骨形成和骨重建的组合物与方法

专利名称：：骨形成和骨重建的组合物与方法
技术领域：
：本发明涉及治疗方法和组合物及其在骨折、骨病、骨损伤、骨异常、肿瘤、生长或病毒感染治疗以及用于调节包括但不限于葡萄糖代谢、脂质代谢、甘油三酯代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生和骨相关活性的病理生理学过程中的应用的领域。更特别地是，本发明的方法和组合物是以刺激、增强和抑制骨形成或骨重建(remodeling)为目标的。
背景技术：
：骨质疏松是一个广泛的公共卫生问题，在老年人口中特别普遍(1，15，21)。发生在65岁以上人的骨折，大部分是由于骨质疏松造成的(15，40)。峰值骨量(Peakbonemass)是确定骨质疏松性骨折风险的决定因素(Heaney等，2000),并有研究指出遗传因素对峰值骨量的变化起很大作用。最近通过定位克隆的方法已鉴定了一种41调节骨量的基因。已发现经典Wnt信号传导途径的共同受体，低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)的功能丢失突变与骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-PseudogliomaSyndrome,OPPG)有关联。这是一种表现为骨密度降低的人体的常染色体隐性疾病(9)。此外，发现在具有家族性高骨量(HighBoneMass,HBM)表型的两个独立的血缘族都具有LRP5基因上的171甘氨酸被缬氨酸置换的突变(G171V)(5,22)。最近，在G171V突变的同一结构域又发现了其它HBM突变(36)。而且，用基因打耙造成LRP5失活的小鼠表现出与OPPG患者相似的表现型(16),且LRP5G171V转基因表达的小鼠也表现为HBM(2)。再者，小鼠原代成骨细胞在没有LRP5时对Wnt应答降低(16)，而Wnt(9)或活化了的(3-连环蛋白(4)在成骨细胞样细胞中可刺激经典Wnt信号活性并诱导产生作为成骨细胞标志的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)。综上所述，这些证据表明，经典Wnt信号传导途径在调控骨发育中起重要作用。Wnt分泌性糖蛋白Wnt家族是发育重要信号传导分子的主要家族之一，并已证明其调节包括葡萄糖代谢、骨重建、脂肪生成、神经发生、干细胞生物学以及肿瘤发生在内的广泛的生物学和病理生理学过程。经典Wnt与由LDL受体相关蛋白(LRP)5/6和Frizzled(Fz)蛋白构成的其受体复合物结合启动了经典的Wnt信号通路。通过仍有待全面表征的机制，稳定了在不存在Wnt时由泛素介导的蛋白水解作用降解的P-连环蛋白，从而导致J3-连环蛋白的胞质水平升高。游离的(3-连环蛋白进入细胞核并以与TCF/LEF-1转录因子形成复合物来激活基因转录(61-66)。此外，包括Dickkopf(Dkk)家族多肽在内的多种天然的拮抗剂负调节Wnt通路(67，68)。Dkk结合到LRP5/6并推测导致受体蛋白的失活(34)。人和小鼠的遗传证据表明Wnt的共同受体(co-receptor)LRP5在骨重建调节中起重要作用；减效或无效等位基因导致骨质疏松症的早期发生(14),而不同的突变等位基因与高骨量表型相关(32，5，51)。早先已发现突变不直接降低Dkk介导的对经典Wiit信号传导的拮抗作用(69),这表明Dkk-LRP5相互作用可作为增加骨量的潜在治疗性乾标。直到最近，人们一直认为经典Wnt信号传导途径是从Wnt与巻曲Fz蛋白(frizzledFzprotein)相结合开始的。含有七个跨膜区的Fz蛋白通过涉及蓬乱蛋白(Dishevelledprotein)的至今还不清楚的机制，抑制糖原合成酶激酶3(Glycogensynthasekinase3,GSK3)依赖性的(3-连环蛋白的磷酸化。这种抑制导致了(3-连环蛋白的稳定。这样(3-连环蛋白就可与包括淋巴细胞增强因子-l(lymphoidenhancingfactor-l，LEF-1)和T细胞因子(TCF)在内的转录调节因子相互作用以激活基因转录(7,10，38)。近来，遗传学及生物化学方面的研究已提供了确凿的证据表明除了Fz蛋白外，经典Wnt信号传导还需要共同受体(27，28)。已发现LRP5/6(LRP5或LRP6)的蝇直向同源物(ortholog)，Arrow在Wnt的蝇直向同源物Wg信号中是必需的(37)。LRP5和LRP6是紧密的同源物，他们基本上以同样方式发挥功能但却呈现不同的表达模式。另夕卜，已发现在爪蟾胚胎中LRP6可与Wntl相结合并调控Wnt-诱导的发育过程(34)。此外，缺乏LRP6的小鼠表现出类似于各种Wnt蛋白缺陷所造成的发育障碍(30)。另外还发现LRP5、LRP6和Arrow可通过与轴蛋白(Axin)相结合并导致轴蛋白降解和(3-连环蛋白稳定化，从而参与经典Wnt信号的传导过程(25，35)。LRP5/6-介导的信号传导过程似乎不需要蓬乱蛋白(18，31)。最近发现LRP5/6至细胞表面的运输需要分子伴侣蛋白，Mesd(6，11)。一些文献证实了Wnt通路参与到诱导骨成长的抑制和扩展，这些文献描述了LRP5上的突变对骨骼结构的不同影响可用以引起低骨量或增加骨量(32，5,51)。甚至最近发现的一个用于骨质疏松症的遗传改造的小鼠模型，其中LRP5的两个染色体拷贝的破坏(LRP5-/-敲除)产生低骨量的表型(89)。然而，应当注意尽管上述参考是针对LRP5,但明显可知在Wnt信号传导通路上其他位点的干扰也得益于施用通过本发明的方法鉴定的化合物。关于Wnt通路和股生长之间的相互联系的最近综述参见引用的参考文献82、90和91。Dkk蛋白爪蟾(Xenopus)Dickkopf(Dkk)-1最先发现作为Wnt拮抗剂在头部的形成中起重要作用(8)。至此在哺乳动物中已鉴定出四种Dkk蛋白(17，26)。这些包括Dkkl,Dkk2，Dkk3和Dkk4。Dkkl和Dkk2通过同时与LRP5或LRP6和一个单跨膜蛋白Kremen(3，23，24，32)结合抑制经典Wnt信号传导。先前已报道LRP5HBMG171V突变似乎可以减弱由Dkk-介导的对Wnt信号传导的拮抗作用(5)。本发明阐述了这种减弱作用的机制。先前已鉴定出LRP5的第三个YWTD重复结构域，其对于Dkk介导的对Wnt信号的拮抗作用是必需的(69)。此外，已通过点突变描绘了Dkk结合空穴和空穴内的关键残基。所述空穴位于由6个p桶构成的YWTD重复结构域的桶状结构的大开口处(图17A)。重要的是，与Dkk相互作用中最重要的两个残基，残基Glu721和Trp780(69)位于所述空穴的底部，意味着结合到此空穴的小分子化合物可以通过阻挡与所述关键残基的接近来破坏Dkk-LRP5的相互作用。发明概述如本文所述，本发明提供了一个模型，此模型解释了参与骨形成或骨重建的受体及共同受体的结构域上的洞穴与Dkk、Wnt、Mesd或以类似方式发挥功能的其它蛋白之间功能上相互作用。这些受体包括，但不限于LRP5受体、LRP6受体和巻曲蛋白受体。LRP5和LRP6受体包含四个YWTD重复结构域。每个结构域含有多个YWTD重复氨基酸。LRP5和LRP6受体还有一个LDL受体重复。LRP5受体和LRP6受体是紧密同源物并且尽管它们具有不同的表达模式却基本上以相同的方式发挥功能。本发明提供了鉴定那些可以与这些空穴结合或相互作用以引起刺激、抑制或调控Wnt信号传导，以及骨形成、肿瘤发生以及Wnt信号传导调控的任何其它生物学和病理学过程的非天然的或外源性的44化合物的方法。尤其，本发明针对蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白或受体。在一个特定的实施方式中，本发明针对鉴定干扰蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白或受体结合的化合物的方法。在一个实施方式中，所述方法包括(a)鉴定与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF结合的化合物；以及(b)确定(a)中所鉴定的化合物是否调节蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、J3-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白或受体的结合。步骤(a)中的化合物可以通过如下鉴定U)使用UNITY程序筛选适合LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、(3-连环蛋白或LEF-1/TCF的空穴或结合位点的化合物；(b)使用Flexx程序将所述化合物对接入空穴；以及(c)使用Cscore程序鉴定具有最高结合亲和力的化合物。在另一个实施方式中，所述方法包括(a)鉴定调节Wnt信号传导的化合物；以及(b)确定(a)中鉴定的化合物是否与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白或受体相互作用或结合。鉴定的化合物可以是小分子，蛋白质肽，多肽，环分子，杂环有机分子，核酸，脂质，带电荷脂质，极性脂质，非极性脂质，糖，糖蛋白，糖脂，脂蛋白，化学制品，或包含杂环有机分子、核酸、脂质、带电荷脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学制品的化合物片段。使用本发明所述方法鉴定的非天然的化合物包括在细胞或生物体内天然或正常不存在的化合物，与并不是从外面来源引入的天然化合物相对。如下将进一步详述，这些化合物是通过各种筛选方法和测定法从国家癌症研究所(NationalCancerInstitute,NCI)数据库里鉴定而来的。这些化合物也可以经改良而生成在NCI数据库里或在自然中找不到的，但仍可有效地发挥功能的衍生物或相似物。已鉴定了一些破坏Dkk与LRP516相互作用、破坏Wnt与LRP516相互作用及破坏Mesd与LRPS/6相互作用的化合物。在一个特定的实施方式中，本发明针对用于调节包括但不限于葡萄糖但谢、胆固醇但谢、脂肪生产、肿瘤发生、神经发生和/或骨相关活性的病理生理学过程的方法和/或组合物，以及使用通过本发明的筛选方法鉴定的化合物来治疗骨折、骨病、骨损伤、骨异常、糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的方法或组合物。在一个特定的实施方式中，化合物可具有结构(I):R6R"一、-o其中R1、R3子，并且其中R1非氢原子的原子;结构(II):R4R3R6、R\RiiR\R°、Ro、RRii12或R"中的至少一个是氢原R"或R"中至少一个包含其中R1、R3、R4氢原子，并且其中R1，R6、R8,12R11、R12、R"或R"中的至少一个是R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子;结构(iii):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>r4、rs、r6、r或rs中的至少一个是氢原子，r4、r5、r6、r或118中至少一个包含非氢原其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、R，o中的至少一4是氢原子，并且其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、议9或r1中至少一个包含非氢原子的原子；或者其中r1、r4、rs、r6、r7、r8、r9、r10、r"、rl2、r"或中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。这些化合物以有效量在本专利所述方法中施用或存在于本专利的所述组合物中来调节所述病理生理学过程或对有此需要的受试者治疗所述骨折、骨病、骨损伤或骨异常、糖尿病或高血糖症。在一个实施方式中，所述受试者是哺乳动物受试者；在特定的实施方式中，所述受试者是人受试者。在一个特定的实施方式中，本发明针对具有如下结构的分离的化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>结构(IV):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>其中R"是线性的或分支的烷基;结构(vn)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>其中R"和R"是彼此独立的H，或者线性的或分支的烷基；或结构(VIII):其中R"是线性的或分支的烷基或者取代的或未取代的环烷基。本发明还针对获得化合物(VI)-(VIII)的方法。在一个特定的实施方式中，通过花青(gallocyanine)与烷基卣化物在促进所述化合物形成的条件下反应获得化合物(VI)。可以通过(a)花青与一个试剂反应从而用一个离去基团取代COOH基团来获得一个中间产物而获得化合物(VII);以及(b)用步骤(a)中获得的化合物与烷基胺反应来获得所述化合物。附图简述图1显示野生型LRP5及其缺失突变体的图示。图2显示G171V突变破坏了LRP5的运输。如图中所示的表达质粒转染HEK细胞。一天之后，将细胞裂解并用抗-Flag抗体进行免疫沉淀。Mesd是用Flag-标记的，而所有LRP5分子都是用HA-标记的。G171V突变破坏了LRP5与Mesd的相互作用(图2A,泳道1和3)以及R12与Mesd(图2B，泳道1和2)的相互作用，而E721突变对这些相互作用却没有影响(图2A，泳道2和3)。图2A和图2B中的下图显示投入相同量的野生型(Wt)及突变型LRP5用于免疫沉淀。[HEK细胞是用Mesd质粒和图中所示的表达质粒转染的。R12TGV、R12T、Rl-4和R1-4GV(GV)是AP融合蛋白，这些融合蛋白是缺失跨膜域的LRP5突变体，因而可以被分泌到细胞培养的上清液中。一天之后，收集条件培养基(CM),并做高速离心。然后上清用抗-HA抗体做免疫沉淀(图2C)或将上清用于AP测定(图2D)。细胞也在SDS-PAGE的样品緩沖液中裂解，而后做Western49印迹分析(图2C和图2D的下图)。数据表明G171V突变抑制了R12和Rl-4的分泌。图2E通过检测细胞表面的LRP5的结合测定法证实G171V突变干扰了LRP5到细胞表面的运输。细胞表面LRP5分子的水平是通过将细胞表面生物素化，和用抗-HA抗体沉淀LRP5分子，再用链霉亲和素蛋白-辣根过氧化酶(straptavidin-horseradishperoxides,SA-HRP)做Western印迹来测定的(图2E上图)。图2E下图显示的是LRP5在免疫复合体中的水平。图3显示LRP5的HBMG171V突变对由Dkkl-介导的对共表达的Wnt活性抑制表现较低的敏感性。图3A左图显示当HEK细胞在Wntl存在或不存在的情况下被所示质粒及LEF-1萤光素酶报道基因质粒转染时，与野生型LRP5(LRP5Wt)相比，HBMG171V突变并没有造成LEF-1依赖性的转录活性增高。图3A右图显示的是用对LRP5蛋白携带的HA标记特异的抗体或抗-LRP6抗体检测的LRP5、LRP5G171V、LRP6和LRP6d58v的表达水平。图3B显示当HEK细胞在如图所示的Wt或G171VLRP5存在的情况下被LEF-1萤光素酶报道基因质粒、Wnt-l、Dkk-l及Kremen转染时，由LEF-1报道分子所示Wnt活性在Dkk存在时在表达LRP5G171V的细胞中比在表达LRP5wt的细胞中显著增高。图3C显示，通过Western印迹证实了Dkkl、Kremen和LRP5的蛋白表达水平。图4示例说明表达LRP5G171V的细胞和表达LRP5wt的细胞相比与DKK1的结合位点少(图4A)。图4B显示转染后野生型及突变型LRP5表达量相同。图5显示LRP5的第二结构域是Wnt活性所必需的。用LEF活性报道基因质粒和表达质粒转染HEK细胞。一天之后，按照过去已描述过的方法测量LEF报道分子活性。图5中的结果显示，LRP5R494q和LRP5g479v(含有第二结构域上点突变的LRP5)与LRP5wt相比，可以消除Wnt信号传导。图6示例说明LRP5的第三结构域是Dkk-介导的拮抗作用所必需的。图6A显示第三个YWTD重复结构域是Dkk-介导的抑制作用50所必需的。用LEF活性报道基因质粒、Kremenl质粒和表达质粒转染HEK细胞。LRP5R12或LRP5R124仍能增加Wnt-刺激的LEF-1活性而LRP5R34却不能，说明LRP5R12或LRP5R124保留Wnt共同受体的功能。然而在LRP5R12或LRP5R124存在的情况下，即使有Kremen的共表达，Dkkl无法抑制Wnt信号传导。这说明第三个YWTD重复结构域是Dkk-介导的抑制作用所必需的。图6B显示了LRP5wt及其突变型分子的表达水平。图6C示例说明LRP5R34含有Dkkl的结合位点，而且R34中的E721是与Dkkl相结合所必需的。图6D是突变体的示意图。图7显示组成相互作用表面的位于第三YWTD重复结构域的氨基酸残基对Dkk-介导的对Wnt的抑制作用是必需的。图7A中，根据LDL受体YWTD重复结构域的结构演绎出第三YWTD重复结构域的空间充满型模型(13)。根据三维结构，制成了在第三YWTD重复结构域表面上的含Ala置换突变的19个LRP5突变体。测定这些突变的LRP5蛋白对Dkk-介导的抑制的抵抗能力。其中9个突变体(>5%)显示出对Dkk-介导的抑制的改变敏感性，而且它们都含有位于同一个表面上的突变。在图7B,HEK细胞转染了LEF活性报道基因质粒、Kremenl质粒和表达质粒。其下图显示了Wt及突变型LRP5分子的表达。在19种突变中，E721突变对Dkk-介导的对Wnt抑制的影响最大，其次是W781,而后是Y719。LRP5cmv对Dkk-介导的对Wnt的抑制也有影响。图8显示了来自NCI(国家癌症研究所)的三种化合物的二维结构。NCI106164(图8A)对Dkkl的结合有68%的抑制作用，而NCI39914(图8B)和NCI660224(图8C)分别增加了Dkkl结合654%和276%。图9图示了蒽-9，10-醌(anthra-9，10-quinone)的二维结构(图9A)。这是NCI39914和NCI660224共有的亚结构。图9B显示了NCI657566的二维结构。图9C显示了在二维相似性搜索中所用的模板。图10显示了化合物NCI366218(IIC8,图10A)和NCI8642(IIIC3,图10B)的二维结构。这些化合物特异性地阻断Dkkl与LRP5的相互作用，并逆转Dkkl对Wnt信号传导的抑制作用。图11说明NCI366218和NCI8642逆转DKK1抑制作用。用LRP5质粒与LEF-1表达质粒，LEF-1萤光素报道基因质粒和GFP表达质粒一起转染HEK细胞。然后用不同浓度的NCI366218和NCI8642处理细胞，而后再用对照条件培养基(CM)、Wnt3a条件培养基或Wnt3a/Dkkl条件培养基混合物处理6小时。经DMSO处理的细胞的报道分子活性计为100%。图ll显示在一定的浓度，NCI366218(图11A)和NCI8642(图11B)可以显著逆转Dkkl介导的Wnt活性抑制。图12显示NCI366218和NCI8642可以抑制Dkkl与LRP5的结合。用Mesd质粒及LRP5或LRP5R34转染HEK细胞。一天之后，细胞用不同浓度的NCI366218和NCI8642处理并与来自表达mDkkl-AP的HEK细胞的条件培养基(CM)—起在冰上孵育。用如前所述测定方法测定AP活性。DMSO处理过的细胞的AP活性计为100%。图12显示NCI366218(图12A)和NCI8642(图12B)抑制Dkkl与LRP5wt的结合及Dkk蛋白与LRP5R34的结合。图13说明NCI366218(IIC8)能够刺激成骨细胞分化。骨髓基质(BMS)细胞是从三个月大的带有2.3kbCollAl启动子控制的绿荧光蛋白(GFP)转基因(2.3Col-GFP)"的小鼠分离出来的。在这个小鼠中，GFP可被当作成骨细胞的标志。在第八和第十二天，分别用9pM和26^M的IIC8化合物对培养物进行处理。在同一时间点用DMSO处理的培养物当作对照。图13显示当用1IC8处理BMS培养物时，成骨细胞的分化标志--2.3Col-GFP表达启动。图14显示了一种骨发生测定方法。原代骨髓基质成骨细胞在NCI366218存在或不存在的情况下培养并诱导其分化。二十天后，通过二甲苯橙染色的方法观察反映骨形成过程的成骨细胞的矿化。NCI366218激发了两倍的矿化。图15说明LRP5R12和LRP5R34都含有Dkkl的结合位点，R34的E721对Dkkl的结合是必需的，而且G171VLRP5突变体能够消除Dkk与细胞表面的结合。图15A显示Dkkl可结合LRP5R12和LRP5R34,但在R12GV(在LRP5R12上的G171V突变)和R34E(LRP5R34带有E721突变)转染的细胞中，Dkkl与细胞表面的结合则明显的低。图15B显示转染后Wt和突变的LRP5表达量相同。图16说明了在骨发生细胞中Dkkl和Wnt7b的表达。诱导分化之后在不同时间点从骨髓基质细胞培养物分离总RNA。用实时RT-PCR的方法测定Dkk和Wnt的表达水平。在诱导分化之后Wnt7b表达量明显增高(图16A)。检查Wnt7b刺激LEF-1报道基因的能力，它能够刺激经典Wnt途径(图16B)。图16C是小鼠长骨切片原位杂交的图片。其显示大多数的Dkkl表达在骨细胞里。图D说明了Kremen、DkkLRP、Wnt和Fz之间的相互作用。图17显示了Dkk结合空穴和化学物的结构。图17A显示了用于我们最初的形状基础上的虚拟筛选的三个关键残基。黄色框指示了所述空穴。图17B-G显示IC13(B)、IC15(C)、IIC8(D)、IIC15(E)、IIC24(F)和IIIC3(G)的化学结构。蒽-9,10-醌核心被框出。图18显示化合物对Wnt活性和Dkk结合的影响。在图18A和B中，细胞转染Wnt活性报道基因。将不同浓度的化合物加入到Wnt3aCM、Wnt3a+DkklCM、或对照CM(基本的)。6小时之后，测定Wnt报道基因活性。(AU:任意单位)。误差小于5%。(C，D)细胞转染野生型LRP5(C)或LRP5R34(D)。测定Dkk-l-AP与细胞的结合。此处显示数据扣除了Dkk-l-AP结合到表达LacZ的细胞。图19显示了Wnt拮抗性化合物和分子模型。图19A显示了IC15对Wnt3a刺激的Wnt受体基因活性和Dkkl-AP与LRP5结合的作用。图19B-E显示了HIC3和IC15结合到LRP5的第二个和第三个YWTD重复结构域的分子模型。对应的残基在圆括号内。图20显示了IHC3对骨形成的作用。图20A和IOB显示了对颅53骨形成的作用。每天三次共5天将对照载体(a)、bFGF(b)、或IHC(c)注射到头颅真皮下。在最后一次注射两周之后，将颅骨收集、固定、脱钙、并切片。标记出新的骨层。对新骨层的厚度定量并表示在B中。图20C-E显示对骨矿物密度(BMD)的作用。小鼠(n=20)接受治疗和休息管理之后测定BMD和体重。