为预防性TBI 疗法，或者疗法的一部分给予发生TBI或者显示TBI症状的受试对象。例 如，VLA-1拮抗剂可以用于治疗原发性损伤、继发性损伤或者这两者。替 代的，可以用VLA-1拮抗剂来治疗原发性损伤，并作为继发性损伤的预防 性疗法。在给予VLA-1拮抗剂之前和/或之后可以进行评i"介。
脊髓损伤
本文描述的VLA-1拮抗剂可以用于治疗脊髓损伤。脊髓损伤(SCI)是对 脊髓的破坏，会导致其正常的运动、感觉或自主功能发生暂时或永久性改 变。临床和实验研究均证明在急性SCI后，脊髓会受到原发性和继发性破 坏。原发性SCI源于机械破坏、挫伤、硬膜外病理或者神经元成分的脱离。 这种损伤通常与脊柱的折断和/或错位一起发生。但是，原发性SCI在没有 脊柱断裂或错位的情况下也可能发生。子弹或武器造成的穿透性损伤也可 能导致原发性SCI (Burney等，Arch Surg 128(5): 596-9(1993))。更常见的是， 脱位的骨片穿透骨髓或者造成节段脊神经损伤。硬膜外病理也可能引发原 发性SCI。脊髓硬膜外血胂或脓肿会导致急性脊髓压迫和损伤。转移性癌带 来的脊髓压迫是一种常见的肿瘤学A的危急情况。脊柱在有或没有屈曲和/ 或伸展时进行的纵向牵张，可能导致原发性SCI而不伴有脊柱断裂或错位。 VLA-1拮抗剂可以用于治疗原发性脊髓损伤。
继发性SCI的病理生理学涉及到在损伤后的最初几天进展的多重细胞 和分子事件(Tator, Brain Pathology 5:407-413 (1995))。继发性SCI最重要的 起因是通向脊髓的血管发生损伤，后者是因为击打引起的动脉破裂、动脉 血栓以及低灌注造成的。对脊髓动脉的破坏或撞击所造成的局部缺血可能 造成SCI。因为缺血造成的SCI可能发生在一些主动脉血被暂时性止流的手 术过程中。本文描述的VLA-1拮抗剂可以用于治疗或防止继发性SCI损伤。
脊髓损伤还可能由于毒性造成的(Tator， Brain Pathology 5:407-413 (1995))。脊髓损伤最值得重视的毒性之一是兴奋性氨基酸神经递质的累积和随后带来的伤害。谷氨酰胺引发的神经兴奋毒性造成细胞内钙浓度升高。 然后升高的胞内鈣离子又导致钩依赖性蛋白酶或酯酶被激活，这些酶类因 为能降解细胞骨架成分(包括神经)和溶解细胞膜而造成进一步的损伤。过量 产生的花生四烯酸和类花生酸，例如前列腺素可能与脂类过氧化和氧自由 基有关。从受损的神经元膜释放的血管活性类花生酸可能随后通过引发血 管痉挛而导致进行性创伤后局部缺血。内源性阿片样物质因其对局部或系 统血液循环的功效或者直接作用于受损的脊髓，可能也参与到继发性损伤
过程中。本文描述的VLA-1拮抗剂可以用于治疗或防止毒性造成的脊髓损伤。
脊髓损伤后可能发生明显和进行性水肿。水肿本身是损伤性的，还是 它是另外的损伤机制(例如缺血或谷氨酰胺毒性)的附属现象，这一点还是未 知的。在实验模型和临床病例中，水肿均可能在脊髓内由损伤部位向头端 和尾端蔓延相当长的距离。
4要月褒American Spinal Injury Association (ASIA) Impairment Scale, SCI 根据其损伤程度可以划分为完全和不完全型。在完全型SCI中，最低的骶 段没有感觉和运动功能(Waters等，Paraplegia 29(9): 573-81(1991》。在不完全 SCI中，损伤平面以下，包括最低的骶段还留存着感觉和运动功能(Waters 等，Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 75(3): 306-11 (1994》。不 完全骨髓损毁可能发展成更完全的损毁。更常见的是，最初的损伤发生后 的几小时到几天内，损伤程度提高了 一或两个脊髓水平。
SCI的其它分类包括中央型脊髓损伤综合征、脊髓半侧损伤综合征、前 脊髓综合征、脊髓圆锥综合征和马尾综合征。中央型脊髓损伤综合征经常 与颈区域损伤有关，损伤造成上肢比下肢更无力，保留有骶骨感觉。脊髓 半侧损伤综合征涉及到脊髓的半横段损毁，导致同侧本体感觉和运动功能 丧失，以及对侧丧失对疼痛和温度的感觉。前脊髓综合征经常与那些导致 不同程度地丧失运动功能和对疼痛及温度的感觉，而保留了本体感觉的损 毁有关。脊髓圓锥综合征与骶髓和腰神经根的损伤有关。该综合征的特征 在于膀胱、肠道和下肢反射消失，而骶节偶尔显示余存的反射(例如，球海 绵体肌和排尿反射)。马尾综合征是由于推管内的腰骶神经根发生损伤，造 成膀胱、肠道和下肢反射消失。
