专利名称：一种超甜玉米转基因再生苗的生根方法
技术领域：
本发明属于玉米组织培养及转基因研究技术领域，具体涉及一种超甜玉米转基因
再生苗的生根方法。
背景技术：
组织培养技术是指在无菌条件下利用人工培养基对原生质体、悬浮细胞、植物组织等进行培养的技术。组织培养技术在农业领域的应用十分广泛，是转基因技术不可或缺的组成部分，为遗传工程提供理想的受体材料；为常规植物改良程序提供一种新的手段，更快捷、高效地创造出各种农作物和园艺植物的新品种。 超甜玉米组织培养、转基因技术中，转基因再生苗的生根技术严重制约了超甜玉米遗传工程的发展。在生根阶段，通常的做法有两种。其一是转基因再生苗在整个生根过程只在一种培养基上完成，这类方法易产生两种不良现象(1)、生根培养基中如果生长素含量偏高，则在生根培养后期，根的表面往往表现为结构松散、凸凹不平、无根毛且透亮的玻璃化现象，这种类型的根在移栽时，植株成活率极低；(2)、生根培养基中如果细胞分裂素含量偏高，则不利于根源基的形成，造成生根缓慢甚至不生根。其二是转基因再生苗先在一种生根培养基中培养，一段时间后不生根的幼苗转接入第二种生根培养基，其中不生根的植株再转接入第三种生根培养基，甚至经历第四种、第五种生根培养基等，此类方法不足之处在于(1)、转基因再生苗整个生根过程复杂，时间跨度大，实验周期长；(2)、生根转基因再生苗历经多次在含不同种类激素(或浓度)的生根培养基上生长，易产生激素中毒现象，最终导致转基因再生苗死亡；(3)、在生育期内生根阶段占用时间长，影响后期的田间生长。
采用第一种生根法虽然也建立了多种基因型玉米的离体再生体系，但是生根情况普遍不理想，不能满足实际生产和研究的需要；加之适合一种基因型玉米的生根方法对另一种基因型却效果不理想，缺乏一种高效、广适性的玉米生根方法。采用第二种生根方法虽
然生根率较高，但是，由于生根培养过程繁琐、占用时间长，会明显影响后期的田间生长。因此，改良目前的生根培养方法是超甜玉米基因工程育种的需要，有助于转基因技术在超甜玉米育种实践中的应用。
发明内容
为克服现有超甜玉米转基因再生苗生根方法中存在的生根时间长、生根率不理
想、适应性狭窄等问题，本发明的目的在于提供一种适应性广、生根速度快且效果好的超甜
玉米转基因再生苗的高效生根方法。 本发明的目的通过下述技术方案来实现 —种超甜玉米转基因再生苗的高效生根方法，先在含NAA (萘乙酸)的根诱导培养基中诱导根源基的形成；随后转接到含NAA(萘乙酸)+IBA(吲哚丁酸)的生根培养基中继续进行再生根的生长培养。 作为优选，所述根诱导培养基中含NAAO. 04 0. 15mg/L ;更优选，所述根诱导培养
3基中含NAAO. 05mg/L。 作为优选，所述生根培养基中含NAA 0. 04 0. 15mg/L， IBA 1. 5 5. Omg/L ;更优选，含NAA 0. 05mg/L和IBA 2. Omg/L。 作为优选，所述根诱导培养基成分为1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VB！ 1. 75mg/L+VB6 0. 5mg/L+烟酸0. 25mg/L+甘氨酸2. Omg/L+NAA 0. 05mg/L+蔗糖20g/L+植物凝胶2. Og/L+MES 0. 5g/L。 生根培养基包括但不限于常规已知的用于组织培养的培养基，如Murashige和Skoog培养基，White培养基，Gamborg B_5培养基，Nitsch培养基，Heller培养基，ER培养基，N6培养基等，其可以是液体培养基或含有凝胶剂的固体培养基，所述凝胶剂为0. 5% 1.5%的琼脂、0. 1% 0. 3%的植物凝胶，或1% 8%的卡拉胶。 作为优选，生根培养基的主要成分除NAA和IBA夕卜，还包括1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+1/2RM维生素+植物凝胶。 本发明所述再生苗优选株型正常，主茎明显的再生植株，形成筛管、导管等传导组织。 培养时间方面，所述在根诱导培养基中培养的时间为5 10天， 一般又优选8天。
与现有的生根方法相比，本发明具有如下优点 本发明采用两步法诱导和促进生根培养，首先将再生幼苗培养在含适量生长素的培养基中进行根源基诱导，根源基形成并长出根点后再转接入含NAA和IBA的根生长培养基中，进行根的伸长培养。本发明能够使根在25天内生长到可以移栽的程度，与上述第一种方法相比提前5 10天；生根率达到96. 8%，生根率比对照1高出14. 5% ;与上述第二种方法相比，生根阶段所用时间比对照縮短23天，节省近一半时间。此外，本发明适用于多种基因型甜玉米，对其他植物的生根也有参考价值。 本发明中，术语"生根率"指有根点长出的再生植株占进行生根培养的再生植株的百分比。
