专利名称：一种食蟹猴精液冷冻方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体是一种食蟹猴精液冷冻方法。
背景技术：
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发明内容
本发明的目的是提供一种食蟹猴精液冷冻方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种食蟹猴精液冷冻方法，精液样品要求新鲜精液活力> 0. 7，冷冻方法按以下操 作步骤进行1.食蟹猴精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1)冷冻稀释液配方冷冻稀释液由葡萄糖111. Ommol/L、TES 52. 3mmol/L、Tris 16. 5mmol/L、蔗糖 5. 8mmol/L、乳糖58. 4mmol/L、体积浓度为20%的卵黄、体积浓度为5%的甘油、青霉素10 000 OIU和硫酸链霉素50000IU组成；2)稀释液的配制准确称量1)配方的药品至事先经过灭菌过的平底烧瓶中；准备新鲜鸡蛋1 2 只，鸡蛋壳、镊子、手先用75%的酒精消毒，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋气室 面，倒掉蛋清，抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心，按体 积浓度为20%抽取卵黄上清液放到平底烧瓶中；最后用去离子水定容1L，混勻后用NaOH或 HCl调节稀释液pH至7. 0 7. 2，置于4°C冰箱中待用；2.精液稀释1)精液一次稀释食蟹猴精液一经采出来后，马上用不含甘油的稀释液作10 20倍的稀释，然后快 速将精液运送回实验室；2)精液二次稀释一次稀释好的精液送回实验室后，一边轻轻地摇晃精液一边缓慢的滴进甘油，使 最终甘油浓度为5% (ν/ν)，稀释后的精子活力不应低于0. 70 ；3.精液分装取出麦管，放在紫外线下照射15min消毒，用专用的精液分装器把稀释好的精液 吸到麦管中，不要吸得太满，预留0.5 1.0cm长的空气段，吸好后用酒精灯封口 ；4.精液平衡把分装好的精液用4 6层纱布包裹后放置4°C冰箱中平衡0. 5h ；5.精液冷冻打开冷冻程序仪，设定冷冻程序4°C 2°C，-1 V /min ；2 °C 2°C，5min ；2°C -90°C，-8°C /min ；把液氮慢慢倒进冷冻程序仪液氮瓶中，运行程序，当运行到5°C时，投入平衡好的精液麦管，让冷冻程序自动运行；当程序运行结束后马上投入液氮中， 在-196 °C条件下贮存；6.冷冻精液的解冻打开恒温水浴锅，把温度升至37°C，把冷冻麦管投入轻轻搅拌解冻，解冻复苏后， 取少量精液检查精子的活力，重复检查两次结果取平均值。本发明的优点是利用本发明技术，食蟹猴精液冷冻解冻中，精子冷冻解冻后活率 和复苏率分别达到45%和62%，可以充分发挥优良雄性食蟹猴的繁殖效率，也可以保存优 良食蟹猴的遗传基因，同时为其他珍惜濒危灵长类动物精子冷冻保存研究提供经验借鉴。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例1.精子冷冻保存与解冻复苏稀释后的新鲜精液经过精子图像分析仪分析，检出精子活力>70%的新鲜精液用 于本研究。合格的新鲜精液用0. 25ml麦管分装后放入4°C冰箱中平衡不同时间。用程序降 温仪降温，结束后马上投入液氮中(_196°C)贮存。解冻时将麦管从液氮中迅速取出，直接 投入37°C水浴中迅速搅动使精子解冻复苏。2.精子功能的检测1)精子运动度的检测新鲜精液稀释后以及解冻复苏后，取5μ 1精液置于37°C预 热的Makler精子计数板上，利用精子图像分析仪(CASA)检查精子的活力，重复检查2次， 结果取平均值。2)精子质膜完整性的检测伊红Y水实验法10 μ 1精液与40 μ 1 lg/L伊红Y水溶液于载玻片上混勻，覆盖 玻片，静置1 2min，显微镜下(X400)观察精子肿胀弯曲情况，计数200个精子，算出肿胀