SCI可能造成神经源性休克(Tator， Brain Pathology 5:407-4] 3 (] 995))。神
40经源性休克是指在急性SCI中，由于自主神经失调和交感神经系统控制被 破坏而造成的低血压、心动过緩和外周血管舒张这组血流动力学三联体, 它与脊髓和低血容量性休克不同。低血容量性休克常与心动过速相关联。 脊髓休克被界定为特定平面以下，包括反射和直肠张力在内的所有神经功 能的完全丧失，它与自主神经失调相关联。因为释放儿茶酚胺，血压首先 会升高，然后出现低血压。可观察到弛缓性麻痹(包括肠道和膀胱的)，有时 会发展成阴茎持续勃起。这些症状常会持续几小时到几天，直到损伤平面 以下的反射弧重新开始发挥功能。
目前SCI的疗法旨在提高该病患者的运动功能和感觉能力。皮质类固
醇是治疗的主力。糖皮质激素，例如曱基强的松龙被认为能够减少急性SCI 的继发性事件，在非侵入式急性SCI中使用高剂量曱基强的松龙已成为北
美的医护常规做法。
本文描述的VLA-1拮抗剂可以用于治疗本文所述任何类型的SCI或其 症状。VLA-]拮抗剂可以单独使用或者与另 一种SCI的已知疗法联用。 药物组合物
可以将VLA-1拮抗剂(例如，抗VLA-1抗体)配制成药物组合物，以便 给予受试对象治疗中风、TBI或SCI。通常，药物组合物包括医药可接受载 体。本文中，"医药可接受载体"包括任一种和全部溶剂、分散介质、包衣、 抗细菌剂和抗真菌药剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及类似的生理兼容物质。 所述组合物可以包括医药可接受盐类，例如酸加成盐或4^加成盐(参见例如， Berge， S.M.,等(1977) /尸/z,. 5W, 66:1-19)。
VLA-1拮抗剂可以按照常规方法进行成剂。药物制剂是非常成熟的工 艺，在以下文献中有进一步描述，例如Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed" Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); 以及Kibbe (ed.)， Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3 rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X)。
在一个实施方案中，可以将VLA-1拮抗剂(例如，抗VLA-1抗体)与赋 形材料，例如氯化钠、七水磷酸氬二钠、磷酸二氢钠，以及一种稳定剂进 行成剂。可以将VLA-1例如以合适的浓度在緩冲溶液中提供，保存于2-8°C。所述药物组合物可以是多种形式。包括例如，液态、半固态、和固态 剂量形式，例如液态溶液(例如，用于注射的和用于灌注的溶液)、分散剂或 悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期的给药 方式和医疗应用。本文所述试剂的典型药物组合物是注射和灌注液形式的。
这些药物组合物可以通过肠胃外形式进行给药(例如静脉内、皮下、腹
腔(imraperitoneal)或肌内注射)。短语"肠胃外给药()"和"经肠胃外给予"用于 本文意味着除了肠道和局部(topical)给药之外的方式，通常是经注射，以及 包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内(intrathecal),关节嚢内 (intracapsular)、 眶内(intraorbital)、 心内(intracardiac)、皮内(intradermal)、月复 月空、经气管(transtracheal)、 皮下(subcutaneous)、 表皮下(subcuticular)、 关节 内(intraarticular)、 一皮月莫下(subcapsular)、虫朱网月莫下(subarachnoid) 、 管内 (intraspinal)、石更月莫夕卜(epidural),大月卤内(intracerebral)、户贞内(intracranial)、颈 总动脉内(intracarotid)以及胸骨内(intrastemal)注射和灌注。