图21显示EnzoMOl和IC15对Wnt刺激的(3-连环蛋白活性的抑制作用的影响。图22显示了通过EnzoM14andEnzoM15对Wnt刺激的|3-连环蛋白活性的抑制作用。图23显示了通过EnzoM02(图23A)和EnzoM03(图23B)逆转Dkkl对Wnt信号传导活性的抑制作用。图24显示了三种化合物对不同细胞密度的PC-3肿瘤细胞存活率的影响(A)500个细胞/孔、(B)1000个细胞/孔以及(C)2000个细胞/孔。图25A和B显示了EnzoM01对于不同肿瘤细胞林中P-连环蛋白生成的影响。图26显示了EnzoMOl(图26A)、IC15(图26B)和IIIC3(图26C)对于接受高热量饮食小鼠的葡萄糖代谢的影响。图27显示了(图27A)EnzoM01和(图27B)IC15对高热量饮食喂养的小鼠的血浆水平的甘油三酯和胆固醇的影响。图28显示了IIIC3对db/db小鼠的葡萄糖(图28A)和胰岛素(图28B)水平的影响。图29显示了在第二(红色)和第三(蓝色)结构域的结合位点的氨基酸比较。共同的氨基酸用黑色表示。本发明的详细说明本文所有术语仅仅是为了描述特定实施方式而无意欲限制，因为本发明的范围仅受限于所附的权利要求。在提供一个数值范围之处，应当理解除非上下文中另有清楚的陈54述，本发明涵盖在所述范围的上限和下限之间的至下限单位的十分之一的每个中间的值，以及在所述范围中的任何其他所述或中间的值。本发明也涵盖在一个较小范围内可独立包括的这些较小范围的上限和下限。在所述范围包括一个或两个极限处，本发明也包括排除了所包括的极限中的任何一个或两个的范围。除非另作定义，此处所用的全部的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所知的相同意义。尽管与本文所述相似或等同的方法和材料也可以用于本发明所述实践和测试中，但是当前所述的为优选的方法和材料。应当理解本文所用以及在所附的权利要求中，除非上下文中另行清楚描述，单数形式"一个"、"和，，、以及"这个"包括复数参照。的位点或空穴相结合、相互作用或刚好放入其中的化合物，所述共同受体参与骨形成或骨重建的刺激、增强、抑制或调节。这些受体包括LRP5受体、LRP6受体、巻曲蛋白受体或参与LRP5或LRP6(LRP5/6)受体系统的任何其他受体LRP5和LRP6在文献中通常表示为LRP5/6,因为在其如何参与经典Wnt系统方面有若干分享的特征LRP5和LRP6在氨基酸水平分享70%的同源性。由于这种相似性，可预期篩选到的能够结合LRP5的化合物应当也能够与LRP6相互作用。巻曲蛋白受体是具有包含CRD的结构域的共同受体，CRD是发挥增加或减少Wnt活性的功能的Wnt-结合位点。LRP5和LRP6受体包含YWTD重复结构域。一般来说，包含LRP5或LRP6受体的YWTD重复结构域的区域彼此分享足够的氨基酸同源性，使得这些结构域的每一个形成相似的结构，但又足够互不相同以至于它们在一些所形成的口袋的规格不同并且在对于蛋白/蛋白相互作用重要的一些氨基酸上存在差异。在一个特定实施方式中，的第三个YWTD结构域相互作用或结合。这种化合物可以或不能够结合其他YWTD结构域。在一个特定的实施方式中，所述化合物结合LRP5和/或LRP6受体的第一个或第二个YWTD结构域。这些化合物中的一些可破坏Dkk和LRP5相互作用。其他化合物通过抑制Wnt与LRP5/6的结合来抑制Wnt信号传导。如下所要描述，本发明也已经鉴定了调节Dkk与kremin、LEF/TCF-1与(3-连环蛋白、Wnt与巻曲蛋白之间相互作用的化合物。本发明的化合物是不存在与细胞内而来自于外部来源的非天然的或外源的化合物。所述化合物包括可与受体结合来起始事件的激动剂、与受体结合来抑制激动剂作用的拮抗剂、以及具有激动剂和拮抗剂特征的部分激动剂一一例如有时表现为引起行动而在其他时候通过降低激动剂的作用来抑制行动。这些化合物的一些也增加亲和力或者药物或化合物被吸引到受体结合位点的程度。候选化合物的鉴定化合物。筛选与LRP5的特定结构域相互作用的化合物炎^7ZJ户5^潜游誠///#力>^炎谬遂化合敎仿真筛选在一个特定的实施方式中，用UNITYTM程序(Tripos,Inc)在国家癌症研究所(NationalCancerInstitue,NCI)数据库(http:〃129.43.27.140/nddb2)里筛选能够适合LRP5受体的YWTD重复结构域的结构域II的空穴的化学化合物。数据库为免费检索并包括250,251种小化学化合物的交叉索引。检索查询设计为由具有0.3A容差的R764和E721、以及指向空穴的、距离Trp781为3.2A的、容差为i.oA的疏水中心构成。将化合物的柔韧性考虑在内，unitytm程序中的定向扭力算法(DirectedTweakalgorithm)允许快速的、构象柔韧性的三维检索。使用能够快速灵活的将配体对接到蛋白质结合位点的FlexXTM程序(Tripos，Inc.)(44),将用UNITYTM程序获得的候选化合物对接(dock)入Dkkl结合表面来达到能量最小化(17)。对于Dkkl识别56至关重要的残基E721、W864、Y719、R764、D877、F888、G782、W781和M891被考虑用作计算(图7A)。对接过程之后，根据用CscoreTM程序预测的结合到Dkkl结合口袋的能力对化合物进行排序。CscoreTM程序根据蛋白-配体复合体各自功能好坏的分数给出一个相对一致的分数8。CscoreTM程序然后还要经过最后人工肉眼检验。生物学分析潜合为、浙通过本领域已知的方法，例如通过Dkk-APP测定法(参见实施例和(69))，可针对影响Dkk-1与LRP-5结合的能力筛选所鉴定的化合物。『w;^遂也可针对Wnt活性筛选所鉴定的化合物。LRP5的第二个和第三个结构域是Wnt信号传导所必需的，并且这些结构域可能直接与Wnt分子相互作用。由于这些结构域分享广泛的氨基酸序列同源性，有可能结合到第三结构域的特定化合物也可结合到前两个结构域，潜在性地引起对Wnt活性的抑制。可对化合物进行下列检测l)基本的报告分子活性抑制；2)Wnt活性抑制；以及3)Dkk-介导的对Wnt活性的抑制的逆转。成可使用体外或体内的成骨性测定法测试所鉴定的化合物。(a)体外分析Wnt刺激培养的成骨细胞分裂和分化而Dkk抑制此过程。因此，所述化合物增加骨生成。可通过检查矿化作用或包括BSP、骨钙蛋白、以及胶原蛋白在内的骨生成标记的表达来监测骨生成。(b)体内分析进行对这些化合物有效性的体内检测以确定所述化合物是否增加体内的骨生成。将若干不同的化合物注射入头颅外表层和骨髓腔。增加的骨形成可进行组织学检查或通过使用pQCT、DNX、以及X-ray放射自显影检查。57yg-遽环蛋^水乎#浙通过Wnt信号传导稳定胞浆P一连环蛋白。可通过P一连环蛋白的所得水平来检查所述化合物对于Wnt信号传导的作用。￡及尸5/6W尸尸户s尸在乂碌^化最近发现Wnt刺激在LRP5的胞内区域在PPPSP基序上LRP5的磷酸化(49).如实施例中所述并为本领域所知，对磷酸化的PSPPP的特异性抗体可获得并用于检查Wnt活性。^L及户5//举力^#我谬逸^合參仿真篩选如上所述使用同源性建模推导出所述结构域的结构。如实施例中所述，定点突变用于定位Wnt信号传导所需的残基。使用如上所迷方法进行此Wnt信号表面的仿真筛选方法。由于第二结构域与Wnt信号传导有关，那些用第二结构域做模板筛选出来的化合物可以增加或减少Wnt信号传导。因为第二和第三结构域是同源的，用仿真筛选出的化合物可能l)增强Dkk结合；2)减弱Dkk结合；3)增强Dkk拮抗；和/或4)减弱Dkk拮抗。生物学测定用如上所述生物学测定测试化合物。使用如上方法鉴定增加或减少Wnt活性的化合物。使用如上方法确定增强或抑制Dkk结合的化合物。使用如上方法确定增强或抑制Dkk拮抗作用的化合物。^ZJ户5^潜^4'/#模我/#逸^合參仿真篩选如上所述用同源性建模可推断出此结构域的结构。如图2所示，用定点诱变定位Mesd结合及功能所必需的残基。用实施例5.1(A)中描述的方法将仿真筛选用于Mesd结合表面。由于第一结构域涉及Mesd功能，用第一结构域做模板筛选出的化合物可以增加或减少LRP5至细胞表面的呈递，继而增加或减少Wnt信号传导和/或增加或减少Dkk拮抗。因为第一和第二结构域是同源的，所以用仿真筛选出的化合物可以增加或减少Wnt信号传导。因为第一和第三结构域是同源的，所以用仿真篩选出的化合物可能l)增强Dkk结合；2)减弱Dkk结合；3)增强Dkk拮抗；和/或4)减弱Dkk拮抗。生物学测定用如上所描述的方法，鉴定出那些可以增加或减少Wnt活性的化合物。增强或抑制Dkk结合的化合物用在实施例5.1中描述的方法确定。影响Mesd功能的化合物用图2所示测定方法确定。筛选与LRP5的其他区域相互作用的化合物本文上面所述的LRP胞外部分的三个结构域不是作为仿真筛选的候选的仅有潜在位点。比如，位于LRP5胞外部分的EGF重复也可能是蛋白/蛋白相互作用的结合位点，并可与本发明所述方法一起使用。而且，已知LRP5的胞内部分具有参与蛋白质相互作用的位点，其也是潜在的靶标位点。筛选与巻曲蛋白的CRD相互作用的化合物Wnt信号通过巻曲蛋白家族的跨膜受体。此巻曲蛋白受体多次跨膜。定位于巻曲蛋白的N-端胞外区的保守的半胱氨酸富集区(CRD)作为Wnt结合位点。分泌的巻曲蛋白相关蛋白Frzb-l包含CRD并用作Wnt信号传导表达的拮抗剂。小鼠的巻曲蛋白8的CRDs和分泌的巻曲蛋白相关蛋白3的晶体结构已经确定(12)。Wnt结合位点可通过Wnt结合和突变分析来确定。仿真筛选用如上描述的仿真筛选方法篩选与CRD相互作用从而调节Wnt信号传导途径的可能化合物。以小鼠蛋白中已知CRD的结构为模板建立了同源性模型。也建立了其它巻曲蛋白家族成员及人巻曲蛋白CRD区的模型。根据涉及CRD-Wnt相互作用的结构及氨基酸，用能量极小化方法篩选化合物以便再用生物学方法进一步测试每一种化合物的生物学活性。对于那些显示较高生物活性者，进行类似结构查询以便再发现更多的候选化合物。59生物学测定用Wnt结合测定方法篩选化合物对巻曲蛋白CRD区的作用。在带有可检测标志(如Myc-tag)的细胞表面表达CRD肽(或巻曲蛋白)。用含有化合物和Wnt-碱性磷酸酶融合蛋白(如Wnt8-AP)的介质。孵育后，用免疫-组织化学染色检测其结合。一旦候选化合物显示出其对Wnt结合有作用，再用其它生物学测定方法(如上所述)确定每个化合物对Wnt信号传导的作用[27，38，12。筛选与LRP6相互作用的化合物LRP5和LRP6在文献中通常表示为LRP5/6,因为关于它们如何参与经典Wnt系统的若干共享属性。因此，针对与LRP5结合的能力选择的许多化合物应该也能够与LRP6相互作用。然而，LRP5和LRP64在氨基酸水平仅共享70。/。的同源性。因此，以与本发明所述方法中用LRP5获得化合物相似的方式，用LRP6的序列作模板来鉴定Wnt系统的效应物。LRP6的第一个、第二个和第三个YWTD重复结构域的每一个可用作选择性位点来预测化合物仿真库的相互作用。反之，可期待选取的结合LRP6的化合物可能也与LRP5相互作用。筛选与Dkk相互作用的化合物仿真篩选如本文实施例所述，Dkk的结构已解析并且用定点突变来定位Kremen和LRP5/6相互作用表面。按照如上所述的方法进行仿真筛选。发现增加或减少Dkk与LRP5或Kremen结合的化合物，或可以增加或减少Dkk-介导的对Wnt的抑制的化合物。生物学分析如上所述确定增加或减少Dkk与LRP5结合的化合物。如上所述，但转染细胞时用kremen替代LRP5，确定增加或减少Dkk与kremen结合的化合物。如实施例5.1所述，在特定的实施方式中确定增加或减少Dkk拮抗性的化合物。60筛选与蓬乱蛋白(DSL)结构域相互作用的化合物通过Wnt-frizzled受体复合物激活细胞质内的蓬乱蛋白(Dishevelled,DSL)。它们对经典或非经典的Wnt信号传导途径都是必需的。DSL蛋白由N-末端的DIX结构域，中间PDZ结构域及C-末端的DEP结构域组成。这三个保守的结构域各自与不同的蛋白相关联，因而各自在不同的传导途径中起作用。DIX结构域以同源二聚体的方式存在，它主要形成螺旋结构。这是通过脉沖场梯度核磁共振研究确定的。DIX结构域在体内介导耙向肌动蛋白应力纤维(actinstressfiber)和胞质小泡。因而它可以代表Wnt信号传导中的分岔点。通过经典Wnt信号传导对P-连环蛋白的稳定参与DSL的细胞膜靶向。小鼠Dvl2上的Lys58，Ser59和Met60关键性地参与肌动蛋白相互作用。Lys68和Glu69对胞质小泡的定位是重要的。PDZ结构域与几种分子相互作用，并在经典或非经典的Wnt信号传导途径中起重要作用。爪蟾PDZ结构域的三维结构已被确定(7)。通过应用化学移位干扰核磁共振光镨学和结合测定法，发现在巻曲蛋白保守的KTXXXW基序与小鼠Dvll的PDZ结构域之间的直接相互作用。这使得确定了所述结合区(57)。DSL蛋白的DEP结构域转导信号到Wnt通路中Dvl下游的效应物蛋白。蓬乱蛋白的DEP结构域对P-连环蛋白活性的上调及在哺乳动物细胞中刺激由Lef-1介导的转录是必需的。小鼠Dvll的DEP结构域的结构已经确定(Wong,etal)。已经显示Lys434、Asp445和Asp448在蛋白质-蛋白质之间相互作用中起重要作用，并且这些氨基酸的突变Wnt-1诱导的Lef-1活化。仿真篩选由于DIX结构域的功能性残基和二级结构已经确定，对现有蛋白结构域的篩选可以提供关于潜在候选者及三级结构构象的信息；同样的模拟可产生用于结合测定法的候选化合物。可以分析影响结合的候选化合物，并对一组新的相似化合物分析生物学活性。由于已知PDZ和DEP的三维结构，可使用与上述方法类似的仿真篩选。此结构可用作模板以建立人的蛋白质结构域或其它类似功能性蛋白结构域的同源性模型。根据参与特定功能的结构和氨基酸，可用能量最小化方法筛选化合物。然后可测试每个化合物的生物活性。对那些显示高生物活性的化合物，用相似结构查询来发现更多候选化合物，并进一步分析生物活性。生物学分析针对肌动蛋白结合区的肌动蛋白结合抑制分析，和Xnr3或Siamois的表达水平可用于DIX结构域小泡定位。经化合物处理后，用含有带标记的DIX的构建载体转染细胞。然后用免疫焚光染色测定对肌动蛋白结合的抑制。可用RT-PCR测定Xnr3或Saimois的水平用于小泡定位。可用体外结合测定法进行PDZ结构域的初篩。可用与Dvl的PDZ结构域结合的肽(例如Drp的C末端区域)。将结合于玻珠的纯化的带有标记的肽与PDZ结构域以及每个化合物混合，孵育之后，用抗体检测结合的化合物。测定每个化合物的结合效率。为筛选影响经典Wnt途径的化合物，萤光素酶测定法可用于所述结构域。用Dvl结构域转染细胞。一旦这些细胞与化合物孵育，分析Wnt/p-连环蛋白激活的萤光素酶活性，从而测量每个化合物的作用。将化合物按其结构分类，并进一步筛选所鉴定的化合物。一旦鉴定了候选化合物影响蛋白质结合，如上所述的其他生物学分析用来确定每个化合物对Wnt信号传导的效应(57、6、58、55和7)。篩选与P-连环蛋白相互作用的化合物P-连环蛋白介导Wnt信息向细胞核内传导从而激活靶基因。Wnt信号防止(3-连环蛋白降解，允许P-连环蛋白积累并随后移位到细胞核内与Tcf/LEF蛋白家族的成员形成转录活化复合体。P-连环蛋白的晶体结构及它与轴蛋白(Axin)、Lef、TCF和其它几种蛋白形成的复合物的晶体结构已经解析。此信息可用来筛选调62节经典Wnt信号传导的化合物。(3-连环蛋白含有N-末端的armadillo重复，这是APC、LEF/TCF、E-钾祐着蛋白(E-cadherin)和传导素(conductin)/轴蛋白的结合位点。所有的结合位点都位于P-连环蛋白的armadillo重复单位3-8上。所述因子的结合占据所述沟槽因而阻止其它竟争性P-连环蛋白伙伴的同时结合。仿真筛选类似与上述仿真筛选的改良的策略可用于鉴定与P-连环蛋白相互作用用以结合的化合物。用P-连环蛋白做模板，可以生产不同种属的p-连环蛋白的同源性模型。根据结构和涉及与LEF/TCF、轴蛋白和APC相互作用的关键性氨基酸，用能量最小化方法篩选化合物来建立成组的候选化合物。因为所有上述蛋白质占据P-连环蛋白上的相似位置，当用生物学分析筛选每一个化合物时，要测试所有四种相互作用。根据最初的生物活性，分析有效化合物的结构，并用类似的方法检测新一组的化合物。通过进行另外的生物学测定，可以鉴定最有效的化合物。生物学测定因为所有(3-连环蛋白伙伴都占据相似位置，体外翻译和蛋白结合测定法用来确定每一种化合物的有效性。带有标记的p-连环蛋白、TCF、APC、LEF或轴蛋白构建体可以在体外被转录和翻译。一旦它们与化合物孵育，可用免疫印迹检测结合。一旦确定了影响Wnt结合的化合物，如5.1(B)部分所述的其他生物学分析可用来确定每一种化合物对Wnt信号传导的作用(52、43、16、59、11)。筛选与LEF-1/TCF转录因子相互作用的化合物淋巴增强子结合因子(Lymphoidenhancer-bindingfactor,LEF)是一种DNA结合蛋白，它在调节性核蛋白复合体的组装和功能上起构架作用。它通过高迁移率群(high-mobility-group,HMG)结构域63识别特定的核苷酸序列。与含有TCR-alpha基因增强子的最佳结合位点的、15对碱基寡核苷酸双链体形成复合体的小鼠LEF-1的HMG结构域在溶液中的结构已经解析。仿真筛选类似于上述仿真筛选的策略可用于筛选与HMG-寡核苷酸结合相互作用从而影响基因表达调控的活性的潜在化合物。根据结构，含有HMG结构域的蛋白使DNA弯曲到其结合处。影响DNA弯曲或结合能力的任何化合物可影响基因表达调控。用已知结构做模板可建立不同种属的LEFHMG结构域的同源性模型。根据结构和参与HMG-寡核苷酸相互作用的氨基酸，用能量最小化方法筛选化合物。选取可以强制弯曲或可阻止弯曲的化合物。可用DNA结合活性篩选化合物。对于显示出高得多或低得多生物活性的化合物，相似结构查询可用于鉴定额外的候选化合物。生物学分析可用DNA结合测定法筛选化合物。寡核苷酸和HMG结构域与化合物一起孵育。凝胶阻滞测定法用于确定DNA结合。用"C均匀标记的NMR改良所述结合实验以分析结构域弯曲。由于LEF控制的基因调控受到直接影响，可用萤光素酶测定法确定化合物的作用。一旦鉴定出影响蛋白质结合的化合物，其他生物学测定可用来确定每一个化合物对Wnt信号传导的作用(33)。在进行库的仿真筛选中，应当理解库本身可以是物理形式的库(如对NCI库的筛选)或它可以是仿真的库(如在实施例6中用化合物Enzl-Enz72)。所述库可由与目的蛋白靶标相互作用的并影响所述蛋白与其他蛋白相互作用的任何化合物构成。这种化合物的实例可包括但不限于有机分子、肽和核酸。所述肽可包括但不限于随机属性的肽库、置换系列(permutationalseries)的氨基酸、针对目的蛋白的抗体的片段和与目的蛋白相互作用的蛋白的片段。核酸包括但不限于核酸适体和蛋白质结合序列的库。使用结构比较来寻找更有效的化合物化合物有效性的知识也允许了有目的的设计在附加到初始化合物的核心结构的基团上具有变化的新型类似物或化合物家族。在一个特定实施方式中获得的新的化合物调节蛋白与LRP5或LRP6的结合。如此处所定义"调节"意为增强或防止蛋白与LRP5或LRP6,优选地与LRP5或LRP6的一个YWTD重复结构域的结合和/或结合的稳定性。所述蛋白可包括但不限于Dkk家族成员、Wnt家族成员、sclerostin或PA受体(例如TWM8或CMG2)。比如，NCI8642(也称作IHC3),具有如下结构保留核心结构，并指示出不同的取代发生的位置，此化合物的类似物家族的概括公式如下(I):其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R"或R"中至少一个是氢原子，并且其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。在一个特定的实施方式中，R1、R3、R4、R6、R8、R"、R"或R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(C广Q6)烷基、取代的线性的或分支的(Q-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、3曰磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、磷酰胺(phosphamide)、膦酰胺(phosphoramide)、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、R"和R12、RU和R3、RS和R4、R"和116可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。当胺基组成的R"和R"上的氮带电并进一步组成R15，其中R"如之前对于R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12和R"所述。在一个特定的实施方式中，化合物具有如下结构(VIII):其中R"是线性的或分支的烷基或者取代或未取代的环烷基。在一个最特定的实施方式中，R"是线性的或分支的(:2_4基团。在另一个特定实施方式中，R"是环烷基C3-8基团。可通过保留环状结构并允许取代如上结构所示的羧基或酯基概括这个核心化合物，得到的一系列其他类似物如下公式(II):R8,0、其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R13或R"中至少一个是氢原子，并且其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。在一个特定的实施方式中，R1、R3、R4、R6、R8、R"、R12、R13和R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(C!-C")烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺(phosphamide)、膦酰胺(phosphoramide)、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、疏代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、RH和R12、RU和R3、RS和R4、R"和W可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。在一个特定的实施方式中化合物具有如下结构(VII):其中R"和R"各自是独立的H或者线性的或分支的垸基。在一个更特定的实施方式中，R"和R"是独立的H或者线性的或分支的烷基C"5的线性或分支的烷基。在一个最特定的实施方式中，R"是H且R"是CH3基团(EiizM14);R"和R"是CH3基团(EnzM15);R"是CH3基团且其中R"是C(CH3)3(EnzM25);R13是H且其中R"是(CH2)2CH(CH3)2(EnzM35);R13是H其中R11和R"是CH3基团且其中R14是CH2CH(CH3)(CH2CH3)(EnzM39)。