专利名称：一种控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因gs5的克隆与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及到一个位于水稻第五染色体短臂上 控制谷粒粒宽和粒重的主效QTL (GS5)的基因克隆与应用。
背景技术：
水稻谷粒大小是一个重大的农艺性状(1)谷粒大小由粒长、粒宽、粒厚三个子性 状控制，是千粒重的主要决定因素，而粒重又是水稻产量的三个主要构成因子之一。因此， 谷粒大小是一个重要的产量性状；(2)粒重和粒长、粒宽、粒厚等性状呈极显著正相关(邢 永忠等，2001，植物学报43:840-845)，所以谷粒大小还是一个重要的稻米外观品质性状。 稻谷品质越来越被世人所关注，人们对稻米米质的要求不仅是口味的舒适，还要求外型的 美观，因此稻米外观品质的好坏直接关系稻米商品性的好坏，而在我国国家优质稻谷标准 中还对稻米粒长与粒宽的比值作了具体规定，认为优质的籼稻品种的稻米长宽比不能低于 2.8。(3)谷粒大小在作物的进化研究中具有重要的意义。一般认为野生种具有小而圆的谷 粒粒形以适应自然选择，经过人类长期的驯化和选择，现有栽培种的谷粒粒形明显变大。因 此，阐明谷粒大小的遗传基础和分子机理有利于同时改良水稻的产量和品质，还可为禾本 科的进化研究提供线索。谷粒大小的遗传基础比较复杂，是典型的数量性状。利用分子标记技术可以对 控制数量性状的QTL(Quantitative Trait Loci)进行定位和分解，将复杂的数量性状分 解为简单的孟德尔因子来进行研究。利用这种方法，近年来已经发现了许多控制谷粒大小 的QTLs。其中位于水稻第五染色体短臂上控制谷粒粒宽和粒重的主效QTL，(该QTL在本 发明中被命名为GS5)在许多研究中都能检测到(林鸿宣等，1995，中国农业科学28 :1_7 ； Wan 等，2005，Theor. Appl. Genet. 110 1334-1346)。本实验室利用珍汕 97/ 明恢 63 衍生的 F2_3和重组自交系群体也多次检测到GS5区域存在一个主效QTL同时控制着谷粒粒宽和粒 重，并且可以揭示粒宽总变异的30%以上以及粒重总变异的10%以上(Yu等，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :9226_9231 ；Li 等，2000，Theor. Appl. Genet. 101 :248_254 ；Tan 等， 2000, Theor. Appl. Genet. 101 823-829 ；Xing 等，2001, Acta. Bot. Sin. 43 721-726 ；Xing 等，2002，Theor. Appl. Genet. 105 :248_257 ；Hua 等，2002，Genetics 162 :1885_1895)。这 些结果表明GS5基因可以在不同的遗传背景以及不同环境下都能稳定表达，因此GS5对于 水稻产量和品种性状的改良具有巨大的应用潜力和前景，对GS5基因进行克隆可以为水稻 的产量和品质育种提供新的重要的基因资源。在遗传上，QTL与控制质量性状的基因一样会通过遗传重组进行分离，差异只是 遗传效应的大小方面，因此QTL同样可以进行精细定位。但在初级群体中QTL与其它许多 非QTL位点一起同时发生分离，这些非QTL位点和环境因素一样都会对QTL的表型性状产 生极大的干扰作用。因此，在利用初级群体进行QTL定位时，QTL的置信区间通常在IOcM 以上(Darvasi 等，1992，Theor. Appl. Genet. 85 :353_359)，很难确定检测到的一个主效QTL 到底是一个还是多个微效 QTL(Yano and Sasaki, 1997, Plant MolecularBiology 35 145-153)。因此有必要在初级定位的基础上，对QTL进行高分辨率的精细定位(< IcM)。通 常，用于QTL精细定位的最好办法就是构建含有目标QTL的染色体片段替代系(Chromosome segmentsubstitution line, CSSL)或近等基因系(Nearly isogenic line, NIL)等次级 定位群体(Secondary population)，使群体中只有单个的QTL位点发生分离，极大限度地 减少了个体间由于遗传背景和环境不同造成的对目标性状产生的干扰，使该位点表现为简 单的孟德尔因子遗传，从遗传和统计上为QTL的精细定位创造便利条件。这种方法已经在 许多QTL的精细定位和基因克隆研究中发挥了重要的作用(Yano等，2000，PlantCell, 12 2473-2484 ;Frary等，2000，Science 289:85-88)。这些方法为采用图位克隆的策略分离、 克隆GS5的基因提供了依据。本发明利用图位克隆的方法分离克隆一个控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因 GS5，为水稻的产量和品质育种提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供线索。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个同时控制谷粒粒宽和粒重的主效基因的 完整编码区段DNA片段，利用这个基因改良水稻产量和品质的能力。