所述组合物可以制成溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或其它适合高浓 度储存的有序结构。无菌注射液的制备可以通过将本文描述的试剂以所需 用量，按照需要与上面列举的成分之一种或几种合并引入合适的溶剂，然 后过滤除菌。通常，分散剂的制备是将本文描述的试剂引入无菌载体，后 者含有基本分散介质和所需的其它上述成分。对用于制备无菌注射液的无 菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而产生本文所述试剂 的粉末和其它来自先前无菌过滤的溶液的所需成分。保持溶液的适宜流动 性可以通过例如使用包衣(例如卵磷脂)、对于分散剂，可以通过保持所需颗 粒大小、以及使用表面活性剂。注射用药物组合物要延长吸收过程可以在 组合物中包含能够延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶。
在一些实施方案中，VLA-1拮抗剂可以与载体一起制备，所述载体能 够保护化合物不被快速释放(例如制备成控制释放制剂)，包括植入物和微嚢 化的递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性的高分子，例如乙烯醋 酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、胶原 蛋白、聚正酯(polyorthoesters)以及聚乳酸。制备这类制剂的许多方法都是已 授予专利权的，或普遍知道的。参见例如，5Wto/"ed朋c/ Co"fro〃ec/ Z>wg De//ver_y tSy^ewM,丄R, Robinson, ed" Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
42可以给VLA-1拮抗剂(例如抗VLA-1抗体)修饰上例如一个这样的基 团，该基团能够提高其稳定性和/或在循环系统，例如血液、血清或其它组 织的停留时间提高至少1.5、 2、 5、 10或50倍。可以对被修饰的拮抗剂进 行评估，(例如借助带有标记形式的拮抗剂)鉴定在发生中风、TBI或SCI之 后，它是否能到达损伤位点。
例如，可以给VLA-1拮抗剂(例如，抗VLA-1抗体)连接上聚合物，例 如基本无抗原源性的聚合物，例如聚环氧烷或聚环氧乙烷。合适的高分子 重量可以有很大不同。可以使用平均分子量在大约200到35000道尔顿(或 者大约1000到15000，和2000到大约12500)的聚合物。
例如，可以给VLA-1拮抗剂偶联上一个水溶性聚合物，例如亲水性聚 乙烯高分子，例如聚乙烯醇或者聚乙烯吡咯烷酮。这类聚合物的一个非限 制性名单包括聚环氧烷均聚物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙 烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，只要嵌段共聚物能够保持其水溶 性。其它有用的聚合物包括聚氧化烯(polyoxyalkylenes)，例如聚环氧乙烷、 聚环氧丙烷，以及聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(Pluronics)的嵌段共聚物；聚曱 基丙烯酸酯；卡波姆(carbomers)/交联聚丙烯酸树脂；以及分支或非分支的 多糖。
当VLA-拮抗剂(例如抗VLA-1抗体)与第二种试剂结合使用时，这两 种试剂可以分别成剂或一起成剂。例如，各自的药物组合物可以在给药前 混合，放在一起给药，或者在例如相同或不同时间分开给予。