(VII)所包含的化合物可通过如下获得(a)用花青与试剂反应来将花青上COOH基团替换成离去基团；(b)用步骤(a)中获得的化合物与烷基胺反应来获得所述化合物(VII)。本发明进一步针对具有如下结构(VI)新型化合物67其中R"是线性的或分支的烷基。在一个特定的实施方式中，R15是线性的或分支的d-s烷基。在一个最特定的实施方式，R"是甲基(EnzMOl);R"是乙基(EnzM02);R15是丙基(EnzM03);R15是CH2C(CH3)3(EnzM12)。可以在促进形成所述化合物的条件下通过用花青与烷基闺化物反应荻得该化合物。以类似的形式，可用IC15和IC5作为起点来设计一系列可能的目的化合物IC1568如前所述，这两个化合物中的共同的蒽-9，10-醌结构用在UNITYTM的二级篩选，其后用FlexXTM对接以及生物学分析中。这导致鉴定了HC8、IICIO、IIC18和IIC19(都共享蒽-9,lO-醌)表现出对Wnt活性的影响。由此，在此情况下，一族类似物可具有如下的概括结构(III):其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中至少一个是氢原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、117或R8中至少一个包含非氩原子的原子。在一个特定的实施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、RS独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-Cw)烷基、取代的线性的或分支的(d-Cw)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺(phosphamide)、膦酰胺(phosphoramide)、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、疏代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、W和R3、R3和R4、RS和R6、！^和R7、R和RS可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。本发明进一步提供了依据上述二级篩选的一族化合物，其中IIC15(结构如下所示)显示了对Wnt调节的有趣的作用。H2N，NH2IIC15其他共享该化合物的结构元件并且表现出对Wnt活性的作用的化合物是IICl、IIC2、HC7和IIIC10，其结构在表IV中显示。由此，本发明提供具有如下结构(IV)的化合物R4其中R1、R2、R3、R4、Rs、R6、R7、R8、R9、R"中至少一个是氬原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中至少一个包含非氢原子的原子。在一个特定的实施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、RS或R"U虫立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-d6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烂基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、W和R3、R"和R5、RS和R4、W和R7、R和R8、R8和R9、RS和R"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。o=s=o、n应当注意这些核心结构的芳香环上的R基团可融合在一起从而形成更复杂的环状结构。由此，例如，R2和R3的碳链可结合在一起从而提供具有如下结构(V)的一系列化合物其中R1、R4、Rs、R6、R7、R8、R9、R"中至少一个是氢原子，并且其中R1、R4、Rs、R6、W或R8、R9、R10、R11、R12、R9、R13中至少一个包含非氢原子的原子。在一个特定的实施方式中，R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-dJ烷基、取代的线性的或分支的(c广c，6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R"、R11和R12、R'2和R13、R"和R14、R"和R4、R"和R5、R6和R7、lT和R8、RS和R9、！^和R"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。共享此结构的所测试化合物是如上所述iici和nc2。本文如上公开的核心化合物可组合从而形成为汞齐的化合物，其汞齐跨越上述不同核心化合物的不同相互作用点。例如，显示可以影响Wnt活性的IC13具有连接在一起的两个III部分并且与它们之间的连接组合，也包括从IV部分衍生而来的类似物。此杂交分子的结构如下所示71Wnt信号通路的其他蛋白表面耙标众多涉及Wnt信号传导通路的蛋白参与通过施用药物化合物可以被影响的蛋白/蛋白相互作用。许多文献描述了参与LRP5/6和/或经典和非经典的Wnt通路中的蛋白/蛋白相互作用的不同蛋白的实例(82、68、83、81、84、85、86和87)。对于这一群体中的已知靼蛋白，有与所述靶蛋白相互作用的各种各样的不同蛋白。这些结合伙伴可以结合到靶蛋白的不同位点或者两个不同的结合伙伴可共享所述耙蛋白上的相同的位点或重叠位点。本发明的方法可用于每个相互作用配对的任一个参与者，并且通过本领域技术人员已知的任何方法可鉴定适当的结构和结构域。这些方法包括但不限于，包含靶蛋白的不同部分(例如胞外和胞内结构域)的克隆的构建，并且测试与相互作用蛋白伙伴的不同缺失突变体的结合；靶蛋白的随机突变和测定对Wnt活性或一些其他生物学标记的影响，随后对感兴趣突变体测序；丙氨酸扫描来鉴定参与选取的相互作用配对的蛋白/蛋白相互作用的功能的关键氨基酸，靶蛋白的各种缺失突变体的构建和测定其影响Wnt活性或一些其他生物学标记的能力；靶蛋白的缺失突变体的AP融合形式的构建；使用类似蛋白来制备蛋白结构的模型；使用肽库来确定结合特定靶标的肽的序列；X-射线结晶学和NMR分析。如上所述，许多这些结构和位点为本领域已知并且在靶蛋白上的特定位点可选作仿真篩选和通过各种方法的测定法。对于其他蛋白/蛋白相互作用，相互作用的存在是已知的但特定位点需要通过上述任何方法来进一步研究。对于相互作用蛋白的蛋白靶标及其结合位点的实例在下面列出并且所述实例包括但并不限于结构靶标结合位点WntLRP5/6Dkk蓬乱蛋白巻曲蛋白Beta-cateninLEF/TCFLRP5/6,Dkk，巻曲蛋白，sFRPs，Wif-l，CerebrusWnt，轴蛋白，Boca，mesd，Fratl，Wise,SOST，TEM8/ATR，CMG2Wnt，Kremen巻曲蛋白，轴蛋白，nakedWnt，蓬舌L蛋白，NoirinAPC，LEF/TCF，(E-钩粘蛋白)E-cadherin，轴蛋白P-连环蛋白在蛋白/蛋白相互作用中，参与相互作用的每一个成份上有一个位点，并且因此任一表面可用作仿真筛选的潜在靶标。通过这一途径至少可以达到两个益处。第一，影响Dkk/LRP反应的化合物的可能药典现在通过包括由对Dkk亲和力鉴定的化合物的整个新家族得以扩大。第二，参与信号产生的蛋白的结合结构域倾向于多价。例如，在目的和作用上各异的若千不同蛋白可利用LRP5/6的结合结构域。至于当前实例，Dkk可结合LRP5/6的第二和第三结构域(79)，但最近已显示sclerostin可结合到第一和第二LRP5/6结构域(80)并且这些结构域之一作为炭疽的病毒性作用的结合位点(81)。因此，即使当特定药物靶向LRP5/6受体上的单个位点，除Dkk之外有若干不同的信号产生蛋白可被结合到所述位点的药物影响。这些影响可以是有益的或可是中性的或甚至是有害的，因此影响到作为治疗应用的化合物的使用。同样地，当Dkk上的相应LRP5/6结合位点选作靶标时，有各种其他蛋白/蛋白性互作用也可以使用此部位。就此而言，当鉴定结合到此位点的药物，被就结合Dkk上的LRP/Dkk结合位点所选取的药物所影响的特定蛋白代表与被就结合LRP5/6上的LRP/Dkk结合位点所选取的药物影响的蛋白不同的一组蛋白。除了靶向Wnt/Dkk反应的其他位点，参与Wnt信号传导的其他蛋白/蛋白相互作用也已经被描述为用于上述过程的潜在候选。以类似的形式，它们达到了如上所述的一些益处。例如，类似于选择Dkk代替LRP5/6作为靶标，使用不同的蛋白靼标可以允许发现影响Wnt信号传导通路的完全不同集合的化合物。在这种情况下，有可能达到相同的作用(影响Wnt信号传导)但影响通路的不同部分。应当理解可以进行双重发现的程序，其中蛋白/蛋白相互作用的每一个伙伴作为药物开发的候选。第二，如早前所述，影响特定蛋白/蛋白相互作用的化合物也可能影响其他的不必是最初耙标的其他蛋白/蛋白相互作用。因此可证明Wnt信号传导通路的一些成员在达到所需作用上可能比其他成员更特别。除了早先所具体说明的特定蛋白/蛋白相互作用，应当理解参与wnt信号传导的蛋白/蛋白相互作用的全部蛋白可能用作进行本发明的方法的候选物。这些蛋白靶标可参与经典和非经典的信号传导通路或者局限于一个通路或另一个。如上所述，本发明的组合物和方法所用的化合物可用于调节病理生理学过程。如本文所定义的"调节"包括但不限于改变特定过程的量或速率、调整一个过程、或调整或维持适当度量或比例。本发明可应用于受经典或非经典的Wnt信号传导通路影响或依赖于经典或非经典的Wnt信号传导通路的许多系统。这些可以是由Wnt信号传导通路的改变或缺陷所引起的疾病或状况，其中调节Wnt活性可以减轻这些疾病或状况。备选地，这些可以是由非Wnt活性本身的问题引起的疾病或状况，但可以通过操作Wnt活性来达到治愈或治疗的效果。如之前在美国专利申请号20050196349、美国专利申请号20050261181、美国专利申请号20060030523中所述，上述全部通过引用并入本文，其中对Wnt信号传导系统的操作可提供有益作用的应用实例包括但不限于影响影响骨形成和重建以及治疗肿瘤和不正常生长。如上所述，本发明所鉴定的化合物也可应用于在肿瘤和不正常生长中的治愈性或预防性方法。尽管从前面的段落中应当理解胂瘤或者骨细胞或骨组织的不正常生长可以是这些化合物的靶标，Wnt活性更为广泛并且也是在其他细胞和组织中的不正常生长的一个因子。应当指出，当第一个Wnt基因被分离时，认为它是一个准原癌基因(92)并命名为"int-r，这是由于当小鼠乳腺病毒整合到这一位点时它倾向于引起肿瘤。仅几年之后，当此家族基因在胚胎发育中的功能明了之后，将其重新命名为"Wnt"(39)。因为参与Wnt通路的基因表达在广泛多种组织中，等同的关联存在于与Wnt通路表达改变相关的多种不同的肿瘤类型中。另外，对于特定类型癌症有不同的作用。例如，证据显示在造血细胞中Wnt5A可以是肿瘤抑制基因(93)，而另一方面，Wnt5A在黑色素瘤中可促进移动性和侵染力因此有可能在肿瘤转移中起作用(94)。对于Wnt通路与肿瘤发生或肿瘤维持以及众多类型的癌症的相互作用的综述，其中可见到这些作用(参见所引用的文献95、96、97、66、98和99)。也应当理解Wnt对癌症和骨生长的控制的作用的联系不是限于骨癌的现象。多发性骨髓瘤本质上为一种血液癌症，也具有对骨生长的间接影响，其中增加的脆性是此疾病的特征之一。后者这种作用已经追踪到在骨髄瘤细胞中的Wnt抑制子Dkk(100)和sFRP-2(101)的水平增高。与Wnt通路信号传导系统改变相关的疾病状况不仅限于肿瘤或不正常的骨生长。参与Wnt信号传导系统的组件表达的基因的遗传缺陷表现出在多种器官和系统的缺陷。甚至对于同一基因，特定位点或甚至特定的突变可以影响所述缺陷的特定表型表达。如早先所述，LRP5的特定突变导致增加的骨生长，并且其他突变导致减少的骨生长。一些遗传疾病可能与受Wnt信号传导系统组分的缺陷影响的发育过程相关。例如，LRP5或FZD4的突变可导致以缺乏视网膜血管生成为特征的家族性渗出性玻璃体视网膜病变(102)。在更极端的实例中，由Wnt3的缺陷引起的一种称为四-无肢畸形的状况下完全不能产生四肢(103)。其他的基因突变可影响Wnt信号传导在实质上为后胚胎的体内平衡过程中的功能。例如，导致骨量增加或降低以及肿瘤形成事件的缺陷是持续的出生后的过程。然而，如上所述，Wnt信号传导不仅影响体内平衡的过程。之前从两个拷贝的LRP5缺失的小鼠的结果已经表明了影响糖尿病的Wnt通路基因中突变的可能性。尽管早先在骨质疏松症的潜在模型的上下文中已经引证了这些小鼠，进一步的研究显示此品系表现出其他表型特征还包括提高的血浆胆固醇水平和显著受损的葡萄糖耐受反应(20)。后一结果并不令人惊讶，因为LRP5基因最初定位和克隆是由于其邻近与糖尿病相关的IDDM4区域(18)。另外，最近的研究(104)显示具有在TCF7L2基因(先前称为TCF4)上等位基因的个体中发生II型糖尿病的可能性提高到杂合条件和纯合条件下危险因子分别为1.45和2.41。已经发现的与Wnt信号传导系统多种成员相关的其他疾病或状况包括多嚢性肾病(105)、肾脏纤维症(106)、肺纤维症(107)、侵袭性纤维瘤(aggressivefibramotosis)(108)和精神分裂症(109)。(关于Wnt信号传导通路与疾病之间关系的综述参见引用文献63和66)。如此，通过Wnt信号传导改变引起的或特定疾病或状况的存在导致的表现在Wnt信号传导上不同的任何疾病过程可使用通过应用本发明鉴定的化合物。用于本发明所述方法的化合物调节，尤其是削弱Mesd-LRP5相互作用，导致细胞表面呈现较少的LRP5受体，这导致在骨形成或骨重建过程中骨密度的增加。当Dkk结合到LRP5受体的第三结构域或与其相互作用时，Dkk作为Wnt的拮抗剂发挥作用。已鉴定出化合物抑制Dkk-LRP5相互作用来促进骨形成或重建。如下面实施例所述，已发现一个化合物NCI366218(IIC8)可以在组织培养模型中促进成骨细胞分化。已经显示Wnt和Dkk调节间质千细胞生长和分化。已鉴定出其功能为间质干细胞调节因子的化合物，其用于调节骨形成和造血干细胞的发育和分化。已经显示Wnt调节造血干细胞的生长和分化。已经鉴定出其功能为造血千细胞调节因子的化合物，其用于调节骨形成和体内内外干细胞的增殖和扩展。组合物用于本发明的方法的一种或多种化合物可配置成组合物，最特别是药学组合物。这种组合物通常包含约0.1-90%重量的本发明的代谢中间产物，所述中间产物配置入药物学可接受的栽体或赋形剂和/或与之配置在一起。药学配置是很好建立的技术，并在Gennaro(ed.)，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thed.，Lippincott,Williams&Wilkins(2000);Anseletal"PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,7thed.，LippincottWilliams&Wilkins(1999);andKibbe(ed.)，HandbookofPharmaceuticalExcipientsAmericanPharmaceuticalAssociation,3rded.(2000)进一步描述。简言之，本发明药学组合物的配置依赖于施用所选择的途径。用于本发明的药学组合物可通过包括肠道或肠胃外的各种途径使用，包括经口的、静脉内的、i;l肉内的、皮下的、吸入、鞘内的、心室内的、经粘膜的、透皮的、鼻内的、腹腔内的和肺内的。药学组合物可包括本发明的一种或多种试剂。经口剂型可配置成片剂、丸剂、糖衣丸、胶嚢、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮剂等等，用来被患者摄入。用于经口施用的所述组合物的固态制剂可含有适当的载体或赋形剂，如碳水化合物或蛋白质填料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；玉米、小麦、水稻、土豆或其他植物来源的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素，羟甲基纤维素钠或微晶纤维素；树胶包括阿拉伯树胶和黄芪胶；蛋白质如明胶和胶原；无机物如高岭土、碳酸钙、磷酸二钙、氯化钠；和其他试剂如金合欢酸和褐藻酸。可加入促进崩解和/或溶解的试剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐，如褐藻酸钠、微晶纤维素、玉米淀粉、羟基乙酸淀粉钠和褐藻酸。可使用的片剂粘合剂包77括阿拉伯胶(acacia)、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PovidonTM)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。可使用的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、硅酮液体、滑石、石蜡、油和胶体二氧化硅。可以单独或组合使用上述的填充剂、促进崩解和/或溶解的试剂、片剂粘合剂和润滑剂。固体经口剂型不需要完全均一。例如，糖衣核心可以与合适的包膜缀合，包膜例如浓缩的糖溶液，其也可含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波镨胶、聚乙二醇和/和二氧化钛，漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。本发明的经口剂型包括用明胶制成的推入适合(push一fit)胶嚢，以及用明胶和包膜(例如甘油和山梨醇)制成的软、密封胶嚢。推入适合胶嚢可含有与填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶嚢中，活性成分可溶解或悬浮在合适的液体中，例如具有或不具有稳定剂的脂肪油、液体或液体聚乙二醇。另外，可向片剂或糖衣包膜中添加染料或颜料，用于产品识别或表征活性化合物的量，即剂量。用于经口(肠内)施用的药学组合物的液体制剂制备在水或其他液体载体中，并且可含有多种悬浮试剂，例如甲基纤维素、藻酸盐、黄芪胶、果胶、藻胶钠、角叉菜胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。液体制剂也可包括溶液、乳液、糖浆和酏剂，其含有与活性化合物一起的湿润剂、甜味剂和着色剂和增味剂。本发明的药学组合物还可配置成用于肠胃外施用。用于肠胃外施用的制剂可以是水性和非水性等渗无菌注射溶液或悬浮液的形式。对于静脉内注射，本发明的化合物的水溶性形式可配置成，或提供为与生理学可接受液体媒介混合的亲液物(lyophilate)，所述载体例如5%葡聚糖("D5")、生理学緩沖盐溶液、0.9%盐溶液、Hanks'溶液或Ringer，s溶液。静脉内制剂可包括载体、赋形剂或稳定剂，其中包括但不局限于钙、人血浆白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、氯化钙、碳酸盐和其他盐。肌肉内制备物，例如本发明的化合物的合适可溶性盐形式的无菌制剂可溶解在如注射用水(Water-for-Injection)、0.9%盐溶液和5%葡萄糖溶液的药学赋形剂中，并在其中施用。备选地，所述化合物的合适可溶性形式可制备成水基和药学可接受油基中的悬浮液，并在其中施用，所述药学可接受油基例如长链脂肪酸的酯(例如油酸乙酯)、脂肪油如麻油、甘油三酯或脂质体。所述组合物的肠胃外制剂可含有多种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇、多元醇类(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)。水性注射悬浮液也可含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。非脂质多聚阳离子氨基聚合物也可用递送。任选地，所述悬浮液也可含有合适的稳定剂或试剂，其增加所述化合物的溶解性从而允许制备高浓缩的溶液。本发明的药学组合物也可配置成允许可注射、长时间、储备物。可通过形成生物可降解聚合物(例如聚乙醇酸交酯)中的所述化合物的微胶嚢化基质而产生可注射储备形式。根据药物与聚合物的比例和所使用某种聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储备可注射制剂也可通过将药物俘获在与机体组织相容的微乳剂中来制备。也可以容易地配置吸入制剂。对于吸入，可制备多种粉末和液体制剂。对于气溶胶制备物，所述化合物的无菌制剂和所述化合物的盐形式可用于吸入器，例如定量吸入器，和喷雾器。气溶胶形式特异可用于治疗呼吸疾病。在本发明的药学组合物中的药学活性化合物可以以多种酸的盐提供，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸。在水溶液或其他质子性溶剂中，盐比相应游离碱形式倾向于更可溶。制备药学组合物之后，将其包装入合适的容器并标记为用于所示状况的治疗。所述活性化合物以达到预期目的的有效量存在。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力范围内。本发明所用化合物的治疗有效剂量最初可通过体外测试来最初估计，如细胞培养测定法，随后通过模型动物测定，通常是小鼠、大鼠、兔、狗或猪。动物模型也可用于确定最初优选的浓度范围和施用途径。例如，ED5()(在50%的群体中治疗有效的剂量)和LD5()(对50%群体致死的剂量)可在一个或多个动物模型系统的细胞培养中确定。毒性作用相对于治疗作用的剂量比率为治疗指数，可表示为LD5(>/ED5()。表现出大治疗指数的药学组合物是优选的。从细胞培养测定法和动物实验中得到的数据用于配置用于人的最初的剂量范围，并优选地提供一个包括具有很小或无毒性的ED5。的血循环浓度范围。施用之后，或在连续施用之间，根据本领域熟知的药物动力学因素，如所用剂型、患者的敏感性、以及施用途径，活性试剂的血循环浓度在这个范围内变动。从业者按照受试者所需治疗的特定的因素来确实准确的剂量。从业者考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、年龄、体重、受试者性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性、和对治疗的耐受和响应。根据特定制剂的半衰期和清除率，长效药学组合物每3-4天、每周或每两周施用。根据施用途径，正常的剂量可在O.l-lOO，OOO微克之间变动，多至总剂量约l克。在特定的实施方式中，每日剂量为约0.01mg-30mg/kg患者体重(如lmg/kg-5mg/kg)。如果需要，药学制剂可每日多个剂量施用达到总共所需的每日剂量。医药领域普通技术人员已知的常规方法，可用于向患者施用本发明的药学制剂。