申请人将克隆的这个 基因命名为GS5。本发明涉及分离和应用一个水稻粒形和千粒重的基因GS5，其中，所述片 段如序列表SEQ ID N0:1-6所示，或者基本上相当于SEQ ID NO 1_6所示的高度同源DNA 序列。具体地，本发明分离克隆的基因或等位基因以及调控上述基因或等位基因的启动 子的核苷酸序列的信息如下所示一种控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1 所示。上述主效基因GS5的编码序列如序列表SEQ ID NO 1中第2001-3449位对应的核 苷酸所示。与此同时，申请人得到一种控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5的等位 基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:3所示。上述等位基因的编码序列如序列表SEQ ID NO :3中第2004-3446位对应的核苷酸 所示。其中调控主效基因GS5的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1中 1-1834位对应的核苷酸所示。其中调控主效基因GS5的等位基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3中1-1837位对应的核苷酸所示。本发明从珍汕97B和H94组合衍生的双单倍体群体里选择含有GS5基因且55% 遗传背景与珍汕97B —致的材料，与珍汕97B回交三代，自交，构建GS5的近等基因系(图 2)。利用近等基因系群体分析，发现该基因对粒宽和粒重都有很大的效应(表1)，后代测验 表明，该基因呈现孟德尔基因分离比(图3)。利用GS5近等基因系的遗传大群体和图位克 隆的方法，将GS5精细定位到8. Okb的染色体区段内(图4)，然后结合该区段内的一个全长 cDNA的序列信息，对GS5的基因结构和编码的蛋白质产物进行预测和分析，发现该基因包
4含10个外显子，共编码481个氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质具有PF00450保 守结构域。Real-Time PCR表达分析发现，该基因全生育期在各个组织表达，并且在颖壳胚 乳中宽粒品种(珍汕97B)比小粒(H94)的表达量高(图5)。预测表达量起重要作用，于是 利用RT-PCR获得H94的cDNA阳性克隆，亚克隆后，进行转基因超表达验证，将该基因转入 水稻宽粒品种中花11中，转基因TO代阳性超表达单株均表现出更宽的粒形(图7)，并且 其Tl代共分离检测发现，粒宽和表达量正相关(表2)。此外，利用水稻两个大粒品种(珍 汕97和特青)和两个小粒品种(H94和明恢63)进行比较测序，发现在3. 9kb的启动子和 cDNA范围内大小粒品种间存在22个共同的SNP和InDel差异，其中18个突变位于启动子 区，4个突变位于编码区的第1、第2和第9个外显子，导致了 5个氨基酸替换(图8)。由于 超表达窄粒的等位基因可以使宽粒变得更宽，所以编码区的5个氨基酸替换不是等位基因 变异的原因，进而说明了启动子区的变异是导致表达量变化的原因，进而导致粒宽变异，同 时说明GS5是一个正调控种子大小和粒重的基因。本发明的优点在于(1)本发明首次在水稻中克隆了一个对粒宽和粒重具有很大正调控效应的基因， 为水稻等禾谷类作物的高产优质育种提供了新的基因资源，也为其它作物中克隆相关基因 提供了技术借鉴；(2)本发明中克隆的基因也可以为水稻等禾谷类作物以及油菜等双子叶作物的分 子进化研究提供证据。
序列表SEQ ID NO 1显示的是本发明分离克隆的来源珍汕97B的GS5等位基因的 DNA序列(其中包含其启动子序列、5，UTR、不包含内含子的⑶S、3，UTR)。序列表SEQ ID NO :2显示的是本发明分离克隆的来源珍汕97B的GS5蛋白的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 3显示的是本发明分离克隆的来源H94的GS5等位基因的DNA序列(其中包含其启动 子序列、5，UTR、不包含内含子的CDS、3，UTR)。序列表SEQID NO :4显示的是本发明分离克 隆的来源H94的GS5蛋白的氨基酸序列。图1.是本发明的技术流程图。图2.是本发明的近等基因系构建流程图。回交时，以珍汕97作为母本。图3. BC3F2随机群体中谷粒粒宽的频率分布。图中黄色、灰色和白色棒分别表示 GS5位点珍汕97基因型，杂合基因型和H94基因型，GS5的三种基因型是通过分子标记检测 得到的。图4.是本发明的近等基因系的粒型表现以及GS5基因的图位克隆。标记间的数 字代表各标记与GS5位点间发生的重组次数。图5.GS5基因在水稻全生育期不同组织中表达水平示意图。使用材料是 NIL(ZS97)和NIL(H94)GS5基因纯合材料。图6.是本发明的转基因所用的功能性载体图PCAMBIA1301骨架。图7.是本发明的转基因单株的粒型和粒重的表现和表型统计分析。A图左为中花 11阴性单株粒型，右为阳性单株粒型；B图为阴性与阳性转基因单株的粒宽统计结果；C和 D图为阴性与阳性转基因单株的粒宽和千粒重统计结果。