给药
本文描述的VLA-1拮抗剂(例如，抗VLA-1抗体)可以通过多种方法给 予受试对象，例如人受试对象。对于许多应用来说，给药途径是下列之一 静脉注射或灌注(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)或者肌内注射。 一些情况 中，给药可以直接进入CNS，例如推管内、侧脑室内(ICV)、大脑内或颅内。 所述拮抗剂可以以固定剂量给予，或者按照mg/kg剂量给予。
还可以选择能减少或避免产生抗该拮抗剂的抗体的剂量。
所述阻断试剂的给药途径和/或方式还可以因人而异，例如通过利用断 层显像；神经学测试；以及与本文描述的中风、TBI或SCI的评价准则相关 联的标准参数来监测受试对象。
调节给药方案以便达到预期的反应，例如治疗反应或者组合治疗效果。通常，可以使用VLA-1拮抗剂(例如抗VLA-1抗体)(任选还有第二种试剂) 剂量的任何组合(分开的或者共同成剂的)，以便给受试对象提供生物可利用 量的该拮抗剂。例如，可以给予0.025 mg/kg—100 mg/kg、 0.05-50 mg/l(g、 0.1-30 mg/kg、 0,1-5 mg/kg或者0.3 - 3 mg/kg范围内的剂量。
剂量单位形式(dosage unit form)或者"固定剂量(fixed dose)"用于本文是 指适合给待治疗受试对象作为单位剂量的物理上独立的单元；每个单元含 有预定量的活性化合物，已计算好能够与必需的医药载体以及任选的其它 试剂联合产生预期治疗作用。
可以在中风症状或表现、TBI症状或SCI症状出现后大约IO分钟到48 小时，更优选大约IO分钟到24小时，还要优选的是3小时以内至少给予 一次VLA-l拮抗剂。可以给予单个或多个剂量。替代的，或者除此之外， 可以将拮抗剂经持续灌注来给予。治疗可以持续几天、几周、数月，甚至 数年以便使中风造成的局部缺血损伤最小化，中风后发炎造成的损伤最小 化；防止再一次中风或者尽量减小后面发生的中风可能带来的伤害；治疗 原发性或继发性TBI或症状；或者治疗原发性或继发性SCI或症状。
例如，如果受试对象有中风的危险或者已发生了 TIA,就可以在中风
开始之前给予所述拮抗剂作为一种预防措施。这种预防性处置的持续时间
可以是单个剂量的拮抗剂，或者可以将处置继续下去(例如，多个剂量)，例 如可以用拮抗剂处置有中风危险的受试对象几天，几周，数月，甚至数年
以便防止中风的发生。
药物组合物可以包含治疗有效量的本文描述的拮抗剂。所谓有效量可 以根据已给予的拮抗剂产生的效果来确定，或者如果使用了一种以上的试 剂，根据该拮抗剂和第二种试剂的组合效果来确定。拮抗剂的治疗有效量 也可以随多种因素而不同，这些因素包括例如病况、年龄、性别和个体体 重，以及化合物在个体体内引发所期望的反应的能力，例如改善至少一个 疾病参数，例如中风、TBI或SCI参数；或者改善至少一个疾病(例如中风、 TBI或SCI)症状。治疗有效量还是在这个用量，组合物在治疗上的有利效 果超过了它的任何毒性或不良影响。
装置和试剂盒
包含VLA-1拮抗剂(例如抗VLA-1抗体)的药物组合物可以用医学装置 来给予。装置应设计出以下特点，例如可携带性；可室温保存；以及便于使用，因此在紧急情况下，未经培训的受试对象可以使用，或者急救人员
室外使用；可转移到医疗设施和其它医疗设备。所述装置可以包括例如一 或多个保存包括VLA-1拮抗剂在内的医药制品的小室，并且能够用来递送 一或多个单位剂量的拮抗剂。
例如，所述药物组合物可以用无针头的皮下注射装置进行给药，例如 US 5,399,163、 ，383,851 、 5,312,335、 5,064,413、 4,941,880、 4,790,824或 4，5%，556中公开的装置。为人熟知的植入物和单元的例子包括 US 4,487,603,该专利公开了 一种可植入的微灌注泵，可以以控制好的速度 分散药物；[JS 4,486,194,该专利公开了 一种经皮给药的医疗装置； US 4,447,233,该专利公开了 一种医药灌注泵，可以以精确的灌注速度递送 药物；US4,447，224,公开了 一种可变速植入式灌注装置，用于连续地递送 药物；US4,439,196，公开了 一种具有多室隔间的渗透压药物递送系统；以 及US 4，475，196，该专利公开了 一种渗透压药物递送系统。许多其它的装置、 植入物、递送系统和单元也是已知的。