图1为本发明中转基因再生苗在含NAA的根源基诱导培养基上的长势图。
其中la、为再生苗在含NAA0. 05mg/L的培养基生长10天时的根长势；lb、为再生苗在含NAAO. 15mg/L的培养基生长4天时的根长势；lc、为再生苗在含NAAO. lmg/L的培养基生长6天时的根长势；ld、为再生苗在含NAAO. 04mg/L的培养基生长10天时的根长势。
图2为本发明中转基因再生苗在含NAA+IBA的生根培养基上的根长势图。
其中2a、为再生苗在含NAAO. 05mg/L+IBA2. Omg/L的培养基上培养20天的根长势；2b、为再生苗在含NAA 0. 15mg/L+IBA 5. Omg/L的生根培养基上培养24天的根长势；2c、为再生苗在含NAA 0.05mg/L+IBA 2. Omg/L的生根培养基上培养21天的根长势；2d、为再生苗在含NAA 0.04mg/L+IBA 1. 5mg/L的生根培养基上培养22天的根长势。
具体实施例方式
下面结合实例及附图对本发明做进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此
实施例1 :以甜玉米自交系1132愈伤组织转基因再生苗进行生根培养 (1):在无菌条件下，挑选株型正常，主茎明显的再生植株，小心去除基部褐化组织。 (2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基，培养基成分为1/2MS大量元素 +1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VBi 1. 75mg/L+VB6 0. 5mg/L+烟酸0. 25mg/L+甘 氨酸2. Omg/L+NAA 0. 05mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2. 3g/L (或琼脂粉7. Og/L) +PH5. 8。培 养第10天时近50%的植株见根点长出(图la)。 (3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0. 05mg/L NAA+2. Omg/L IBA)的 生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长，20天后见大量根长出(图2a)，生根率 91. 3%。 此时移栽，移栽成活率达95%。 实施例2 :以甜玉米自交系1132愈伤组织转基因再生苗进行生根培养 (1):在无菌条件下，挑选株型正常，主茎明显的再生植株，小心去除基部褐化组织。 (2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基，培养基成分为1/2MS大量元素 +1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VBi 1. 75mg/L+VB60. 5mg/L+烟酸0. 25mg/L+甘 氨酸2. Omg/L+NAA 0. 15mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2. 3g/L (或琼脂粉7. Og/L) +PH5. 8。培 养第4天时近48%的植株见根点长出(图lb)。 (3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0. 15mg/L NAA+5. Omg/L IBA)的 生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长，24天后见大量根长出(图2b)，生根率 93. 1%。 此时移栽，移栽成活率达91%。 实施例3 :以甜玉米自交系1132愈伤组织转基因再生苗进行生根培养 (1):在无菌条件下，挑选株型正常，主茎明显的再生植株，小心去除基部褐化组织。 (2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基，培养基成分为1/2MS大量元素 +1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VBi 1. 75mg/L+VB6 0. 5mg/L+烟酸0. 25mg/L+甘 氨酸2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2. 3g/L(或琼脂粉7. 0g/L)+PH5. 8。培 养第6天时近55%的植株见根点长出(图lc)。 (3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0. 