本发明的药学组合物可单独施用、或与其他治疗试剂或干预措施组合施用。特别是，本发明的组合物可进一步包括本发明的大量试剂。在任何所述方法中的对疾病的治疗导致调节性T细胞、免疫调节T细胞或NKT细胞的数量或功能的改变。所述改变包括细胞数量或功能上的减少、抑制、或降低。CDld分子的活化元件的竟80争性置换造成所述抑制。改变也可包括刺激或提高细胞的数量或功能。这种刺激可由CDld分子的活化元件的结合增加所造成。协同作用和间接作用在生物学测定法中测试时，通过就结合LRP5/6仿真筛选所选择的化合物在以下方面显示多种作用a)Lef活性；b)通过Wnt增强lef活性；以及c)通过Dkk抑制Wnt的增强(参见表l)。于是，本发明组合物可包括在受试者中调节病理生理学过程的两种或更多种化合物。众所周知小分子与蛋白质的结合可改变蛋白质的构象。例如，已经有许多晶体学研究对带有和不带有底物的蛋白质的构型进行研究来推导酶在结合位点和催化机制上的细节。如此，很容易理解化合物的结合可改变蛋白的构象以致于可增加其活性或减少其活性，也可以理解甚至构象上的变化可能对活性本身没有影响。然而，可以看出结合有小分子的蛋白不同于不具有小分子的所述蛋白。于是可结合到特定耙标蛋白但对天然蛋白没有影响的小分子可能当迫使形成不同的构象时影响乾标蛋白。结合到同一蛋白靶标上的两个不同化合物的缀合可由之前已显示改变的系统行为的一个分子和在单独使用时显示无影响的第二个分子组成或可能由两个蛋白质组成，其中任一个单独无活性。用于测试单个化合物的相同测定法可用于存在两个化合物的如前所述的测定法中，例如Lef活性的改变、Lef活性对Wnt存在(Wnt活性)的响应，通过dkk抑制Wnt的响应以及LRP5和Dkk-AP亲和力的最终改变。可以进行一系列的反应，其中如花青或enzoMOl的化合物用在就结合LRP5/6选择的其他化合物存在时。另一方面，可使用更广的检索，其中进行化合物的多种组合的阵列。本发明的另一个方面是利用施用两个或多个药学试剂的混合物的补充或协同作用。另一种可能是较低剂量的两个或多个药物组合可提供与所述药物之一在正常剂量下相同的治疗效果。所述方法的这种优点可减少药物的费用或通过使用较低剂量降低不希望的副作用。实施例材料与方法细胞培养、转染、条件培养基(CM)的制备和萤光素酶测定按照过去已描述的方法维持和转染人胚胎肾细胞(HEK)系A293T和小鼠成纤维细胞系NIH3T3(1)。成骨细胞前体细胞系2T3和MC3T3是在含有10%FCS的oc-MEM培养基中培养的。为测定萤光素酶，细胞以5乂104个细胞/孔的密度接种到24-孔培养板中，并用LipofectaminePlus(Invitrogen，CA)按厂商建议的方法用0.5jxgDNA/孔的浓度将细胞转染。通常加LacZ质粒以使每次转染的DNA浓度保持一致。转染24小时后，收集细胞提取物。按照过去己描述的方法进行萤光素酶测定(l，2)。发光强度对比GFP荧光强度而正态化。为制备含有Dkkl-AP的条件培养基，将HEK细胞以4xl()5个细胞/孔的密度种在6-孔的培养板上，并用lpgDNA/孔的浓度将其转染。转染后48小时，收集条件培养基。表达质粒的构建和诱变野生型和突变型的人的LRP5、LRP6、小鼠的Wntl、Dkkl和E)kk2是用具有高保真度和热稳定性的DNA聚合酶p/wt/脸fl(Stratagene，CA)通过PCR取得的。将HA或Flag表位标签引入全长和突变分子的C端。这些分子的表达是由CMV启动子驱动的。LEF-1报道基因构建体从其他来源获得(3)。Dkkl-AP结合测定法和免疫沉淀法在24-孔板中将HEK细胞用LRP5及其突变体转染。一天后，用冷的洗涤緩冲液(含有BSA和NaN3的HBBS)洗涤并在水上与小鼠Dkkl-AP的条件培养基孵育两小时。然后将细胞用洗涤緩冲溶液洗涤3次并将其裂解。在65X:将裂解物加热IO分钟，而后用Tropix出产的发光碱性磷酸酶检测试剂盒(luminescenceAPassaykit)检测AP的活性。免疫沉淀测定法是按照过去已描述的方法进行的(4)。细胞表面蛋白的生物素化用LacZ、LRP5和LRP5cmv的表达质粒转染HEK细胞。在用冰预冷的PBS中将细胞用0.5mg/mlsulfo-NHS-生物素(Sulfo-NHS-biotin,Pierce)按过去已描述的方法标记、洗涤和裂解(5)。用抗-HA抗体和A/G-琼脂糖蛋白将裂解物免疫沉淀。原代成骨细胞培养物按照过去已描述的方法从3个月大的小鼠建立骨髓基质(BMS)成骨细胞培养物(6)。在10nM地塞米松、8mM|3-甘油磷酸、50jig/ml抗坏血酸存在的情况下诱导这些细胞经历成骨分化。其培养液每两天更换一次。同源性建模LRP5第三YWTD、EGF结构域的同源性模型是根据从Swiss-Prot/TrEMBL数据库得来的序列(进入名Q9UP66(8))用ICM(MolsoftL.L.C.，LaJolla，CA)建造的。选用了低密度脂蛋白(Low-DensityLipoprotein,LDL)受体上YWTD-EGF结构域(PDB密码1IJQ(9))作为模板。仿真筛选(Virtualscreening)用UNITYTM程序(Tripos，Inc)在国家癌症研究所(NationalCancerInstitue，NCI)数据库里篩选可以适合由以Glu456为末端的六螺旋桨(six-propellers)组成的空穴的化学化合物。然后将侯选化合物用FlexXTM程序(Tripos,Inc)以最小能量对接在LRP5结构域上的Dkkl结合空穴中(10)。由国家癌症研究所癌症治疗和诊断部发育治疗计划药物合成和化学支获得具有计算所得最大结合亲和力的化学化合物以进行进一步的实验测定。根据生化分析的结果进行第二和第三轮的篩选。化合物对骨的作用评估IIIC3溶于DMSO并1:1000稀释到PBS中得到浓度为0.44mg/ml。对于颅局部注射，将15微升的IIIC3(0.22mg/Kg/日)、对照媒介、或阳性对照(b-FGF，12.5ug/Kg/日)注射入4周大的CD-l小鼠的颅盖右側的皮下组织，每日三次共5天，其使用之前所述注射方法(74、75)。第一次注射后22天收集颅盖并固定用于切片。对于全身性施用，将IIIC3(3mg/Kg/日)以及对照媒介腹腔内注射入两个月大的C57B1小鼠(n=19)，每天一次共7天。然后小鼠休息3周，治疗重复一次。最后一次注射后三周，麻醉小鼠并通过PIXImus小动物DXA系统(GE-Limar，Madison，WI)测量全部大腿骨和整体骨矿物含量(BMC;克)以及骨面积(平方厘米)，并计算BMD。全身测量排除头部。也在此时对这些小鼠测量重量。Wnt活性报告基因测定法如之前所述进行所述测定法(30、78)。简言之，细胞以5xl04细胞/孔的密度接种到24-孔培养板中，并用0.1mgGFP、0.025ugLEF-1、0.075ugLEF荧光素酶报告基因以及0.3ngLacZ/孔使用LipofectaminePlus(Invitrogen，CA)按厂商建议的方法转染细胞。转染24小时后，加入化合物和条件培养基。6小时后收集细胞提取物并进行荧光素酶测定法。焚光强度对比GFP荧光强度进行标准化。实施例1.LRP5的缺失突变体"^殳计一系列PCR引物，进行PCR反应，并将PCR片段亚克隆进载体而获得了几种LRP5的缺失突变体。第三和第四结构域(646-1198残基)缺失产生LRP5R12;第一和第二结构域(1-646残基)缺失产生LRP5R34;而第三结构域(947-1198残基)缺失产生LRP5R124(见图1A)。实施例2.LRP5第一结构域对Mesd-介导的LRP5的功能是必需的实施例2.1在LRP5第一结构域中的G171V突变破坏了LRP5的运输LRP5与Mesd的相互作用如图2A所示，用表达质粒转染HEK细胞。一天后将细胞裂解并用抗-Flag抗体进行免疫沉淀。Mesd是用Flag标记的，而所有LRP5分子都是用HA标记的。结果显示在LRP5第一结构域中的G171V突变破坏了LRP5与Mesd之间(图2A，泳道1和3)和R12与Mesd84200780049764.8突变却对这些相互作用没有影响(图2A，泳道2和3)。LRP5的突变体不能有效地将自己呈递到细胞表面。如图2B和图2C所示，用Mesd质粒和表达质粒转染HEK细胞。R12TGV,R12T,Rl-4和R1-4GV(GV)是AP的融合蛋白，它们是缺乏跨膜结构域的LRP5突变体因而会被分泌到细胞培养基中。一天后，收集条件培养基(CM)并做高速离心。其上清夜或用抗-HA抗体做免疫沉淀(图2C)或用来进行AP测定法(图2D)。还将细胞用SDS-PAGE的样品緩冲液裂解并进行Western印迹分析(图2C和D的下图)。结果指出G171V突变减弱了LRP5至细胞表面的呈递。评估细胞表面LRP5的水平用LacZ、野生型HA-LRP5或HA-LRP5G171V的表达质粒转染HEK细胞。在将细胞表面生物素化，并用抗-HA的抗体沉淀LRP5分子后，通过Western印迹用链酶亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HAP)检测细胞表面LRP5分子的水平(图2E上图)。LRP5在免疫复合体中的量由下图示出。这些结果显示G171V突变体在细胞表面的呈递减少。实施例2.2LRP5m，，v对Dkkl-介导的、对共表达Wnt活性的抑制的敏感性较低G171V突变对经典Wnt信号传导活性的影响如图3A所示，用质粒与LEF-1表达质粒、LEF-1萤光素酶报道基因质粒和GFP表达质粒一起转染HEK细胞。一天后，将细胞裂解。然后按照在"材料与方法，，中所描述的那样测定其GFP水平及萤光素酶活性，并对比GFP水平将萤光素酶活性标准化。将用LacZ转染的细胞中的活性计为100%作为对照。用对LRP5蛋白上带有的HA标记特异的抗体或抗LRP6的抗体检测LRP5、LRP5G171V、LRP6和LRP6d5sv的表达(图3A)。结果表明，HBMG171V突变与野生型(Wt)LRP5(LRP5Wt)相比，并没有提高LEF-l-依赖性的转录活性，无论在转录活性自身还是在共表达Wnt的转导信号方面。LEF-1是经典Wnt信号传导通路的下游靶转录因子。通过萸光素酶报告基因测定法测量其活性已经广泛地用于度量经典的Wnt活性(12、20)。于是，LRP5cmv既不是组成性活化也不能转导Wnt信号。令人惊讶的是，LRP6上对应的突变，用Val残基替换残基G-158，使其不能与Wnt-l协同作用(图3A)，可能使受体失活。G171V突变对由共表达的Wnt所刺激起的经典Wnt信号传导活性的影响如图3B所示，用LEF报道基因、Wnt-l、Dkkl和Kremen的质粒在存在LRP5wt或LRP5G171V的情况下转染HEK细胞。在存在LRP5wt或LRP5cmv的情况下，用LacZ转染，或用Dkkl，Kremenl和Wntl共转染人HEK细胞。当Kremenl和Dkkl存在时，Wnt在表达LRP5G171V的HEK细胞中的活性比在表达LRP5wt的HEK细胞中的活性高(图3B)。这些结果说明在存在Dkkl的情况下，LRP5G171V比野生型转导更多的信号。为确保差异不是多质粒转染的结果，检测了Dkkl、Kreminl和LRP5的蛋白表达(图3C)。在NIH3T3细胞和两个类成骨细胞系MC3T3和2T3中也得到了对Dkk介导的自分泌的Wntl活性的抑制的抗性增强的类似结果。实施例2.3Dkkl-AP与LRP5及LRP5突变体的结合如图4所示，用Mesd质粒及LRP5质粒转染HEK细胞，并在冰上与从表达Dkkl-AP的HEK细胞制备的条件培养基一起孵育。然后按照在"材料与方法，，中所描述的那样以任意单位(arbitraryunits,AU)测定AP活性。Wt及突变型LRP5分子的表达可见于图4B。这些结果表明，表达LRP5cn,v突变体的细胞与Dkk的表观结合比表达LRP5wt的细胞要少(图4A)，这和图2所示细胞表面LRP5cmv较少相符合。实施例3.Wnt活性需要LRP5的第二结构域如图5所示，用LEF活性报道基因质粒和表达质粒转染HEK细胞。表达质粒LRP5R494Q和LRP5G479V是在第二结构域含有点突变的LRP5受体。一天后将细胞裂解。然后按照在"材料与方法"中所描述，测定裂解的细胞的GFP水平及萤光素酶活性，并对比GFP水平将其标准化。图5显示与LRP5wt相比，LRP5R494Q和LRP5G479V可废除Wnt信号传导。这些结果指出，Wnt活性需要第二结构域。实施例4.Dkk-介导的抑制需要LRP5的第三结构域实施例4.1对第三结构域的分析解释为何LRP5G171V对于Dkk介导的抑制的敏感较低的主流假说是突变可石皮坏LRP5与Dkkl之间的相互作用。含G171的YWTD重复结构域是Dkk-1介导的拮抗作用所必需的假设是合理的。为了验证此假说，制作了两种LRP5缺失突变具有第三和第四YWTD重复结构域缺失的LRP5R12，和具有第一和第二YWTD重复结构域缺失的LRP5R34(图1)。为进一步描绘Dkkl介导的抑制所需的序列，制作了另一个的LRP5突变体LRP5R124,其中缺失第三个YWTD重复结构域(图1)。第三结构域的功能性分析如图6A所示，用LEF活性报道基因质粒、Krementl质粒和表达质粒转染HEK细胞。WtLRP5及其突变体分子的表达可见于图6B。结果显示LRP5R12或LRP5R124仍可增进由Wnt刺激的LEF-1活性，而LRP5R34则不行(图6A)，说明LRP5R12或LRP5R124仍保留Wnt共同受体的功能。但是，Dkkl在有LRP5R12或LRP5R124存在的情况下不能抑制Wnt信号传导(图6A)。这说明第三结构域对Dkkl-介导的抑制是必需的。Dkkl-AP与LRP5及LRP5突变体的结合如图6C所示，用Mesd质粒和LRP5质粒转染HEK细胞，并与从表达Dkkl-AP的HEK细胞制备的条件培养基在冰上一起孵育。然87后按照在"材料与方法"中所描述的，以任意单位(arbitraryunits,AU)测定AP活性。Wt及突变型LRP5分子的表达见于图6C右图。这些结果表示，LRP5R34含有Dkkl的结合位点，而且Dkkl的结合需要R34中的E721(图6C)。实施例4.2鉴定对Dkk抑制所必需的、在第三结构域相互作用表面上的氨基酸残基如本文所述，整个第三YWTD重复结构域的缺失可引起LRP5总构象的变化，制造这个结构域上的点突变可破坏Dkkl-介导的抑制。在第三相互作用表面上Ala取代突变的图示第三结构域空间充满模型(spacefilledmodel)是根据LDL受体YWTD重复结构域推断出来的(13)。Dkkl第三结构域的同源性模型是根据从Swiss-Prot/TrEMBL数据库得来的序列(进入名Q9UP66[18)用ICM(MolsoftL.L.C.，LaJolla，CA)建造的。选用了低密度脂蛋白(Low-DensityLipoprotein,LDL)受体上YWTD-EGF结构域(PDB代码1IJQ(22))作为模板。根据三维结构，产生了含有在第三结构域表面的Ala取代突变的19种LRP5突变体(图7A)。测定这些突变LRP5蛋白对Dkkl-介导的抑制的耐受能力，其结果见图7A。其中9种突变体改变了(大于5%)对Dkkl-介导的抑制的敏感性，且这些突变体所含突变位于同一表面(图7A)。代表性点突变对LRP5的Wnt共同受体活性的影响如图7B所示，用LEF活性报道基因质粒、Kremenl质粒和表达质粒转染HEK细胞。Wt和突变LRP5分子的表达在下图显示。在这19种突变中，E721突变显示出对Dkkl-介导的抑制的最强的作用，其次为W781，而后为Y719(图7B)。在第一和第二YWTD重复结构域上E721对应的残基(分别为Dili和D148)的突变没有显著地改变对Dkk介导抑制作用的敏感性。所有对Dkkl介导抑制作用有抗性的突变也对Dkk2介导的抑制作用有抗性。所有这些数据支持第三YWTD重复结构域是Dkk2介导的抑制作用所必需的结论。Dkk介导的抑制作用需要笫三个YWTD重复结构域的一个明显解释是这个结构域负责Dkkl的结合。测量Dkkl-Ap融合蛋白与HEK细胞表面表达的LRP5的直接结合(23)。实施例5.筛选与LRP5的特定第三结构域相互作用的化合物实施例5.1(A)用第三结构域作为模板筛选化合物仿真筛选(Virtualscreening)用UNITYTM程序(Tripos,Inc)在国家癌症研究所(NCI)数据库(http:〃129.43.27.140/ncidb2)里筛选可以适合第三结构域空穴的化学化合物。此数据库可免费检索并含有250，251个小化学化合物的交叉索引。检索查询设计为由具有0.3A容差的R764和E721、以及指向空穴的、距离Trp781为3.2A的、容差为l.OA的疏水中心构成。将化合物的柔韧性考虑在内，UNITYTM程序中的定向扭力算法(DirectedTweakalgorithm)允许快速的、构象柔軔性的三维检索。使用能够快速灵活的将配体对接到蛋白质结合位点的FkxXTM程序(Tripos，Inc.)(44)，将用UNITYTM程序获得的候选化合物对接(dock)入Dkkl结合表面来达到能量最小化(17)。对于Dkkl识别至关重要的残基E721、W864、Y719、R764、D877、F888、G782、W781和M891被考虑用作计算(图7A)。对接过程之后，根据用CscoreTM程序预测的结合到Dkkl结合口袋的能力对化合物进行排序。Cscore程序根据蛋白-配体复合体各自功能好坏的分数给出一个相对一致的分数(8)。CscoreTM程序然后还要经过最后人工肉眼检验。虽然我们向NCI请求得到40种具有最高的一致分数的化合物，但因为NCI无法提供，我们只得到17种。用这些化合物做了Dkk-1结合测定法。发现其中三种化合物对Dkkl与LRP5的结合有影响NCI106164(也称为IC14X图8A)抑制了Dkkl结合32%，而NCI39914(也称为IC13)(图8B)和NCI660224(也称为IC15)(图8C)分别可以刺激Dkkl结合645%和275%。NCI39914和NCI660224的刺激作用可能是由于这些化合物与第三结构域上Dkkl结合空穴的相互作用的增强。这种增强可能是由于存在于Dkkl和LRP5相互作用表面之间空隙的桥接。由于蒽-9，10-醌(图9A)是NCI39914(IC13)和NCI660224(IC5)所共有的结构，蒽-9，10-醌可能在与LRP5的结合相互作用中起关键性作用。因而用UNITYTM程序相似性检索算法对NCI数据库中与蒽-9，10-醌相似的化合物进行了二维检索。然后将检索出的化合物用FlexXTM程序按前面已描述的方法进行对接。从NCI获得了具有最高分的25种化合物，且对它们进行了测试。化合物NCI657566(图9B)和NCI366218(图10A)可以逆转Dkkl-介导的对Wnt信号传导的抑制。用NCI366218衍生出的模板进行新的二维相似性检索(见图9C)，又鉴定出13种候选化合物。生物学测定(如下面所描述的)表明NCI8642(图10B)对逆转Dkkl-介导的对Wnt信号传导的抑制和破坏Dkkl与LRP5的结合是最好的化合物。生物学测定法用生物学测定法篩选经过仿真筛选出的化合物。Dkk-l结合测定法如实施例2所描述(图4)的那样进行Dkkl-AP与表达全长LRP5或缺失最先两个结构域的突变体LRP5R34的HEK细胞的结合。就对Dkkl与全长LRP5的结合的抑制作用首先筛选第一批17种化合物。发现NCI106164(IC14)对Dkkl结合有68%抑制作用，而NCI39914(IC5)和NCI660224(IC3)分别刺激了Dkkl结合大约654%和276%(见表I)。至于通过IC5和IC13的结合增强，所述作用可能是通过这些协同分子的受体寡聚化或受体产生的变构作用的结果。重要的是，IC5、IC13(图8B)和IC15(图8C)都包括蒽-9，10-醌核心结构，说明了醌结构可能为分子与空穴的相互作用提供基本的相互作用力。在Dkk相互作用空穴中的几个芳香族氨基酸残基的存在支持了这一观点。表I。化学化合物(2mg/ml)对DKK1结合的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>表ii和表m用Wnt活性荧光素酶报告基因转染NIH3T3细胞。第二天，将化合物溶于浓度为2mg/ml的DMSO中并在组织培养基(基线)、含有Wnt3a(Wnt)的培养基、或含Wnt3a和Dkkl(Wnt+Dkk)的培养基中稀释到20ng/ml。没有任何化合物的DMSO用作对照。6小时后，裂解细胞并使用荧光素酶测定法确定Wnt活性。数据表示为基线活性的百分比。显示超过100%逆转Dkk抑制不影响Wnt活性的化合物用红色表示。Wnt活性测定法Wnt信号传导需要LRP5的第二和第三结构域，这些结构域可能与Wnt分子直接相互作用。因为这些结构域共享广泛的氨基酸序列同源性，某些与第三结构域结合的化合物可能也与前两个结构域结合而可能造成Wnt活性的抑制。第二批化合物最初用Wnt活性测定法篩选，接着又用结合测定法筛选从而证实那些可逆转Dkkl抑制的化合物抑制Dkk与LRP5的结合。如表II所示，第二批中有25种化合物用Wnt活性测定进行了筛选。具体而言，用Wnt活性萤光素酶报告基因转染NIH3T3细胞。笫二天，将化合物溶于浓度为2mg/ml的DMSO中并在含有Wnt3a(Wnt)的组织培养基(B基线)或含Wnt3a和Dkkl(Wnt+Dkk)的培养基中稀释到20ng/ml。没有任何化合物的DMSO用作对照。6小时后，裂解细胞并使用荧光素酶测定法确定Wnt活性。数据表示为基线活性的百分比。这些化合物做了以下检测1)对基线报道基因活性的抑制；2)对Wnt活性的抑制；3)对Dkk-介导的Wnt活性抑制的逆转。如表II所示，发现25种化合物中的17种可以抑制Wnt活性30%以上。发现有两种化合物，NCI366218和NCI657566，逆转Dkk-介导的对Wnt信号传导抑制而不影响Wnt活性。为了确定哪个化合物可以逆转Dkk-介导的抑制，用仿真篩选鉴定了第三批化合物。鉴定了13种化合物并对它们进行Wnt活性筛选。如表III所示，发现3种化合物对Wnt活性有强烈的抑制作用，并且有一种化合物(NCI8642)可显著地逆转Dkk-介导的抑制。如图11和图12所示，通过Wnt活性测定法和Dkk结合测定法进一步表征NCI8642和NCI366218。NCI8642在逆转Dkk-介导的抑制上更为有效。NCI8642比NCI366218具有更大范围的有效浓度。这两种化合物在高浓度开始显示对Wnt活性的抑制作用。因为这两种化合物都抑制Dkk-AP与全长LRP5及缺失最先两个结构域的LRP5R34突变体的结合，所以它们都通过石皮坏Dkkl与LRP5之间的相互作用而逆转Dkk-介导的抑制作用。NCI8642比NCI366218显示出对Dkkl结合更有效的抑制作用，这与其可更有效地逆转Dkk-介导的对Wnt信号传导的拮抗作用是一致的。骨生成测定法Wnt刺激培养的成骨细胞增殖和分化而Dkk抑制这个过程。因而这些化合物增强骨发生。这可以通过检测矿化和骨生成标志的表达来监测，所述骨生成标志包括BSP、骨钩蛋白(Osteocalcin)和胶原蛋白。我们还监测了由2.3KbCollAl启动子驱动的GFP表达。图13显示NCI366218刺激GFP表达，说明成骨细胞分化的增加。