可以将VLA-1拮抗剂(例如抗VLA-1抗体)放入试剂盒来提供。在一个 实施方案中，所述试剂盒包括(a)—个容器，其含有包括VLA-1拮抗剂在内 的组合物；以及任选的(b)信息材料。所述信息材料可以是描述性的、指导 性的、宣传性的或其它与本文所述方法有关的材料，以及/或者涉及试剂的 医疗帮助的用途。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含治疗中风、TBI 或SC1的第二种试剂。例如，试剂盒包含含有组合物的第一个容器，其中 所述组合物包括VLA-1拮抗剂；和含有第二种试剂的第二个容器。
试剂盒中的信息材料的形式不受限制。在一个实施方案中，所述材料 可以包括关于化合物的生产的信息；化合物的分子量、浓度；有效期；产 品批号或生产地点等等。在一个实施方案中，所述材料是关于VLA-1拮抗 剂(例如，抗VLA-1抗体)的给药方法，例如以合适的剂量，剂型或给药方 式(例如，本文描述的剂量，剂型或给药方式)处置发生中风、TBI或SCI, 或者有中风、TBI或SCI危险的受试对象。这些信息可以以多种格式提供， 包括印刷文字、计算机可读材料、录像或录音，或者是提供到实体材料的 链接或地址的信息。
除了上述拮抗剂，试剂盒中的组合物可以包括其它成分，例如溶剂或 缓沖液、稳定剂或者防腐剂。拮抗剂可以以任何形式来提供，例如液态、
45干燥或冻干形式、优选是基本纯的并且/或者无菌的。试剂在液态溶液中提 供时，该液态溶液优选是水溶液。试剂以干燥形式提供时，其重悬通常是 通过加入合适的溶剂。所述溶剂(例如无菌水或緩沖液)可以任选在试剂盒中提供。
所述试剂盒可以包括一或多个组合物容器，其中所述组合物含有上述 试剂。在一些实施方案中，试剂盒含有相互分开的容器、分隔或隔间，分 别放置组合物和信息材料。例如，组合物可以装在瓶子、小管子或注射器 中，信息材料可以包含在塑料封套或包内。在其它实施方案中，试剂盒中 各自独立的成分包含在一个没有分隔的容器内。例如，所述组合物装在瓶 子、小管子或注射器中，而信息材料以标签的形式附着其上。在一些实施 方案中，试剂盒包括多个(例如一包)单个容器，每个容器含有一或多个上述 试剂的单位剂型(例如本文描述的剂型)。所述容器可以包括组合单位剂量，
例如包括按照所需比例存在的VLA-1拮抗剂和第二种试剂的单元。例如， 试剂盒包含多个注射器、安瓿、锡纸包装、吸塑包装或医学装置，例如每 个含有一个组合单位剂量。试剂盒中的容器可以是气密性的，防水的(例如 能防止湿度变化或者蒸发)，以及/或者不透光。
试剂盒任选包含适合用来给予所述组合物的装置，例如注射器或其它 合适的递送装置。该装置可以提供成预先装好了 一种或两种试剂的形式， 或者可以是空的，但适合加样。
实施例
实施例1-抗VLA-1抗体对局灶(focal)脑缺血的效果 实验方案
本实验使用了来自Charles River Lab的重18-20g的雌性C57B6小鼠。
将动物按照以下情况分成两个实验组。
分组 处理 剂量 途径 N 手术
A 载体(PU7) 30mg/kg IP
抗-VLA-mAB B(muHa31/8) 30mg/kg IP
MCAO+灌注 MCAO+灌注
46小鼠腹腔注射Ha31/8或Pl. 17之后，将小鼠先用2%异氟烷醚(isofurane) 麻醉，此后维持在1.0%异氟烷醚中，通过面罩提供氧气。用反馈调节型加 热垫(I-Iarvard Apparatus, Inc. Holliston， MA)使得直肠温度保持在36.8到 37.2。C之间。在大脑中部动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 之前和过程中，以及再灌注后用PeriFlux系统(Perimed Inc., Sweden)监测局 部脑血流(regional cerebral blood flow, rCBF)。