弯曲率。计算公式肿胀弯曲率(％)=(弯曲肿胀精子数/总精子)X100%。3)精子顶体完整率检查用考马斯亮蓝R250染色液对精子进行染色。精子悬液离心(1500r/min5min)，沉 淀以4%甲醛PBS溶液悬浮固定lOmin，离心去上清，PBS洗涤2次；适量PBS悬浮沉淀，吸 取20 μ 1精子悬液涂片、晾干(或电吹风吹干)，精子涂片用0.05%考马斯亮蓝(CBB)染色 液滴玻片或入染色缸中浸染30min，三蒸水冲洗玻片，晾干，中性树脂封片。将制备好的涂 片在显微镜(1000倍油镜)下观察。每份样品制作2个涂片，每个涂片观察200个以上的 精子(分左、右二个区)，取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制 片。4)畸形精子检查畸形率是指异常精子的百分率，固定及染色方法同(2. 3)。精子畸形率(％ )= (畸形精子数P精子总数)X 100%。其中畸形精子种类有巨型精子、短小精子、双头或双 尾精子、精子头部残缺或与尾部分离、尾部变曲等。
3.实验设计
实验一在稀释液中加入5%甘油，冷冻前平衡不同时间(30、60、90、120min)。实验二 根据实验一的结果，在稀释液中加入不同浓度(3%、5%、7%、11% )甘 油，冷冻前平衡30min。4.统计分析所得数据进行反正弦转换，利用SAS 6. 12版的一般线形模型Duncan’ s多重比较 进行分析。5.结果与分析1)不同平衡时间对食蟹猴精液冷冻效果的影响实验重复10次，结果见表1，可以 看出，平衡时间为30min组的精子解冻后活力(42. 10% 士8. 46%)明显高于90min、120min 组(30.60% 士 14. 07%、27. 89% 士8. 39%)，差异显著(P < 0105)。平衡 30min 的精子复 苏率(57. 97% 士9. 96%)也显著高于(P < 0. 05) 90min、120min组的精子复苏率(42. 13% 士 18. 84%,38. 54% 士 13. 65%)。平衡30min组的精子解冻后活力、复苏率均比平衡60min 组的(33. 60% 士 11. 04%,36. 35% 士 14. 39% )好。各平衡时间组精子的膜完整率、顶体完 整率、畸形率差异不显著。结果显示，食蟹猴精液平衡30min后进行冷冻，冻后效果最好。表1不同平衡时间对食蟹猴精液冷冻效果的影响
平衡时间(min)冻后活力(％) 复苏率(％) 畸形率(％) 顶体完整率(％)膜完整率(％)
3042. 10±8. 46a57. 97±9. 96a 47. 81±12. 83a 57. 68±10. 07a 43. 91±17. 62a
6033. 60±11. 04ab46. 35± 14. 39ab 44. 64± 13. 68a 52. 38±8. 71a 44.41±14.37a
9030. 60±14. 07b42. 13 ± 18. 84b 51. 09 ± 14. 94a 50. 57 ±8. 28a 37. 64±13. 94a
12027. 89 ±8. 39b38. 54 ± 11. 06b 47. 37 ± 13. 30a 54. 76 ± 13. 56a 38. 22±16. 24a同一列数据上标不同字母表示差异显著(a、b :P < 0. 05)。2)不同甘油浓度对食蟹猴精液冷冻效果的影响实验重复10次，结果如表2所示，甘油浓度为3 %、5%时，解冻后精子活力 (45. 47% 士 15. 47%,45. 97% 士 10. 54% )显著高于 11%组(31.40% 士 16. 58%)，差异显 著(P < 0. 05)。表2不同甘油浓度对食蟹猴精液冷冻效果的影响
甘油浓度(％)冻后活力(％)复苏率(％) 畸形率(％) 顶体完整率(％) 膜完整率(％)345.47±15.47a61.91±20.15a 48.27±9.16a 45.02±13.68a46. 35 ±7. 34a
545.97±10.54a62.50±13.93a 53. 17± 11. 02a 49. 22± 15. 60a45. 78 ±4. 77a
741. 13±13. 82ab56. 14± 18. 70ab 49. 77 士 18. 14a 35.31±23.06a 45.47 ±8.33a