图8.本发明克隆的GS5基因的结构示意图和其自然变异分析。黑色的方框代表 外显子，细线代表内含子，“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码，ATG前的粗线 代表2000bp的启动子，大小粒型形品种间的22个SNP和InDel变异位于GS5基因的启动 子和编码区(SNP替换均用相应的碱基代表，InDel缺失均用相应的圆点代表)，编码区有5 个氨基酸变异，内含子有4个SNP变异。
具体实施例方式根据图1的技术路线，从水稻品种珍汕97B(江西省农业科学院颜龙安院士选育和 惠赠)和H94(上海市农业生物基因中心的罗利军研究员惠赠)组合衍生的双单倍体群体 里选择含有GS5基因且55 %遗传背景与珍汕97B —致的家系(DH27)，与珍汕97B杂交，珍汕 97B为轮回亲本，连续回交3代，自交，构建了水稻GS5基因的近等基因系BC3F1。利用一个含 有288个BC3F2单株的随机群体对GS5进行了定位和遗传效应分析；利用目标区间公共SSR 标记对来自于9639个单株的大遗传群体筛选重组单株，最终将GS5定位到C62和C63区间， 两者物理距离为8. Okb (图4)；然后结合该区段内的一个全长cDNA的序列信息，对GS5的基 因结构和编码的蛋白质产物进行预测和分析，发现该基因包含10个外显子，共编码481个 氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质具有PF00450保守结构域。Real-Time PCR表达 分析发现，该基因全生育期在各个组织表达，并且在颖壳胚乳中宽粒品种(珍汕97B)比小 粒(H94)的表达量高。预测表达量起重要作用，于是利用RT-PCR获得H94的cDNA阳性克 隆，亚克隆后，进行转基因超表达验证，将该基因转入水稻宽粒品种中花11中，转基因Ttl代 阳性超表达单株均表现出宽的粒形(图7)，并且其T1代共分离检测发现，粒宽和表达量正 相关。此外，利用水稻两个大粒品种(珍汕97B和特青)和两个小粒品种(H94和明恢63) 进行比较测序，发现在3. 9kb的启动子和cDNA范围内大小粒品种间存在22个共同的SNP 和InDel差异，其中18个突变位于启动子区，4个突变位于编码区的第1、第2和第9个外 显子，导致了 5个氨基酸替换(图8)。由于超表达窄粒的等位基因可以使宽粒变得更宽，所 以编码区的5个氨基酸替换不是等位基因变异的原因，进而说明了启动子区的变异是导致 表达量变化的原因，进而导致粒宽变异。以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离克隆GS5基因，遗传转化，比较测序 验证GS5等位基因之间序列差异的方法和该基因时空表达谱。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明本质和范围的情况 下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1 构建GS5近等基因系1回交与选择如附图2所示，从宽粒水稻品种珍汕97B和窄粒品种H94组合衍生的双单倍体群 体里选择含有GS5基因且55%遗传背景与珍汕97B —致的家系，与珍汕97B杂交，珍汕97B 为轮回亲本，连续回交3代，在BC1F1以及BC2F1代对GS5只进行正向选择，即选择目标区段 为珍汕97B/H94杂合基因型的单株用于下一轮的回交。目标区段参照前人的QTL定位结 果确定在两个 SSR(Simple Sequence Repeat)标记 RM593 和 RM574(参见(http //www, gramene. org/)所界定的区间内。存BC3F1代，除进行正向洗择外，还对目标区段以外的遗 传背景进行扫描，从中选择遗传背景与珍汕97B最为相近的单株的后代(BC3F2，NIL (H94)用于后续的实验。该近等基因系材料NIL (H94)于2010年5月27日送交湖北省武汉市武汉 大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC P201007。2微卫星标记基因型鉴定方法(SSR技术)PCR标准程序参见参见J.萨姆布鲁克等，2002,分子克隆实验指南，第三版，金冬 雁等(译)，科学出版社介绍的方法。PCR 采用 20 μ 1 的反应体系，包含20-50ng DNA 模板，IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, 0. 1% Triton X-100,1. 8mM MgCl2,0. ImM dNTP，0.2ym 引物(如上所述的 RM593 和 RM574 的引物，参见 http ://www. gramene. org/)禾口 IU Taq DNA polymerase。PCR 扩增的条件为 94°C预变性 4min ;94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，34 个循环；72°C延伸 IOmin0 PCR 产物 在6%的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染(Bassam等，1991，Anal. Biochem. 