图14显示NCI366218刺激矿化。NCI366218还刺激颅盖器官培养中的骨形成。实施例5.1(B)用第三结构域作为模板筛选化合物就可能结合到所述空穴中的化学化合物对国家癌症研究所(NCI)数据库(http:〃129.43.27.140/ncidb2)进行附加仿真筛选。此数据库含有250，251个小化学化合物(M.W.<1,000Da)的交叉索引。用UNITY程序(Tripos,Inc.)进行最初的筛选。检索查询设计为由具有LRP残基Ghi721和0.3A容差的LRP残基Glu721和Arg754、以及指向空穴的、距离LRP5残基Trp780为3.2A的、容差为l,OA的疏水中心(69)构成(图17A)。为了将化合物的柔韧性考虑在内，使用UNITYTM程序中的定向扭力算法(DirectedTweakalgorithm)，其允许快速的、构象柔韧性的三维检索(21)。然后将用UNITY筛选得到的侯选化合物(~2000)用FlexX(Tripos，Inc)对接入LRP5结构域上的Dkkl结合表面，这样可以快速柔性地把配体对接到蛋白结合位点上(72、73)。参与Dkkl识别的LRP5残基Glu721、Trp863、Tyr719、Arg764、Asp887、Phe888、Gly781、Trp780和Met890(69),在计算时都被考虑在内。对接过程之后，根据用Cscore程序预测的结合到Dkkl结合口袋的结合亲和力对化合物进行排序。Cscore程序根据蛋白-配体复合体产生的各自评分函数给出一个相对一致的分数。随后将来自Cscore程序的结果进行最后人工肉眼检验。进一步测试具有最高的一致得分的17种化合物(化合物IC1-IC17，表IV)。对这些化合物进行Dkk-l-结合竟争和Wnt活性测定法。具体而言，用Wnt活性荧光素酶报告基因的转染NIH3T3细胞。第二天，将化合物溶于浓度为2mg/ml的DMSO并稀释到PBS中得到20jig/ml，再添加到在组织培养基(基线)、含有Wnt3a(Wnt)的培养基或含Wnt3a和Dkkl(Wnt+Dkk)的培养基中。没有任何化合物的DMSO用作对照。6小时后，裂解细胞并使用荧光素酶测定法确定Wnt活性。IO种化合物显示对Wnt激活的报告基因活性大于50%的抑制但不显著影响基线报告基因活性(表IV)。在这10种化合物中，4种影响Dkk-碱性磷酸酶(AP)与表达在细胞表面的LRP5的结合；IC14和IC15显示大于30%的抑制，而令人惊讶的是，IC5和IC13显示剌激结合(表IV)。Wnt活性的抑制作用可归因于化合物与最先两个YWTD重复结构域的结合，暗示所述结构域可能通过与Wnt分子的直接相互作用而参与Wnt结合(35、36、47)。重要的是，IC5、IC13(图17B)、以及IC15(图17C)都含有蒽-9，10-醌核心结构，说明了醌结构可能为分子与空穴的相互作用提供基本的相互作用力。在Dkk相互作用空穴中的几个芳香族氨基酸残基的存在支持了这一观点。表IV.第一轮筛选总结<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>表VI.基于IIC15筛选的总结化合物标号Lef活性％基线Wnt3aCMWnt3aCMDkklCM结构DMSO3708920ng/ml97309IIIC2100卯1070339362503193106<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>28627IIIC101071133613《f、、、-、、.10573HIC1187999404《37179921323391108表VII.基于IIC24筛选的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>IIC8和IIIC3是蓝色的。颜色图例与补充表I中相同。假设醌核心结构可以促进相互作用，我们进行了第二轮仿真篩选以及2D检索，使用UNITY程序的相似性检索算法对在NCI数据库中寻找与蒽-9，10-醌相似的化合物。如前所述用FlexX对接命中的化合物。随后从NCI获得得分最高的7种化合物并对其进行生物学测定法测试。就其逆转Dkk介导的对Wnt信号的抑制作用的能力(表V)鉴定了化合物IIC8(图17D)。除了蒽-9，10-醌为基础的化合物，获得了来自第一轮仿真筛选的在其Cscores中排序41-80的另外17种化合物。对这17种化合物的测试揭示了其中的9种抑制大于50%的Wnt信号传导(表IV中阴影化合物)。重要的是，这次篩选中的4种化合物包括IIC15(图17E)和IIC24(图17F)，显示能够逆转Dkk介导的对Wnt信号的抑制作用但不显著抑制Wnt信号传导本身(表IV)。用IIC15和IIC24为模板进行2D相似性检索，获得13种额外候选化合物用作Wnt活性测定法(表VI和VII)。一种IIC24为基础的化合物，11IC3(图17G)证明是Dkk介导的对Wnt信号传导抑制作用的非常强有力拮抗剂(表VII)。进一步描绘IIC8和HIC3化合物在Wnt活性和Dkk结合测定法中的特征。IHC3更有效地逆转Dkk的抑制，并具有比IIC8更宽的有效浓度范围(图18A、B)。1IC8在微摩尔浓度开始逆转Dkk介导的抑制作用，其近似ECs。为10jtM，而IIIC3在1jiM以下开始逆转Dkk介导的抑制作用，其ECs。为约2nM。在高浓度下，两种化合物都显示抑制Wnt信号。这种抑制作用可以归因于化合物对Wnt信号传导所需的最先两个YWTD重复结构域的低亲和力。因为两种化合物抑制Dkkl-AP与野生型LRP5(图18C)和缺少最先两个YWTD重复结构域但保留Dkk结合结构域的LRP5突变体(图18D)的结合(69)，作出这些化合物最可能通过破坏Dkkl与LRP相互作用来逆转Dkk抑制作用的结论是合理的。另外，IIIC3比IIC8更有效的抑制Dkkl的结合，这与其更有效的逆转Dkk介导的对Wnt信号的拮抗作用是一致的。而且，这些化合物对阻断Dkkl与LRP5结合的ICs。值(IIIC3约lpM以及IIC8约10nM)类似于这些化合物逆转Dkk抑制作用的ECs。值，进一步支持了这些化合物通过破坏Dkk与LRP相互作用来逆转Dkk抑制作用的结论。为更好理解化合物的功能与结构的关系，重新检测了Wnt抑制性化合物。我们所测的54种化合物中，几乎一半(74)化合物在20jig/ml表现对Wnt3a大于50%的抑制作用(表IV-VII)。最强力的Wnt抑制剂为IC15(图17C)。IC15对抑制Wnt3a活性具有约0.5nM的ICs。值(图19A)。这个值约比抑制Dkk结合到Dkk拮抗作用所需(图19A)的第三YWTDEGF重复结构域的ICs。值(5nM)低大约10倍。与之相对，抑制Wnt所需的IIIC3的浓度比抑制Dkk结合所需浓度至少高10倍，而IIIC30抑制Dkk结合的ICso值与逆转Dkk抑制作用的ICso值相似(图18)。通过IIIC3和IC15结合到第二和第三YWTD重复结构域的分子模型分析进一步支持了这些结论。尽管LRP5的第二和第三YWTD重复结构域共享广泛的氨基酸序列同源性(41%相同)，但在这两个结构域的配基结合空穴中存在相当的差异(图29)。在第二结构域的空穴比第三结构域上的空穴大，而第三结构域上的空穴更深(图19B、C)。应此，有理由预测比IIIC3大的IC15可更好的适合第二结构域的空穴，而IIIC3可能更好地与第三结构域上的空穴匹配。实际上，FlexX对接模型中，11IC3很好地适合第三结构域的空穴(图19B)，而IC15完美地适合第二结构域的空穴(图19C)。在IIIC3复合物结构中，如果第三结构域被第二结构域取代，所结合的IHC3会失去与耙残基的许多接触，所述残基包括Glu721、Tyr719、Leu823和Phe888(图19D)。另一方面，如果IC15复合物中第二结构域被第三结构域取代，第三结构域上的例如Leu823和Phe888的残基会与所结合的IC15不协调(图19E)。接下来确定是否最强力的Dkk拮抗性化合物IIIC3可以刺激小鼠中的骨形成。在局部骨形成模型中测试化合物。将IIIC3溶于DMSO并1:1000稀释到PBS中得到浓度为0.44mg/ml。使用之前所述注射方法将15微升的IIIC3(0.22mg/Kg/日)、对照媒介或阳性对照(b-FGF，12.5ug/Kg/日)注射入4周大的CD-1小鼠的颅盖右侧的皮下组织，每日三次共5天(74、75)。第一次注射后22天收集颅盖并固定用于切片。如图19所示，在b-FGF和IIIC3处理的颅骨中发现新骨。在刺激骨形成方面，HIC3显示与FGF—样强力。为了评估化合物在全身性骨形成测定法中的有效性，我们将IIIC3以及对照媒介注射入C57B1小鼠(8周大)的腹腔内。我们观察到与对照相比，在注射IIIC3的小鼠中股骨和全身骨矿物密度的显著增加(股骨2%增加和总计2.5%增加)(图19C、D),伴随体重的显著增加(7.1%，图19E)。这些结果进一步确证了LRP/Dkk相互作用为增强骨形成的潜在的治疗性乾标，并且证明了这些Dkk拮抗剂可作为合适的引导化合物用于进一步开发成治疗骨质疏松的合成代谢疗法。一般认为蛋白-蛋白相互作用难以被小分子化合物破坏。在本研究中，使用结合结构生物学、计算和生物学分析的筛选方法来鉴定能够有效破坏Dkk-LRP5相互作用的小分子化合物。仅仅基于靶标的预测的结构没有任何模板对化学品进行从头开始的最初仿真篩选。我们能够从仅54种化合物的物理筛选中鉴定化合物，并且连续几轮筛选产生比之前更好的化合物。另外，计算不仅使得单纯地鉴定适合空穴的化合物，也指导了能够区分两个相似空穴的化合物，例如LRP5的第三YWTD重复结构域和最先两个YWTD重复结构域。这个方法使得我们鉴定了强力的Dkk和Wnt拮抗性化合物，所述化合物显示出很可能被开发成用于治疗骨质疏松和癌症的治疗性试剂。另外，这些化合物为治疗性靶标确认和Wnt信号传导的基础研究提供了有用的工具。实施例6.用IHC3作为核心化合物来i殳计新的变体如上所述，IIIC3(NI8642)作用于Wnt活性的能力使得它可用于设计核心模型，其中变化在此模板上的R基团使得鉴定出也可以影响Wnt活性的其他分子。由此，如果象IIIC3—样，其中R1、R3、114和116是氢并且118是羟基，可产生一个更为有限系列的化合物，其保留了下面模型化合物(VIII)中的位点112R13、0-、-o为了起始这个系列，已经设计一组化合物，其中R"和R12为甲基并且Ri3象IIIC3—样为羟基，并且氨基四级化(quarternized)，提供结构(VI):用线性和分支的烷基在此化合物上设计对于R"变体的一系列取代。如前所述扫描得到的化合物(EnzoMOl-EnzoM12)的结构来获得其结合的可能性的分数。用于EnzoMOl-EnzoM12上的特定取代的列表以及获得的Cscore等级如下表VIII化合物IIIC3EnzoMOlE腦M02E腦M03E腦M04E励M05E腦M06E腦M0715区CH3CH2CH3(CH2)2CH3CH(CH3)2(CH2)3CH3CH2CH(CH3)2CH(CH3)(CH2CH3)Cscorc4434113E垂M08EnzoM09EnzoMlOE腦MllE励M12<formula>formulaseeoriginaldocumentpage114</formula>在另一个方法中，NCI8642的羧基被甲酰胺基替换而产生具有通用结构(VII)的一系列化合物OH,0、用于该系列中的特定置换的列表(EnzoM13-EnzoM41)以及获得的分数如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage114</formula>E腦M20HC(CH3)35EnzoM21H(CH2)3CH35EnzoM22CH3(CH2)3CH35EnzoM23HCH2CH(CH3)5EnzoM24CH3CH2CH(CH3)2EnzoM25CH3C(CH3)3E謹M26CH2CH3(CH2)2CH3EnzoM27CH2CH3CH(CH3)2E動M28CH2CH3(CH2)3CH3EnzoM29CH2CH3CH2CH(CH3)23EnzoM30CH2CH3(CH2)3CH3E励M31CH2CH3CH2CH(CH3)23E腦M32CH3(CH2)4CH3EnzoM33CH3(CH2)2CH(CH3)2EnzoM34H(CH2)4CH3EnzoM35H(CH2)2CH(CH3)2EnzoM36CH2CH3(CH2)4CH3E腦M37CH2CH3(CH2)2CH(CH3)25E腦M38CH2CH3CH2CH(CH3)(CH2CH3)2EnzoM39HCH2CH(CH3)(CH2CH3)5E腦M40HCH2C(CH3)32EnzoM41CH2CH3CH2C(CH3)34在另一系列化合物中，OH众羧基被酯化而得到结构(VIII)、o用各种基团设计一组化合物(EnzoM42-EnzoM70);这些取代和cScore如下表X化合物E腦M42E腦M43EnzoM44EnzoM45EnzoM46E腦M47E腦M48EnzoM49EnzoM50E腦M51EnzoM5213区CH2CH3(CH2)2CH3CH(CH3)2(CH2)3CH3CH2CH(CH3)2CH(CH3)(CH2CH3)C(CH3)3Gscore3116<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage118</formula>方面的能力，因为用于设计这些分子的化合物IIIC3仅具有相对cScore等级为斗。实施例7.评分精细化尽管所有在前面实施例中可得高分cSores的化合物都是测试的候选，合成和测试最有可能有效的化合物是更高效的。因为有很多化合物具有等级5(最高可能的cScore)，必须有一个不同的标准来将化合物分类。在计算cScore时，将各种组分的得分编译在一起得到最终等级。在初篩NCI库时，模板化合物，NCI18642(IIIC3)，显示这些组分之一的最高等级，FR-Score。如此，这个组分得分用于对具有cScore为5的核心化合物的各种类似物排序。以此来看，44种候选中的7种得分高于原本的NCI18642。这些化合物的值(以及IIIC3的值)在下面表XI中给出<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>这种方法再次显示了篩选仿真库来鉴定值得合成和生物学测定法测试的、有希望的候选物的能力。由于其更高的排名，有可能这些候选物可表现出比定义核心结构的原本化合物更高的效力。实施例8.从实施例7中选取的化合物的合成如上所述通过仿真篩选步骤选取的化合物的合成可通过若千本领域已知的方法进行。例如，通过用类似化合物并通过一个或多个替代步骤取代化学基团来产生所述化合物。在这个实施例中，IIIC3(NCI18642)可以花青购买到并可作为许多取代的起点。备选地，所需的化合物前体可与适当的R基团合成并接合在一起从而合成候选物来进行生物学测定法的测试。(A)合成EnzoM15向溶于40mlDMF的6.02g花青(无盐酸盐)溶液中加入6.62g的琥珀酰亚胺-l，l，3,3-四曱基脲四氟硼酸，随后加入6.96ml的二异丙基乙胺并在室温搅拌过夜。在去除DMF之后，将残余重悬于10ml无水THF并随后加入10ml溶于TMF中的2M二甲胺。混合物在50-60r加热5小时。通过用硅胶的柱层析(CH2Cl2/l%MeOH)纯化产物得到0.8g(12%产率)的EnzoM15(如下所示)。(B)合成E陽M14进行EnzoM14的合成基本上如EnzoM15所述的一样，除了用100ml的曱胺代替合成EnzoM15所用的二甲胺。加热的步骤也从5小时增加到过夜。如上所述进行硅胶纯化得到0.75g(12%产率)的EnzoM14(3。下所示)。120(C)合成EnzoMOl步骤l.合成曱基碘一个三颈烧瓶带磁力搅拌子装配上一个温度计，一个分液漏斗和连接上一个用来向下蒸馏的冷凝器的一个小分馏塔以及置于冰水浴中的一个收集烧瓶。将800g(4.8摩尔)的^化钾溶于430ml水中制成溶液并将其加入到烧瓶中。然后加入60g的碳酸钙并将混合物边搅拌边加热到60-65°C。温度保持在60-65X:并随后通过分液漏斗在2小时内逐渐加入630g(473ml，5摩尔)的"实用，，硫酸二甲酯。保持碳酸钙的加入速率以维持甲基碘产物的蒸馏进入收集烧瓶。在加入全部的碳酸钙之后，将温度升高到65-70匸保持约40分钟以完成曱基碘的蒸馏。从少量的残余水中分离产物并随后在无水氯化钩上干燥产物，然后将氯甲烷倾注到一个干燥的蒸馏烧瓶中。加入少量的碘化钾晶体并且从水浴中蒸馏产物。重新蒸馏的产物得到615-640g的产量(90-94%产率)并具有41-43。C的沸点。步骤2.将甲基添加到花青上1.5g花青(无氯化物)在1000ml烧瓶中溶于500ml的DMF。将混合物在30。C搅拌1小时并随后加入10ml的上述步骤中制备的甲基碘。随后加热该溶液并边搅拌边回流约72小时，冷凝管用球形大烧瓶密封并每12小时加入10ml曱基捵。随后THF在80C蒸馏出来。剩余固体(EnzoMOl)得到约卯％的产率。将100mg(0.33毫摩)的花青(无氯化物)、50ml甲醇、38jil(0.33毫摩)2，6-二甲基吡啶和0.5ml曱基碘的混合物置于带搅拌子的压力容器中。在约100。C搅拌并加热混合物长达4天。真空浓缩之121后，用5ml乙醇洗残余。过滤得到91mg的固体产物。EnzoMOl的结构如下(D)合成EnzoM02既然EnzoMOl显示有趣的结果(结果显示在下面的实施例中)，一个相关的、FR-Score低于原本IIIC3的化合物EnzoM02也选作合成和生物学测试。化合物EnzoM02基本上与EnzoMOl类似除了用一个乙基置换了在四级化氮上的甲基。如此，基本上如同EnzoMl所述制备EnzoM02，除了与乙基碘代替甲基碘进行四级化，并且以小规模进行。将100mg(0.33毫摩)的花青(无氯化物)、50ml甲醇、38jil(0.33毫摩)2，6-二甲基p比咬和0.5ml乙基碘的混合物置于带搅拌子的压力容器中。在约ioox:搅拌并加热混合物长达4天。真空浓缩之后，用5mi乙醇洗残余。过滤产物的产量是134mg，且EnzoM02的结构如下(E)合成EnzoM03另一个与EnzoMOl相关的(但与EnzoM02类似具有低于HIC3的FR-Score)的化合物EnzoM03选作合成。化合物EnzoM03与EnzoMOl不同在于具有一个丙基代替了在四级化氮上的曱基。如此，基本上如同EnzoM02所述制备EnzoM03，除了用丙基硪代替乙基碘进^f亍四级化。过滤产物的产量为138mg，且EnzoM03的结构如下实施例9,测试实施例8中合成的混合物如实施例8所述合成化合物之后，对其进行如前所述的Wnt活性和对Dkk抑制作用的影响的测试。另外，之前的筛选在测定法中已使用测试化合物的单一浓度。既然在本实施例中测试较少量的化合物，每个测试化合物的各种不同输入可同时就Wnt活性来测试。各种浓度的EnzoMOl的结果显示在图21中并作为比较，也包括了IC15的滴定。可以看出对于EnzoMOl和IC15，存在对Wnt活性的剂量-反应作用。然而，在剂量比IC15低大约15倍的EnzoMOl观察到相同水平的通过IC15观察到的对Wnt活性的抑制作用。在更高水平的EnzoMOl(8.33]LiM及更高)中观察到对Wnt活性影响的改变，可能说明对这个药物更复杂的响应。对这个特定的EnzoMOl制备物进行HPLC分析也显示其被少量的未反应的花青污染，这也可能成为高剂量下的一个因素。在图22中，显示了关于EnzoM14和EnzoM15的结果。在此实验中，EnzoM14显示对减少Wnt活性的剂量反应，而EnzoM15在6.1jiM之后显示更突然的反应。也可看出这些化合物对Dkk介导的对Wnt活性的抑制作用没有明显的影响。在图23中，显示了关于EnzoM02和EnzoM03对于每种化合物基本相似的结果。在本实验所用的浓度下出现对Wnt活性本身的很轻微的影响。然而，在所使用的最高浓度(6jiM和30jtM)下，这些化合物表现出降低Dkk对Wnt活性的作用的能力。实施例IO.各种化合对肺瘤细胞系存活的影响123如上所述，Wnt通路已经关联到癌症的发生和发展。已发现影响Wnt活性的三种化合物(IC15、IIIC3和EnzoMOl)应用于体外生长的肿瘤细胞系(PC-3)。将PC-3肿瘤细胞接种到补加10%FBS的Ham'sF12培养基的96孔板上(A)500个细胞/孔、(B)1000个细胞/孔；以及(C)2000个细胞/孔。将各种量的IC15、IIIC3或EnzoMOl(10pM、20jiM或80jtM终浓度)加入到培养基并继续生长10天。移去培养基，用PBS洗涤细胞并与含20%Celltiter96AqueousOneSolutionReagent(Promega，Madison,WI)的RPMI培养基(无酚红)孵育4小时。用根据厂商说明通过光吸收测量细胞增殖。该测定法的结果显示在图24中。这些化合物的存在似乎对实验最终存活的PC-3细胞的数量具有深刻的影响，然而所述药物的作用依赖于最初铺板的密度。在最低密度(500个细胞/孔)IIIC3和EnzoMOl在lO[iM显示了减少存活细胞数量，而IC15在20jiM显示出效果。在1000个细胞/孔样品中，IIIC3和EnzoMOl在10jiM水平分别显示10%和15%的存活细胞数量减少，以及在20nM水平大约50%减少；而IC15仅在所测的最高浓度80fiM下显示减少。在所测的最高细胞密度(2000个细胞/孔)，全部3种化合物在高于20nM的测试化合物存在的水平下表现出细胞毒性。总之，这个实施例表明选取的具有a)结合LRP5/6和b)影响Wnt活性的能力的3种不同化合物能够降低癌细胞系增殖的能力。实施例11.对P-连环蛋白活性的影响蛋白P-连环蛋白被认为是Wnt通路重要的下游靶标。先前已经注意与正常细胞相比，来源于胂瘤的许多细胞系具有水平升高的P-连环蛋白。实际上，直接调控P-连环蛋白活性的apc(腺瘤息肉症)基因上的各种突变和缺失已经强有力地与结肠癌的发展关联起来。例如，遗传改造具有apc基因上缺失的小鼠抹系("多发肠瘤形成"或"min，，林系)随其年龄增长倾向于发展出大量的肠肿瘤。对于通过ELISA测定法，就EnzoMOl对P-连环蛋白表达的影。肿瘤系主来自于不同组织类型卵巢癌(PA-1)、前列腺癌(PC-3)、乳腺癌(HTB-24和HTB26)以及结肠癌(Lysl74T)。A)细胞生长上面列出的各种细胞系生长到70%覆盖率，然后加入各种量的EnzoMOl并孵育16小时。移去培养基，收集细胞并将细胞裂解物用于ELISA测定法来测量P-连环蛋白。B)ELISA测定法用在碳酸钠pH9.0中的捕捉抗体---种抗P-连环蛋白的单克隆抗体(BDBioscience,SanDiegoCA)在4°C包被96孔板的孔过夜。第二天，用TBST(含0.02%Tween20的Tris緩冲盐溶液)洗孔一次并与1%BSA的封闭液室温孵育1小时。然后孔与抗P-连环蛋白的多抗((BDBioscience,SanDiego，CA)—起室温孵育45分钟。用TBST洗涤孔3次然后每孔加入过氧化物酶偶联的抗兔IgG二抗(CellSignalingTechnology,Danvers，MA)并孵育25分钟。