为了诱导具有大脑中部动脉(middle cerebral artery, MCA)可逆性阻塞的 局灶性脑缺血，将涂有硅/硬化剂化合物(Heraeus Kulzer, Germany)的7.0号 尼龙单丝缝合线插入右颈总动脉腔内。缝合线从插入位点经颈内动脉向前 推进9士1.0mm,直到大脑前部动脉近端，它在起点位置完全阻塞了 MCA。 激光多普勒流速仪测量到的rCBF表明两组中MCA均成功闭塞，因为rCBF 下降到基线的20%。 MCAO持续了两个小时；同时将伤口缝合，停止麻醉。 两小时MCA闭塞后，将单丝耳又出，允许小鼠再灌注24小时。确定rCBF 是否保持在先前的水平。有四只动物被排除研究在外，因为它们在MCAO 两小时后、再灌注之前，rCBF回升到先前水平的50%以上。所有的生理参 数在缺血之前、之中和之后均处于正常范围，两组之间没有区别。
对MCAO 30分钟后和再灌注24小时后在野外(in the open field)的神经 学缺陷(neurologic deficit)分别进行评估并打分。Hara等(1997)描述过这项测 试
0, 没有可见的神经学缺陷 (正常)，
1, 不能伸开右前爪 (轻度)；
2, —直向对侧转圈 (中度)； 3，不能踏步或丧失右反射 (严重)。
测量了两组动物MCA闭塞后缺血性损伤的体积。2小时MCAO后进 行24小时再灌注，然后将小鼠去头处死，迅速取出大脑，用鼠脑切片模具 (mouse brain matrix)切成6个1mm厚的冠状切片。然后将脑切片在2% 2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC， Sigma)中，室温避光染色30分钟，再置于10%中性 緩沖福尔马林中过夜。脑切片直接在图像扫描仪上扫描。在每个切片的后 部表面测量损伤(NIH Image 1.61， US National Institutes of Health)。对皮层和 紋状体中的梗死面积进行了直4妄测量，然后用以下公式进行修正以^更消除水肿的影响
%对侧皮层间4妄4更死面积=X 100。
对包括皮层和紋状体两者的 一 系列梗死面积进行数值积分(numeric integration),由此计算梗死总体积。测量是在将切片编号后进行的，使观察 者不知道之前的处理。水肿计算为缺血侧半球大小与对侧未损伤半球相比 的％增力口。
结果
对照抗体处理过的MCAO小鼠在整个大脑皮层和皮层下区域有大量缺 损。缺血侧半球明显肿胀，并观察到显著的行为缺陷(例如，轻偏瘫导致旋 转和肢体无力，见图IA)。
用对照抗体(P1.17)处理的小鼠保持了占缺血侧半球的47,1±3.8°/。的梗 死。用抗VLA-1抗体处理的小鼠的梗死明显小很多，仅占缺血侧半球的 34.3±4.2%(P<0.02,非配对Students'T检验，每组n-12)，表示梗死面积减 少24o/。(图lB)。以绝对体积来说，这等于是对照组平均梗死体积80.8 ±6.8 mi^对比于抗VLA-1处理组平均梗死体积55.63 土 6,3mm、图1C)。大脑肿 胀或水肿被计算为，梗死半球相比未损伤的对侧半球而言半球大小增加的 百分比。对照(P1.17)处理的小鼠的半球体积平均增加18.1 士％，而抗VLA-, (Ha/31/8)处理的小鼠在半球体积上增加8.2% ± 1.9% (P<0.05，非配对 Students'T检验，每周n= 12。图1D)。图2显示了使用三种浓度的抗VLA-1 (Ha31/8)抗体时的剂量反应，表明3mg/kg的抗体在减小梗死体积(图2A)和 水肿方面与30mg/kg—样有效。
这些数据证实，在可逆性大脑中部动脉阻塞小鼠模型中，抑制VLA-
所引起的神经保护和抗炎效果。该模型的病理学能够在临床上代表人的中 风和其它CNS缺血性损伤(例如TBI和SCi)状况，而现有数据^提示，VLA-1 的抑制剂可以对治疗这些以及其它缺血相关疾病有显著益处。
以上描述了本发明的多个实施方案。但是，应当明白在不脱离本发明 的精神和范围的情况下，可以作出各种改动。因此，其它那些实施方案也 在以下权利要求的范围内。