1131.40±16. 58b42. 53±22. 39b 58. 83±14. 05a 41. 52±18. 57a 39. 33土 13. 24a同一列数据上标不同字母表示差异显著(a、b =P < 0105)。甘油浓度为3%、5%时的精子复苏率(61.91% 士20. 15%,62. 50% 士 13. 93% ) 也显著高于(P < 0.05) 11%组的精子复苏率(42.53% 士22. 39%)。3%、5%组的精子冷 冻后活力、复苏率均比组的(41.13% 士 13.82%、56. 14% 士 18. 70% )要好，但差异并 不显著(P >0105)。各甘油浓度组间的畸形率、顶体完整率、精子膜完整率差异不显著，实 验结果显示，甘油浓度为3%、5%时对食蟹猴精液冷冻效果最好。
权利要求
一种食蟹猴精液冷冻方法，其特征在于，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行1)食蟹猴精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1.1)冷冻稀释液配方冷冻稀释液由葡萄糖111.0mmol/L、TES 52.3mmol/L、Tris 16.5mmol/L、蔗糖5.8mmol/L、乳糖58.4mmol/L、体积浓度为20％的卵黄、体积浓度为5％的甘油、青霉素100000IU和硫酸链霉素50000IU组成；1.2)稀释液的配制准确称量1.1)配方的药品至事先经过灭菌过的平底烧瓶中；准备新鲜鸡蛋1～2只，鸡蛋壳、镊子、手先用75％的酒精消毒，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋气室面，倒掉蛋清，抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心，按体积浓度为20％抽取卵黄上清液放到平底烧瓶中；最后用去离子水定容1L，混匀后用NaOH或HCl调节稀释液pH至7.0～7.2，置于4℃冰箱中待用；2)精液稀释2.1)精液一次稀释食蟹猴精液一经采出来后，马上用不含甘油的稀释液作10～20倍的稀释，然后快速将精液运送回实验室；2.2)精液二次稀释一次稀释好的精液送回实验室后，一边轻轻地摇晃精液一边缓慢的滴进甘油，使最终甘油浓度为5％(v/v)，稀释后的精子活力不应低于0.70；3)精液分装取出麦管，放在紫外线下照射15min消毒，用专用的精液分装器把稀释好的精液吸到麦管中，不要吸得太满，预留0.5～1.0cm长的空气段，吸好后用酒精灯封口；4)精液平衡把分装好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡0.5h；5)精液冷冻打开冷冻程序仪，设定冷冻程序4℃～2℃，-1℃/min；2℃～2℃，5min；2℃～-90℃，-8℃/min；把液氮慢慢倒进冷冻程序仪液氮瓶中，运行程序，当运行到5℃时，投入平衡好的精液麦管，让冷冻程序自动运行；当程序运行结束后马上投入液氮中，在-196℃条件下贮存；6)冷冻精液的解冻打开恒温水浴锅，把温度升至37℃，把冷冻麦管投入轻轻搅拌解冻，解冻复苏后，取少量精液检查精子的活力，重复检查两次结果取平均值。
全文摘要
本发明公开了一种食蟹猴精液冷冻方法。该方法要求精液样品新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行1)食蟹猴精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制；2)精液稀释；3)精液分装；4)精液平衡；5)精液冷冻；6)冷冻精液的解冻。本发明的优点是利用本发明技术，食蟹猴精液冷冻解冻中，精子冷冻解冻后活率和复苏率分别达到45％和62％，可以充分发挥优良雄性食蟹猴的繁殖效率，也可以保存优良食蟹猴的遗传基因，同时为其他珍惜濒危灵长类动物精子冷冻保存研究提供经验借鉴。
文档编号A01N1/02GK101810163SQ20101016711
公开日2010年8月25日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者卢克焕, 卢晟盛, 李林 申请人:广西大学