用TBST洗涤孑L3次并且通过与S叩erSignalWestPicoStablePeroxideSolution(PieixeBiochemicals，Rockford，IL)1:1混合孵育来进行焚光显色。C)结果本实验的结果显示在图25A中。可以看出LS174T中P-连环蛋白的内在水平比其他细胞系中高很多并且在所用剂量下EnzoMOl对LS174T的具有微弱但剂量-反应作用，其中P-连环蛋白活性实际上随剂量升高而增加。然而，因为P-连环蛋白的活性在该细胞系中非常高，这使得其对于具有低得多的P-连环蛋白活性内在水平的其他细胞系的影响变得不清楚。因此，这个数据表示在图25B中而省略了LS174T的数据。可以看出尽管在乳腺癌细胞系HTB-26和HTB24以及前列腺癌细胞系PC-3中P-连环蛋白的水平没有本质的改变，但在高剂量的EnzoMOl下卵巢癌细胞系PA1中P-连环蛋白水平选择性的降低。EnzoMOl的IC50值在20-40nM的范围。实施例12.各种化合物对肿瘤诱导和发展的影响在关于饮食对结肠肿瘤的诱导和发展的影响的研究中，已显示apc"^+小鼠对特定膳食补充物P-糖基神经酰胺存在或不存在有反应(110)。试剂影响在该小鼠林系上自发性肿瘤的频率或大小的能力表现了就在活的动物上影响癌症诱导和发展的潜力测试一些先前鉴定的化合物的可能性。在仿真篩选过程中针对接合到LRP5上选取的位点的可能性鉴定了化合物IC15和HIC3。将这两种化合物施用于apc"^+小鼠并且在后面的时间点测定胂瘤的频率或大小。A)处理测试小鼠为了研究这两种化合物在体内的有效性，从JacksonLaboratories(BarHarbor,ME)获得8-9周大的C57BL/6JAPC(min/+)/j小鼠。该小鼠在正常饮食下饲养54天，随后换成高脂质饮食伺养36天。此时，用lml体积的媒介、625pMIIIC3活42nMIC15每隔一天共90天注射小鼠。在治疗期结束时，处死小鼠并取出其肠，接着用亚甲蓝染色来对肠中发生的肿瘤的数量和尺寸进行定量。B)结果各种尺寸的肺瘤的数量如下在表XII中给出。表XII<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>可见这两个化合物可减少肿瘤总体数量。在测试动物中肿瘤的平均数量对于对照是59.4而用11IC3和IC15治疗的动物分别仅为31.67和38.33。这显示用这些化合物治疗后47%和36。/Q的减少。也可看出，这些化合物的作用在较小尺寸的肺瘤上比较大肿瘤上看上去更显著。尽管其他的解释也有可能，这可能说明了这些化合物推迟了起始发生但一旦胂瘤已经建立对于进展有较少的影响。实施例13.各种化合物在高热量饮食的小鼠中对葡萄糖、胰岛素、甘油三酯和胆固醇的影响如前已述，已经显示LRP5/6在WnH言号传导通路中的多种作用，包括对正常胆固醇和葡萄糖代谢的调节。C57BL/6J小鼠最初在正常热量的饮食下祠养5天，之后禁食过夜并使用Lifescan血糖仪(Johnson&Johnson)进行血糖水平测定。随后对动物安排高热量々大食共10天，期间同时施用不同浓度的EnzoMOl、IC15和IIIC3(0.02、0.06和0.30mg/kg/日的EnzoMOl，0.2、0.6和3.0mg/kg/日的IC15以及0.5、2.0和8.0mg/kg/日的IIIC3)。在最后一天，动物接受过夜禁食并接着测定血糖水平。结果在用高热量饮食喂养10天之后，对照組小鼠显示大约30%的血糖水平增高。在图26中，可看出所有3种化合物不同程度的降低血糖水平。在所用的最高浓度下，HIC3和IC15将血糖水平复原到10%的正常生理血浆值内；而用EnzoMOl的治疗在浓度为0.02mg/kg/日最为有效。这些结果表明所有3种化合物能够将高血糖的小鼠恢复到正常血糖值而不会诱导低血糖。另外，也对血样进行了胆固醇和甘油三酯水平的分析。通过将血浆样品提交给临床实验室(EnzoLaboratories,Farmingdale，NY)来进行，在那里将它们像患者样品一样进行测定。图27A中可见，EnzoMOl和在27B中的IC15有效降^(氐甘油三酯的水平。在所用的浓度下，也可看出在图27A中EnzoMOl也有效降低胆固醇。实施例14.处理糖尿病小鼠除了研究这些化合物对用高热量饮食喂养的正常小鼠的影响，也通过IIIC3处理来测试明显的糖尿病和胰岛素抗性db/db小鼠127(JacksonLaboratories,BarHarbor,ME)。小鼠是高痩素的(hyperleptinemic)并且发展为肥胖症和II型糖尿病，部分地归因于对调控食物摄入和控制体重其重要作用的长型瘦素受体的功能缺失(m，ii2)。对糖尿病倾向的小鼠安排高热量饮食共12天，期间同时对小鼠施用7mg/kg/日的IHC3。在处理的最后，小鼠禁食12小时并接着向小鼠施用IP注射的lg/kg的葡萄糖，用作葡萄糖耐受测试。在注射后的各种时间，通过如前所述测定葡萄糖以及通过InsulinUltrasensitiveEIA(ALPCODiagnostics,Salem,NH)测定胰乌素来分析血中葡萄糖和胰岛素的浓度。参见图28A,用IIIC3处理的小鼠表现出葡萄糖处理处理能力的增强。这种影响也伴随血浆胰岛素水平的显著降低(图28B)。^印么、范围，因为这些实施方式旨在作为本发明几个方面的示例说明。任何等同的实施方式旨在含于本发明的范围内。实际上，本文所描绘和显示的之外的本发明的各种修饰对于本领域技术人员根据从前文所述是显而易见的。这些修饰也旨在含于附加的权利要求的范围内。本文引用多个参考文献，其公开通过引用全部并入。参考丈献.2001NIHConsensusConferenceDevelopmentPanelonOsteoporosisPrevention,DiagnosisandTherapy.JAMA285:785-795.2.Babijetal.,2003,JBoneMinerRes18:960-74.3.Baficoetal"2001,.NatCellBiol3:683-6.4.Bainetal.，2003,BiochemBiophysResCommun301:84-91.5.Boydenetal.，2002,NEnglJMed346:1513-21.6.Capellutoetal.2002，Nature419(6卯S):726-9.7.Cheyetteetal.2002,DevCell,Vol2449-461.,6-1一:g.10iHfsvt00￡.一EJwnSII-S8JssJp〖S8-S〔SIpifpiv7.661sd一l,I￡.寸n-6zl:s.3.§5.i.f-6661,1。Pn.oe.0寸e:寸-s寸81foawa-6661isn.6S.l8-/./-6s:sJ3l。！af"ooz.一e3n.8。"z-sl:z-lJjJIAi3uomf"ooz-一B.133!Z￥.M.￡z961-061。K,ps.Jndluo3.Jul.J〕.f>66一.SJnH-一N,n-SI-91。"go.8661.123、3H.81一6￡-68￡d寸"suap3.lul.uslc.ASguv-loos.一eW"scq3uruo./-I.Z9-S二6E315661JloTl06-98tl寸.IOA二ooz,33ulaa.n.寸8-as:(〔)01"003一23sp!UBa.nqdso.low.rsoz,838.MoonRTetal,1997,Cell,Vol.88，725-728.39.Nusse2001,Nature411:255-6.40.Panduretal,2001,Bioessays23:207-10.41.Pfaffl2001，NucleicAcidsRes29:e45.42.Pi歸netal,2000，Nature407:535-538.43.Poy2001,NatStructBiol.8(12):1053-7.44.Rareyetal，(1996)J.Mol.Biol.261:470-489.45.Schweizeretal,2003，BMCCellBiol4:4.46.Semenovetal,2001,CurrBiol11:951-61.47.Takagietal，2003，Nature424:969-74.48.Tamaietal，2000，Nature407:530-5.49.Tamaietal，2004，MolecularCell,Vol.13，149-156.50.Tolwinskietal,2003,etal,DevCell4:407-18.51.VanWesenbeecketal,2003,AmJHumGenet72:763-71.52.vonKriesetal,2000,NatStructBiol.7(9):800-7.53.Waszkowycz,etal,2001,旧MSystemsJ.40,360-376.54.Wehrli，etal,2000,Nature407:527-30.55.Wharton2003,DevBiol.253(1):1-17.56.Wodarz1998,Annu.Rev.CellDev.Biol.14:59-88.57.Wongetal,2003,MolCell.12(5):1251-60.58.Wongetal,2000,NatStructBiol.7(12):1178-84.59.XingYetal，2003,GenesDev.2003Nov15;17(22):2753-64.60.Zuckerman1996,NEnglJMed334:1519-25.61.Reyaetal,2005淑,434:84362.Kleberetal,2004CwrOpZwCe〃别o/16:68163.Loganetal，200"画ievCeZ/Dev腺20:78164.Sanchoetal，2004」朋wWevCW/Dev脂20:69565.Wangetal'2004C群G匿fDev14:53366.Moonetal,2004,淑WevG騰/5:69167.Heetal，2004,Dev却we"f131:1663.13068.Kawanoetal,2003/Ce〃116:262769.Zhang",2004，Mo/Ce〃肠/24:467770.Fujinoa/.，2003,尸roc胸"caM"'脆22971.Yamazakietal,2003，5ioc/zew肠;^少s/esCom顧w304:22972.HoffmannWa/.,1999,/她dCtem42:4422.73.Kramer1999，尸roto'ra37:22874.Mundya/.,1999,286:94675Dunstan"a/.，1999,/5oweM,Wes14:95376.Li,etal,2001，Ce//Afo/h/e58:208577.Smith,1999,2>m*所oc/柳18178.Yuanetal，1999，■/别o/.Ozew.274:3041979.Lietal,2002，JBC277:5977-598180.Lietal.'2005，JBC280;19883-1988781.Weietal.2006,Cell124;1141-115482.Johnsonetal"2004,JBoneDiseaseandMineralResearch19;1749-175783.Haytetal.2005,JBC280;13616-1362384.Kikuchietal.'2006，ExpMolec.Med38;1-1085.Mietal，2005,JCellBiochem95;328-338,86.Seme,etal.2005,JBC280;26770-2677587.Loganetal,Annu.Rev,CellDev.Biol20;781-81088.Streetenetal.,2003，JBoneMinerRes1889.Katoetal.2002,JCellBiol157;303-314卯.Krane2005,JExpMed201;841-84391.Krish腿etal.,2006,JClinInvest116;1202-192.Nussseetal.，1982,Cell31:99-10993.Liangetal.,2003，Cancercell4:349-36094.Weeraratnaetal"2002，CancerCell1:279-28895.Polakis2000GenesDev14:1837-185196.BehreiisandLustig2004IntJDevBiol48:477-48797.Luuetal.,2004CurrCancerDrugTargets4;653-67198.Baficoetal.,2004bCancerCell6;497-50699.Janssensetal.,2006InvestigationalNewDrugs24;263-280100.Tianetal.2003NEJM349:2483-2494101.Oshimaetal.，2005Blood106:3160-3165102.Toomesetal,2004Am.J.Hum.Genet.74:751-730103.Niemannetal.,2004AmJ.Hum.Genet74:558-563104.Grantetal.,2006,NatureGenetics38:320-323105.Rodovaetal.,2002J.Biol.Chem277:29577-29583106.Surend聽etal"AmJPhysiolRenalPhysiol282:F431-F441107.Chilosietal.'2003,AmJ.Pathol.162:1495-1502108.Cheonetal"2002Pro"Nat.Acad.Sci.(USA)99:6973-6978109.Miyaokaetal.,1999Schizophr.Res.38:1-6110.Symolonetal.2004J.Nutr.134:1157-1161111.ChenH.etalCell84:49"95，1996112.LeeG.H.Wa似re379:632—635，199613权利要求1.在有此需要的受试者中调节病理生理学过程的方法，其中所述病理生理学过程包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂质代谢、甘油三酯代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述方法包括对所述受试者施用有效调节所述病理生理学过程的量的、具有如下结构(I)的化合物其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12或R13中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12或R13中至少一个包含非氢原子的原子。2.权利要求1的方法，其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、1112和议13独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-dJ烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、礴酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、R"和R12、RU和R3、R3和R4、R"和R6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。3.权利要求2的方法，其中胺基组成的R11和R12上的氮带电并进一步组成R15，其中R"如之前对于R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12和ru所述。4.权利要求1的方法，其中所述病理生理学活性是骨相关活性。5.权利要求4的方法，其中所述骨相关活性包括骨形成、骨重建、成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。6.权利要求1的方法，其中所述肿瘤发生包括卵巢肿瘤发生、前列腺肿瘤发生或结肠肿瘤发生。7.权利要求1的方法，其中所述施用调节蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白的结合。8.权利要求7的方法，其中所述结合的位点是LRP5或LRP6的YWTD重复结构域。9.权利要求7的方法，其中所述蛋白是Dkk家族的成员。10.权利要求7的方法，其中所述蛋白是Wnt家族的成员。11.权利要求7的方法，其中所述蛋白是sclerostin。12.权利要求7的方法，其中所述蛋白是PA受体。13.权利要求12的方法，其中所述PA受体包括TEM8或CMG2。14.权利要求1的方法，其中R1、R3、R4、r6和R"是H,并且其中r"和r"是CH3基团。15.权利要求1的方法，其中r1、r3、r4、W和r"是h，并且其中r11、r"和r"是CH3基团。16.权利要求1的方法，其中r1、r3、r4、116和r"是h，其中r"和r"是CH3基团，并且其中R"是乙基。17.权利要求1的方法，其中r1、r3、r4、R6和r"是h,其中R"和R"是CH3基团，并且其中Ris是丙基。18.权利要求1的方法，其中r1、r3、r4、r6和R"是H，其中r"和r"是CH3基团，并且其中r"包括CH2C(ch3)3。19.在有此需要的受试者中治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述骨折、骨病、骨损伤或骨异常的量的、具有结构(i)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中r1、r3、r4、r6、r8、r"、r"或r"中的至少一个是氢原子，并且其中r1、r3、r4、r6、r8、r"、r"或r"中至少一个包含非氢原子的原子。20.权利要求19的方法，其中r1、r3、r4、r6、r8、r11、r"或r"独立地包含氩、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-d6)烷基、取代的线性的或分支的(d-d6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、疏化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中R'和R11、R"和R12、R"和R3、R3和R4、R"和R6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。21.权利要求20的方法，其中胺基组成的R"和R^上的氮带电并进一步组成R15，其中R"如之前对于R1、R3、R4、R6、R8、R"、R12和R"所述。22.在有此需要的受试者中治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的量的、具有结构(I)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R"或R"中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、1112或R"中至少一个包含非氢原子的原子。23.权利要求22的方法，其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、1112和R"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(Q-d6)烷基、取代的线性的或分支的(C广dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、R"和R12、R"和R3、R3和R4、R"和R6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。24.权利要求23的方法，其中胺基组成的R"和RU上的氮带电并进一步组成R15，其中R"如之前对于R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12和R"所述。25.在有此需要的受试者中调节病理生理学过程的方法，其中所述病理生理学过程包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂质代谢、甘油三酯代谢、脂肪生成、肺瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述方法包括对所述受试者施用有效调节所述病理生理学过程的量的、具有结构(II)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>R11、R12、R"或R"中的至少一个是R6、R8、R"、R12、R"或R"中至少其中R1、R3、R4、R6、R8、氢原子，并且其中R1、R3、R4、一个包含非氢原子的原子。26.权利要求25的方法，其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-Cw)烷基、取代的线性的或分支的(d-d6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、砩酸酯、膦酸盐、膦酸酯、■、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代砩酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中R'和R11、R"和R12、RU和R3、R3和R4、R"和r6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。27.权利要求25的方法，其中所述病理生理学活性是骨相关活性。28.权利要求27的方法，其中所述骨相关活性包括骨形成、骨重建、成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。29.权利要求25的方法，其中所述肿瘤发生包括卵巢肿瘤发生、前列腺肺瘤发生或结肠肿瘤发生。30.权利要求25的方法，其中所述施用调节蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白的结合。31.权利要求30的方法，其中所述结合的位点是LRP5或LRP6的YWTD重复结构域。32.权利要求30的方法，其中所述蛋白是Dkk家族的成员。33.权利要求30的方法，其中所述蛋白是Wnt家族的成员。34.权利要求30的方法，其中所述蛋白是sclerostin。35.权利要求30的方法，其中所述蛋白是PA受体。36.权利要求35的方法，其中所述PA受体包括TEM8或CMG2。37.权利要求25的方法，其中r1、r3、r4、R6和r"是h，并且其中r11、r"和r"是CH3基团。38.权利要求25的方法，其中r1、r3、W和i^是h,并且其中r11、r12、r"和r"是CH3基团。39.