05mg/L NAA+2. Omg/L IBA)的 生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长，21天后见大量根长出(图2c)，生根率 96. 8%。 此时移栽，移栽成活率达99.4%。 实施例4 :以甜玉米自交系日超-l愈伤组织转基因再生苗进行生根培养 (1):在无菌条件下，挑选株型正常，主茎明显的再生植株，小心去除基部褐化组织。 (2):将上述准备的植株转入根源基诱导培养基，培养基成分为1/2MS大量元素 +1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VBi 1. 75mg/L+VB6 0. 5mg/L+烟酸0. 25mg/L+甘 氨酸2. Omg/L+NAA 0. 04mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶2. 3g/L (或琼脂粉7. Og/L) +PH5. 8。培养第10天时近51%的植株见根点长出(图ld)。 (3):将(2)中有根点长出的植株转入含NAA+IBA(0.04mg/LNAA+1.5mg/L IBA)的 生根培养基(其余成分同上)进行根的伸长生长，22天后见大量根长出(图2d)，生根率 92. 8%。 此时移栽，移栽成活率达95%。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在于先在含NAA的根诱导培养基中诱导根源基的形成；随后转接到含NAA+IBA的生根培养基中继续进行再生根的生长培养。
2. 根据权利要求1所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在于所述根诱 导培养基中含NAAO. 04 0. 15mg/L。
3. 根据权利要求2所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在于所述根诱 导培养基成分为1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/L+VBJ. 75mg/ L+VB60. 5mg/L+烟酸0. 25mg/L+甘氨酸2. Omg/L+NAA 0. 05mg/L+蔗糖10g/L+植物凝胶 2.Og/L+MES 0.5g/L。
4. 根据权利要求1所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在于所述生根 培养基中含NAA 0. 04 0. 15mg/L， IBA 1. 5 5. Omg/L。
5. 根据权利要求4所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在于所述生根 培养基中含NAA 0. 05mg/L和IBA 2. Omg/L。
6. 根据权利要求l所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在于所述 生根培养基成分中还包括1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2铁盐+肌醇125mg/ L+VBJ. 75mg/L+VB60. 5mg/L+烟酸0. 25mg/L+甘氨酸2. Omg/L+NAA 0. 05mg/L+IBA 2. Omg/L+ 蔗糖10g/L+植物凝胶2. Og/L+MES 0. 5g/L。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在 于所述再生苗选择株型正常，主茎明显且形成传导组织的再生植株。
8. 根据权利要求1-6中任一项所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在 于所述在根诱导培养基中培养的时间为5 10天。
9. 根据权利要求8中所述的超甜玉米转基因再生苗的生根方法，其特征在于所述在 根诱导培养基中培养的时间为8天。
全文摘要
本发明公开了一种超甜玉米转基因再生苗的生根方法，该方法生根率高，适用性广。本方法采用两步生根法，先在含NAA的根诱导培养基中诱导根源基的形成；随后转接到含NAA+IBA的生根培养基中继续进行再生根的生长培养。本发明与现有方法相比，生根时间短、速度快，生根培养25天即可移栽；生根率高，根系发达；移栽成活率高；适合多种基因型，是对超甜玉米转基因苗生根培养技术的重要改革。本方法对其他植物的生根也有参考价值。
文档编号A01H4/00GK101703000SQ20091019416
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者孙思思, 祁喜涛, 胡建广 申请人:广东省农业科学院作物研究所