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权利要求
1.一种给受试对象治疗中风的方法，该方法包括将VLA-1拮抗剂以能够有效治疗中风的用量给予所述受试对象。
2. —种给受试对象治疗中风的方法，该方法包括将抗VLA-1抗体，或 其抗原结合片段给予所述受试对象。
3. 权利要求1的方法，其中所述中风是缺血性中风。
4. 权利要求1的方法，其中所述中风是出血性中风。
5. 权利要求2的方法，其中所述抗VLA-1抗体，或其抗原结合片段是 人的、嵌合的或者人源化的抗VLA-1抗体，或其抗原结合片段。
6. 权利要求2的方法，其中所述抗VLA-1抗体，或其抗原结合片段是 人源化AQC2抗体，或其抗原结合片段。
7. 权利要求2的方法，其中所述抗VLA-1抗体，或其抗原结合片段是 由ATCC保藏号PTA-3274的杂交瘤产生的。
8. 权利要求1的方法，其中所述受试对象是哺乳动物。
9. 权利要求8的方法，其中所述受试对象是人。
10. 权利要求1的方法，其中所述受试对象已发生了中风。
11. 权利要求10的方法，其中所述抗VLA-1抗体，或其抗原结合片段 在中风后48小时内给予。
12. 权利要求1的方法，其中所述VLA-1拮抗剂是通过静脉内或肠胃外 给药的。
13. 权利要求1的方法，其中所述VLA-1拮抗剂以每天0.1mg/kg到每 天5mg/kg的剂量给予。
14. 权利要求10的方法，其中所述VLA-1拮抗剂在中风后的7天内至 少纟合予两次。
15. 权利要求1的方法，其中所述VLA-1拮抗剂是与另一种治疗剂联合给予的。
16. 权利要求15的方法，其中所述另一种治疗剂选自抗血小板药物、溶 栓酶、集聚抑制剂、糖蛋白1Ib/IIIa抑制剂、糖胺聚糖、凝血酶抑制剂、抗 凝剂、肝素、香豆素、tPA、 GCSF、链激酶、尿激酶、安克洛酶、乙酰水杨 酸、 一逸黑素、以及caspase抑制剂。
17. —种治疗人的中风的方法，该方法包括将抗VLA-1抗体或其抗原结合片段以能够有效治疗中风的用量给予人。
18. —种已发生中风的人的治疗方法，该方法包括在中风发生后72小时 内，将人源化阻断性抗VLA-1抗体以能够有效治疗中风的用量给予人。
19. 一种治疗受试对象的创伤性脑损伤(TBI)的方法，该方法包括将 VLA-1拮抗剂以能够有效治疗TBI的用量给予所述受试对象。
20. —种治疗受试对象的创伤性脑损伤(TBI)的方法，该方法包括将抗 VLA-1抗体或其抗原结合片段给予所述受试对象。
21. 权利要求19的方法，其中所述TBI是挫伤、擦伤、撕裂伤或血肿。
22. 权利要求21的方法，其中所述抗VLA-1抗体或其抗原结合片段是 人的、嵌合的，或者人源化的抗VLA-1抗体或其抗原结合片段。
23. —种治疗受试对象的脊髓损伤(SCI)的方法，该方法包括将VLA-1 拮抗剂以能够有效治疗SCI的用量给予所述受试对象。
24. —种治疗受试对象的脊髓损伤(SCI)的方法，该方法包括将抗 VLA-1抗体或其抗原结合片段给予受试对象。
25. 权利要求23的方法，其中所述SCI选自不完全型SCI、中央型脊髓 损伤综合征、脊髓半侧损伤综合征、前脊髓综合征、脊髓圓锥综合征和马 尾综合征。
26. 权利要求24的方法，其中所述抗VLA-1抗体或其抗原结合片段是 人的、嵌合的，或者人源化的抗VLA-1抗体或其抗原结合片段。
27. —种治疗受试对象的缺血性损伤的方法，该方法包括将阻断性 VLA-1抗体或其抗原结合片段以能够有效治疗所述损伤的用量给予受试对象。
28. —种治疗受试对象的缺血-再灌注损伤的方法，该方法包括将阻断性 VLA-1抗体或其抗原结合片段以能够有效治疗所述损伤的用量给予受试对 象。
全文摘要
本发明公开了治疗中风的方法和组合物。
文档编号A01N37/18GK101494978SQ200780028380
公开日2009年7月29日 申请日期2007年5月24日 优先权日2006年5月25日
发明者汉弗莱·加德纳, 简·K·雷尔顿 申请人:比奥根艾迪克Ma公司