权利要求25的方法，其中r1、r3、议4和116是11，其中r11、r12和r13是ch3基团，并且其中r14是c(ch3)3。40.权利要求25的方法，其中r1、r3、r4、r6和R"是H，其中r"和r"是CH3基团，并且其中r"是(CH2)2CH(CH3)2。41.权利要求25的方法，其中r1、r3、r4、R6和r"是h，其中r"和rU是CH3基团，并且其中r"是ch2ch(ch3)(ch2ch3)。42.在有此需要的受试者中治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的方法，其包括对所述受试者施用有效调节所述骨折、骨病、骨损伤或骨异常的量的、具有结构(ii)的化合物其中r1、r3、r4、r6、r8、r11、r12、r13或r14中的至少一个是氢原子，并且其中r1、r3、r4、r6、r8、r11、r12、r"或r"中至少一个包含非氢原子的原子。43.权利要求42的方法，其中r1、r3、r4、r6、r8、r"、r12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(C,-C,J烷基、取代的线性的或分支的(d-d6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、R"和R12、R"和R3、R3和R4、R"和R6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。44.在有此需要的受试者中治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的方法，其包括对所述受试者施用有效调节所述糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的量的、具有结构(II)的化合物其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R13或R"中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。45.权利要求44的方法，其中R1、R3、R4、R6、R8、R"、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-dJ烷基、取代的线性的或分支的(d-C,J烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳垸基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中R'和R11、R"和R12、R"和R3、R3和R4、1113和116可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。46.在有此需要的受试者中调节病理生理学过程的方法，其中所述病理生理学过程包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂质代谢、甘油三酯代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述方法包括对所述受试者施用有效调节所述病理生理学过程的量的、具有结构(III)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、117或R8中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R"或Rs中至少一个包含非氢原子的原子。47.权利要求46的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-dJ烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、R3和R4、R2和R3、RS和R6、R6和R7、R7和R8可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。48.权利要求46的方法，其中所述病理生理学活性是骨相关活性。49.权利要求48的方法，其中所述骨相关活性包括骨形成、骨重建、成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。50.权利要求46的方法，其中所述肿瘤发生包括卵巢肿瘤发生、前列腺肿瘤发生或结肠胂瘤发生。51.权利要求46的方法，其中所述施用调节蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白的结合。52.权利要求51的方法，其中所述结合的位点是LRP5或LRP6的YWTD重复结构域。53.权利要求51的方法，其中所述蛋白是Dkk家族的成员。54.权利要求51的方法，其中所述蛋白是Wnt家族的成员。55.权利要求51的方法，其中所述蛋白是sderostin。56.权利要求51的方法，其中所述蛋白是PA受体。57.权利要求56的方法，其中所述PA受体包括TEM8或CMG2。58.在有此需要的受试者中治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述骨折、骨病、骨损伤或骨异常的量的、具有结构(III)的化合物其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、117或R8中至少一个包含非氢原子的原子。59.权利要求58的方法，其中R1、R2、R3、R4、Rs、R6、R7、R8独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(C,-dJ烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳垸基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯经基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、R3和R4、R2和R3、R5和R6、R6和R7、R7和R8可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。60.在有此需要的受试者中治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的量的、具有结构(III)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R1、R2、R3、R4、Rs、R6、W或R8中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、117或R8中至少一个包含非氢原子的原子。61.权利要求60的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(C广C，6)烷基、取代的线性的或分支的(d-d6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中R'和R2、R3和R4、R2和R3、R5和R6、R6和R7、R7和R8可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。62.在有此需要的受试者中调节病理生理学过程的方法，其中所述病理生理学过程包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂质代谢、甘油三酯代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述方法包括对所述受试者施用有效调节所述病理生理学过程的量的、具有结构(IV)的化合物R9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>R4其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、W或R1G中至少一个是氬原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9或R"中至少一个包含非氢原子的原子。63.权利要求62的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、W或r"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-Cw)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、^l代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或;p克代膦酸酯，其中W和r2、R2和r3、r4和R5、R3和r4、R6和r7、117和R8、RS和R9、1^9和R"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或《壬何如前所述的组合。64.权利要求62的方法，其中所述病理生理学活性是骨相关活性。65.权利要求64的方法，其中所述骨相关活性包括骨形成、骨重建、成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。66.权利要求62的方法，其中所述肿瘤发生包括卵巢肿瘤发生、前列腺肿瘤发生或结肠肿瘤发生。67.权利要求62的方法，其中所述施用调节蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、卩-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白的结合。68.权利要求67的方法，其中所述结合的位点是LRP5的YWTD重复结构域。69.权利要求67的方法，其中所述蛋白是Dkk家族的成员。70.权利要求67的方法，其中所述蛋白是Wnt家族的成员。71.权利要求67的方法，其中所述蛋白是sclerostin。72.权利要求67的方法，其中所述蛋白是PA受体。73.权利要求72的方法，其中所述PA受体包括TEM8或CMG2。74.在有此需要的受试者中治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述骨折、骨病、骨损伤或骨异常的量的、具有结构(IV)的化合物75.权利要求74的方法，其中r1、r2、r3、r4、rs、r6、r7、r8、r、戈r"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(Cj-C,6)烷基、取代的线性的或分支的(Q-qJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中r，和r2、r2和r3、r4和R5、r3和r4、R6和r7、R7和r8、rs和r9、rs和r"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或vf壬何如前所述的组合。76.在有此需要的受试者中治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的量的、具有结构(IV)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>77.权利要求76的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、RP或R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、疏化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、R2和R3、R4和R5、R3和R4、R6和R7、R7和R8、RS和R9、R"和R"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任:何如前所述的组合。78.在有此需要的受试者中调节病理生理学过程的方法，其中所述病理生理学过程包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述方法包括对所述受试者施用有效调节所述病理生理学过程的量的、具有结构(V)的化合物其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12、r13或r"中至少一个是氢原子，并且其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12、r"或r"中至少一个包含非氢原子的原子。79.权利要求78的方法，其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r"、r2、r"和r"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(C,-dJ烷基、取代的线性的或分支的(Cj-C,6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、疏化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和r11、r"和r12、！^2和r13、r"和r14、r"和r4、R4和r5、R6和r7、R7和r8、R8和r9、r9和R"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。80.权利要求78的方法，其中所述病理生理学活性是骨相关活性。81.权利要求80的方法，其中所述骨相关活性包括骨形成、骨重建、成骨细胞分化、破骨细胞分化、成骨细胞存活、破骨细胞存活、成骨细胞活性或破骨细胞活性。82.权利要求78的方法，其中所述肿瘤发生包括卵巢肿瘤发生、前列腺肺瘤发生或结肠肿瘤发生。83.权利要求78的方法，其中所述施用调节蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、{3-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白的结合。84.权利要求83的方法，其中所述结合的位点是LRP5或LRP6的YWTD重复结构域。85.权利要求83的方法，其中所述蛋白是Dkk家族的成员。86.权利要求83的方法，其中所述蛋白是Wnt家族的成员。87.权利要求83的方法，其中所述蛋白是sclerostin。88.权利要求83的方法，其中所述蛋白是PA受体。89.权利要求88的方法，其中所述PA受体包括TEM8或CMG2。90.在有此需要的受试者中治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述骨折、骨病、骨损伤或骨异常的量的、具有结构(V)的化合物其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13或R中至少一个是氬原子，并且其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。91.权利要求90的方法，其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、R"和R12、R^和R13、R"和R14、R"和R4、R4和R5、R6和R7、R7和R8、R8和R9、R9和R"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。92.在有此需要的受试者中治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的方法，其包括对所述受试者施用有效治疗所述糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的量的、具有结构(V)的化合物其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13或R"中至少一个是氢原子，并且其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。93.权利要求92的方法，其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、r"、r12、r"和r"独立地包含氢、氧、羟基、闺素、线性的或分支的(C，-d6)炕基、取代的线性的或分支的(d-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和r11、r"和r12、r"和r13、r"和r14、r"和r4、R4和r5、R6和r7、r7和R8、R8和r9、议9和r"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。94.调节病理生理学活性的组合物，其中所述病理生理学活性包括葡萄糖代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述组合物包括具有结构(i)的化合物R8R1r11<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中r1、r3、r4、r6、r8、r"或r12中的至少一个是氢原子，其中r13包含非氢原子的原子，并且其中r1、r3、r4、r6、r8、r11或r"中至少一个包含非氢原子的原子。95.权利要求94的组合物，其中r1、r3、r4、r6、r8、r11、r12和r"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(C^-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中r'和r11、r"和r12、r"和r3、R3和r4、r"和116可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。96.权利要求95的组合物，其中胺基组成的r"和r12上的氮带电并进一步组成r15，其中r"如之前对于r1、r3、r4、r6、r8、r11、r"和r"所述。97.治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的组合物，其包括具有结构(i)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中r1、r3、r4、r6、r8、r"或r^中的至少一个是氢原子，其中r13包含非氢原子的原子，并且其中r、r3、r4、r6、r8、r11或r"中至少一个包含非氢原子的原子。98.权利要求97的组合物，其中r1、r3、r4、r6、r8、r11、r12和r"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-dJ烷基、取代的线性的或分支的(C，-Cw)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、坑氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、疏代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和r11、r"和r12、rU和R3、R3和r4、r"和R6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。99.权利要求98的组合物，其中胺基组成的r"和r"上的氮带电并进一步组成r15，其中r"如之前对于r1、r3、r4、r6、r8、r11、ru和r"所述。100.治疗高血糖症、糖尿病或任何代谢疾病的组合物，其包括具有结构(i)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中r、r3、r4、r6、r8、r"或r"中的至少一个是氢原子，其中r13包含非氢原子的原子，并且其中r1、r3、r4、r6、r8、r11或r12中至少一个包含非氢原子的原子。101.权利要求100的组合物，其中r1、r3、r4、r6、r8、r11、r"和r"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(q-c16)烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和r11、r"和r12、r"和r3、R3和r4、r"和R6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。102.权利要求101的组合物，其中胺基组成的r"和r"上的氮带电并进一步组成r15，其中r"如之前对于r1、r3、r4、r6、r8、r11、r"和r"所述。103.权利要求94、97或100的组合物，其中R1、R3、R4、R6和R"是H,并且其中R11、RU和R"是CH3基团。104.权利要求94、97或100的组合物，其中R1、R3、R4、议6和R"是H,其中R"和R"是CH3基团，并且其中R"是乙基。105.权利要求94、97或100的组合物，其中R1、R3、R4、议6和R"是H,其中R"和R"是CH3基团，并且其中R"是丙基。106.权利要求94、97或100的组合物，其中R1、R3、R4、R6和R13是H，其中R11和R12是CH3基团，并且其中R15包括CH2C(CH3)3。107.调节病理生理学活性的组合物，其中所述病理生理学活性包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述组合物包括具有结构(II)的化合物其中R1、R3、R4、R6、R8、R"、R12、R"或R"中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。108.权利要求107的组合物，其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或疏代膦酸酯，其中R'和R11、R"和R12、RU和R3、R3和R4、R13和116可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。109.治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的组合物，其包括具有结构(II)的化合物其中R1、R3、R4、R6、R8、R"、R12、R13或R14中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。110.权利要求109的组合物，其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-C,6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、R"和R12、R^和R3、R3和R4、R13和116可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。111.治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的组合物，其包括具有结构(II)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>R11、R12、R"或R"中的至少一个是R6、R8、R11、R12、R"或R"中至少112.权利要求111的方法，其中R1、R3、R4、R6、R8、R11、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中Ri和R11、R"和R12、R"和R3、R3和R4、R"和R6可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。113.权利要求107、109或111的组合物，其中R1、R3、R4、R6和R"是H，并且其中R11、R"和R"是CH3基团。114.权利要求107、109或111的组合物，其中R1、R3、R4和R6是H，并且其中R11、R12、R"和R"是CH3基团。其中R1、R3、R4、R6、R8、氢原子，并且其中R1、R3、R4、一个包含非氢原子的原子。115.权利要求107、109或111的组合物，其中R1、R3、R4和R6是H，其中R11、R"和R"是CH3基团，并且其中R"是C(CH3)3。116.权利要求107、109或111的组合物，其中R1、R3、R4、R6和R13是H，其中R11和R12是CH3基团，并且其中R14是(CH2)2CH(CH3)2。117.权利要求107、109或111的组合物，其中R1、R3、R4、R6和R13是H，其中R"和R12是CH3基团，并且其中R"是(CH2)CH(CH3)(CH2CH3)。118.调节病理生理学活性的组合物，其中所述病理生理学活性包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂肪生成、胂瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述组合物包括具有结构(III)的化合物其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是氢原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、117或R8中至少一个包含非氢原子的原子。119.权利要求118的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、RS独立地包含氢、氧、羟基、闺素、线性的或分支的(Q-dJ烷基、取代的线性的或分支的(Q-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、R3和R4、R2和R3、R5和R6、R6和R7、R7和R8可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。120.治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的组合物，其包括具有结构(III)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是氢原子,并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中至少一个包含非氢原子的原子。121.权利要求120的方法,其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-dJ烷基、取代的线性的或分支的(C,-C,6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、R3和R4、R2和R3、R5和R6、R6和R7、R7和R8可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。122.治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的组合物，其包括具有结构(III)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是氬原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7或R8中至少一个包含非氩原子的原子。123.权利要求122的方法,其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、RS独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中Ri和R2、R3和R4、R2和R3、R5和R6、R6和R7、R7和R8可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。124.调节病理生理学活性的组合物，其中所述病理生理学活性包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述组合物包括结构(IV)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、119或R10中至少一个是氢原子，并且其中r1、r2、r3、r4、rs、r6、r7、r8、R9或r"中至少一个包含非氢原子的原子。125.权利要求124的方法，其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、议9或r"独立地包含氬、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(c,-c16)烷基、取代的线性的或分支的(c!-c")垸基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和r2、议2和r3、W和r5、R3和r4、W和r7、r和r8、rs和r9、议9和r"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。126.治疗骨折、骨病、骨损伤或骨异常的组合物，其包括具有结构(IV)的化合物其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9或r10中至少一个是氢原子，并且其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9或R"中至少一个包含非氢原子的原子。127.权利要求126的方法，其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、议9或r"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d_C16)烷基、取代的线性的或分支的(C,-C6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R2、R2和R3、R4和R5、R3和R4、R6和R7、R和R8、RS和R9、R"和R"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。128.治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的组合物，其包括具有结构(IV)的化合物其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9或R10中至少一个是氢原子，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9或R"中至少一个包含非氢原子的原子。129.权利要求128的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、议9或R"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(Ci-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、辨酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、疏代膦酸盐、或疏代膦酸酯，其中W和r2、R2和r3、)4和r5、R3和r4、R6和r7、r"和r8、rs和r9、W和r"可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。130.调节病理生理学活性的组合物，其中所述病理生理学活性包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢、脂肪生成、肿瘤发生、神经发生或任何骨相关活性，所述组合物包括具有结构(v)的化合物其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12、r13或r"中至少一个是氢原子，并且其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r"、r12、r"或r"中至少一个包含非氢原子的原子。131.权利要求130的方法，其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12、r"和r"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(d-C16)烷基、取代的线性的或分支的(d-dJ烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、疏代磷酸酯、疏代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和r11、r"和r12、r"和r13、r13和r14、r"和r4、R4和r5、R6和r7、R7和r8、R8和r9、r9和iT可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。132.治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的组合物，其包括具有结构(v)的化合物其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r"、r12、r13或r"中至少一个是氢原子，并且其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r1()、r11、r12、r"或r"中至少一个包含非氢原子的原子。133.权利要求132的方法，其中r1、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12、r"和r"独立地包含氢、氧、羟基、卤素、线性的或分支的(c,-d6)烷基、取代的线性的或分支的(q-c")烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、碌酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、疏代磷酸酯、硫代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和r11、r"和r12、r"和r13、r13和r14、r"和r4、R4和r5、R6和r7、r7和R8、R8和r9、R9和r10可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。134.治疗糖尿病、高血糖症或任何代谢疾病的组合物，其包括具有结构(v)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>其中R1、R4、Rs、R6、R7、R8、R9、R10、Ru、R,2、R13或R"中至少一个是氢原子，并且其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R"或R"中至少一个包含非氢原子的原子。135.权利要求134的方法，其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R1()、R11、R12、R"和R"独立地包含氢、氧、羟基、卣素、线性的或分支的(C,-C16)烷基、取代的线性的或分支的(Q-d6)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃基、取代的烯烃基、酰基、胺基、酰胺基、硝酸盐、硝酸酯、羧基、羧基酯、硫化物、亚砜、磺酸盐、磺酸酯、砜、磺酰胺、磷酸盐、磷酸酯、膦酸盐、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、疏代膦酸盐、或硫代膦酸酯，其中W和R11、R"和R12、R^和R13、R13和R"、R"和R4、R4和R5、R6和R7、R7和R8、R8和R9、R9和R10可独立地融合在一起从而形成一个或多个环、或任何如前所述的组合。136.具有结构(VI)的分离的化合物其中R"是线性的或分支的烷基,137.权利要求136的化合物，其中R"是线性的或分支的CVs烷基,138.权利要求136的化合物，其中R"是曱基。139.权利要求136的化合物，其中R"是乙基。140.权利要求136的化合物，其中R"是丙基。141.权利要求136的化合物，其中R"是CH2C(CH3)3。142.获得权利要求136的化合物的方法，其包括在促进形成所述化合物的条件下使花青与烷基面化物反应。143.包括权利要求136的化合物的组合物。144.具有结构(VII)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>其中R"和R"各自是独立的H或者线性的或分支的烷基。145.权利要求144的化合物，其中R"和R"是独立的H或者线性的或分支的Q"线性或分支的烷基。146.权利要求144的化合物，其中R"是H且其中R14是CH3基团。147.权利要求144的化合物，其中R"和R"是CH3基团。148.权利要求144的化合物，其中R"是CH3基团且其中R"是C(CH3)3。149.权利要求144的化合物，其中R13是H且其中R"是(CH2)2CH(CH3)2。150.权利要求144的化合物，其中R"是H，其中R"和R"是CH3基团且其中R";lCH2CH(CH3)(CH2CH3)。151.获得权利要求144的化合物的方法，其包括(a)用花青与试剂反应来将COOH基团替换成离去基团，从而获得中间产物；以及(b)用步骤(a)中获得的化合物与烷基胺反应来获得所述化合物(VII)。152.包括权利要求144的化合物的组合物。153.具有结构(VIII)的分离的化合物:、o其中R"是线性的或分支的烷基或者取代或未取代的环烷基,154.权利要求153的分离的化合物，其中R"是线性的或分支的155.权利要求153的分离的化合物，其中议13是环烷基<:3.8基团。156.包括权利要求153的化合物的组合物。157.鉴定千扰蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、J3-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白结合的化合物的方法，其包括(a)鉴定与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、|3-连环蛋白或LEF-1/TCF结合的化合物；以及(b)确定(a)中所鉴定的化合物是否调节蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白的结合。158.权利要求157的方法，其中所述化合物是小分子，蛋白质肽，多肽，环分子，杂环有机分子，核酸，脂质，带电荷脂质，极性脂质，非极性脂质，糖，糖蛋白，糖脂，脂蛋白，化学制品，或包含杂环有机分子、核酸、脂质、带电荷脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学制品的化合物片段。159.权利要求157的方法，其中步骤(a)中的化合物可以通过如下鉴定(a)使用UNITY程序篩选适合LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF的空穴或结合位点的化合物；(b)使用Flexx程序将所述化合物对接入空穴；以及(c)使用Cscore程序鉴定具有最高结合亲和力的化合物。160.鉴定干扰蛋白与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白或受体结合的化合物的方法，其包括(a)鉴定调节Wnt信号传导的化合物；以及(b)确实(a)中鉴定的化合物是否与LRP5、LRP6、Wnt、Dkk、巻曲蛋白、蓬乱蛋白、P-连环蛋白或LEF-1/TCF蛋白结合。161.通过如下步骤选择的组合物(a)测定作为Wnt信号传导通路的部分的目的蛋白的结构；(b)进行所述目的蛋白的突变分析，其中所述分析定义了所述目的蛋白与参与Wnt通路的第二蛋白相互作用的结合空穴；(c)进行化合物文库的虚拟篩选，从而评估化合物与所述空穴的可能结合亲和力；(d)基于其结合亲和力鉴定特定的优选化合物；(e)通过Wnt依赖性生物系测定法来测试所述优选的化合物，所述测定法测量由所述优选化合物存在引起的Wnt活性的变化；以及(f)基于所述生物测定法，从测试的优选化合物中选择一种或多种化合物，从而产生组合物。162.权利要求161的組合物，其中所述蛋白参与经典Wnt信号传导通路。163.权利要求161的组合物，其中所述蛋白参与非经典Wnt信号传导通路。164.权利要求161的组合物，其中所述的结构测定步骤包括X-射线结晶学、使用与所述蛋白或所述蛋白的部分结合的配体的X-射线结晶学、NMR光谱法、肽作图、丙氨酸扫描、突变分析、用结构已知的相关蛋白的类推或上述的任意组合。165.权利要求161的组合物，其中所述选择的化合物在所述生物系测定法中显示增加的Wnt活性。166.权利要求161的组合物，其中所述选择的化合物在所述生物系测定法中显示减少的Wnt活性。167.权利要求161的组合物，其中进行测量优选化合物对所述第二蛋白的亲和力的另一个测定法。168.权利要求161的组合物，其中所述文库是虚拟文库，并且在所述虛拟筛选步骤之后合成所述化合物。169.权利要求161的组合物，其中所述的化合物文库包括有机化合物、肽、核酸或上述任意组合。170.权利要求169的组合物，其中所述肽库包括随机肽、置换系列的肽、与所述目的蛋白结合的抗体的片段、所述第二蛋白的片段或其任意组合。171.权利要求169的组合物，其中所述核酸包括适体或蛋白结合序列。172.权利要求161的组合物，其中所述目的蛋白是Dkk家族成员、Wnt家族成员、LRP5、LRP6、Kremen、轴蛋白、蓬乱蛋白、巻曲蛋白、GSK3、(3-连环蛋白、LEF-l或Mesd。173.权利要求161的组合物，其中所述第二蛋白是Dkk家族成员、Wnt家族成员、LRP5、LRP6、Kremen、轴蛋白、蓬乱蛋白、巻曲蛋白、GSK3、P-连环蛋白、LEF-l或Mesd。174.通过如下步骤选择的组合物(a)测定作为Wnt信号传导通路的部分的目的蛋白的结构；(b)进行所述目的蛋白的突变分析，其中所述分析定义了所述目的蛋白与参与Wnt通路的第二蛋白相互作用的结合空穴；(c)进行化合物文库的虛拟筛选，从而评估化合物与所述空穴的可能结合亲和力；(d)基于其结合亲和力鉴定特定的优选化合物；(e)通过Wnt依赖性生物系测定法来测试所述优选的化合物，所述测定法测量由所述优选化合物存在引起的Wnt活性的变化；以及(f)基于所述生物测定法，从测试的优选化合物中选择一种或多种化合物，从而产生组合物。175.权利要求174的组合物，其中所述蛋白参与经典Wnt信号传导通路。176.权利要求174的组合物，其中所述蛋白参与非经典Wnt信号传导通路。177.权利要求174的组合物，其中所述的结构测定步骤包括X-射线结晶学、使用与所述蛋白或所述蛋白的部分结合的配体的X-射线结晶学、NMR光谱法、肽作图、丙氨酸扫描、突变分析、用结构已知的相关蛋白的类推或上述的任意组合。178.权利要求174的组合物，其中所述选择的化合物在所述生物系测定法中显示增加的Wnt活性。179.权利要求174的组合物，其中所述选择的化合物在所述生物系测定法中显示减少的Wnt活性。180.权利要求174的组合物，其中进行测量优选化合物对所述第二蛋白的亲和力的另一个测定法。181.权利要求174的组合物，其中所述文库是虚拟文库，并且在所述虚拟篩选步骤之后合成所述化合物。182.权利要求174的组合物，其中所述的化合物文库包括有机化合物、肽、核酸或上述任意组合。183.权利要求182的组合物，其中所述肽库包括随机肽、置换系列的肽、与所述目的蛋白结合的抗体的片段、所述第二蛋白的片段或其任意组合。184.权利要求182的组合物，其中所述核酸包括适体或蛋白结合序列。185.权利要求174的组合物，其中所述目的蛋白是Dkk家族成员、Wnt家族成员、LRP5、LRP6、Kremen、轴蛋白、蓬乱蛋白、巻曲蛋白、GSK3、p-连环蛋白、LEF-l或Mesd。186.权利要求174的组合物，其中所述第二蛋白是Dkk家族成员、Wnt家族成员、LRP5、LRP6、Kremen、轴蛋白、蓬乱蛋白、巻曲蛋白、GSK3、(3-连环蛋白、LEF-l或Mesd。全文摘要研究了Wnt共同受体LRP5的高骨量(HBM)突变调控经典Wnt信号传导的机制。之前已经显示该突变降低Dkk蛋白-1介导的拮抗作用，说明G171所位于的第一YWTD重复结构域负责Dkk蛋白介导的拮抗作用。然而，我们发现第三YWTD重复结构域而不是第一YWTD重复结构域是Dkk蛋白介导的拮抗作用所必需的。相反，我们发明G171V突变破坏了LRP5与Mesd的相互作用，产生细胞表面上较少的LRP5分子，Mesd是LRP5/6的伴侣蛋白，是共同受体转运到细胞表面所必需的。尽管细胞表面LRP5分子的减少导致例如旁分泌范式(paradigm)中Wnt信号传导的降低，但该突变似乎不影响在自分泌范式种共表达的Wnt的活性。联合所观察到的成骨细胞产生自分泌经典Wnt、Wnt7b，而破骨细胞产生旁分泌Dkk1，我们相信G171V突变通过降低旁分泌Dkk1的靶标数量发挥拮抗作用而引起成骨细胞中Wnt活性的增加，同时不影响自分泌Wnt的活性。文档编号A01N43/00GK101657096SQ200780049764公开日2010年2月24日申请日期2007年8月29日优先权日2006年11月14日发明者D·刘,D·吴,J·J·多尼甘申请人:Enzo治疗公司