196 80-83)。实施例2 :GS5的精细定位和图位克隆1粒宽的表型测量谷粒自然干燥后置于室温下至少放置3个月以上以保证谷粒的干燥和各株系间 含水量的相对一致。从每单株中随机选取饱满谷粒10粒，按照同一个方向肩并肩，不重叠、 不留隙的方式，紧靠摆成一行，用游标卡尺读出宽度，求其平均值即为谷粒宽度。谷粒千粒 重根据随机挑选的200粒饱满谷粒的重量来估算。从BC3F1单株衍生的BC3F2群体中随机挑选了 288单株构成一个随机群体。考察珍 汕97B、H94以及随机群体中每个单株的谷粒宽度等性状，并用两端分子标记RM593和RM574 确定各株基因型，结果发现该性状在两亲本间都具有显著差异。在随机群体中，谷粒宽度表 现为半不连续分布(图3)。以3. 14mm的谷粒宽度为分界线，可分为两类，即大粒和小粒类 型(表1和图3)，且对粒重和单株产量均有显著影响。本发明中将宽而重的谷粒称之为大 粒，另外一种短而轻的谷粒类型称之为小粒。卡方测验表明三种类型符合单个孟德尔因子 的1 2 1分离比窄粒宽粒=222 66，X2 = 0. 51 < X2qq5i1),表明在此BC3F2群体中， 粒大小是由一个主效基因控制的，并且小粒等位基因对大粒等位基因表现为半显性作用。表1近等基因系中GS5的对产量性状的影响分析 2分子标记的开发本发明中所用到的SSR标记信息全部来自于Gramene网站数据库(http://www. gramene. org/).此外，还根据网上公布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列(http:// rgp. dna. affrc. ro. jp)以及籼稻品种 93-11 的基因组序列(http //rise, genomics, org. cn/)设计和鉴定多态性标记，设计原则是在两者间有2-6bp缺失的、PCR片段大约 有100-200bp长度、目标片段上平均分布了，用设计的引物扩增珍汕97B和H94模板DNA， 4% PAGE胶电泳检测，最终设计了 13对在珍汕97B和H94间具有多态性的Indel (Insert/Deletion)标记，用于GS5的精细定位分析。这些标记的序列信息见表4。3重组单株的后代测验分析和GS5的精细定位及候选基因确定为进一步缩小GS5的定位区间，从9639株由BC3F1单株衍生的BC3F2大群体中挑选 出重组单株。首先用SSR标记RM593和RM574标记进行筛选，从4374个单株中共找到94个重 组单株，这些单株经过后代测验确认其上一代的表型每个重组单株种植24株后代作为一 个家系，性状分离的家系说明上一代表型是杂合的，后代性状不分离且是高值性状的说明 上一代表型是来至珍汕97B纯合的，低值说明上一代表型是来至H94纯合的。然后，利用发 展的13个InDel标记分析这94个重组单株，结果发现在RM574和GS5间存在4个重组单 株，在RM593和GS5存在90个重组单株，特别是在C53和GS5间只发生1次重组，在C62和 GS5间只存在2次重组，而且在C53和C62之间还存在ClO和C23两个标记与GS5共分离 (图4)。因此，GS5最终被定位于C53和C62间，该区间对应于Nipponbare和93-11的基因 组序列上的约8. Okb的物理范围(图4)。在C53和C62间(由申请人自己设计，参见表4) 所界定的8. Ο-kb范围内找到一条全长cDNA，编号为AK106800，来自于日本晴的小花组织， 本发明克隆的GS5基因的cDNA序列全长1449bp，与8. Ο-kb范围内的0. 3kb至6. 9kb区段 完全匹配，因此该cDNA是GS5的唯一可靠候选基因。实施例3 :GS5的转基因互补试验1 GS5转基因技术路线Real-Time PCR表达谱分析发现，该基因全生育期在各个组织表达，并且在颖壳胚 乳中宽粒品种(珍汕97B)比小粒(H94)的表达量高(图5)，预测表达量起重要作用，于是 根据预测的候选基因全长cDNA序列，设计一对带有限制性核酸内切酶BamHI和PstI接头 的RT-PCR特异引物(表4)扩增H94的cDNA片段，连接到TA克隆Promega T载体上，挑选 出含有候选基因的无突变的正确克隆，利用限制性核酸内切酶BamHI and PstI酶切阳性 克隆，进行亚克隆，再连接到双元超表达载体PCAMBIA1301S) (pCAMBIA1301多克隆位点旁 加一 35S强启动子)上；另外，用同样的方法将珍汕97B启动子融合H94编码区的转基因 (ZpHc)连接到双元超表达载体pCAMBIA1301(图6)上。采用转基因的方法，将得到的正确 克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过诱导、继 代、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因的水稻小 植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见 Efficient transformation of rice, Oryza sativaL，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA,1994, PlantJournal 6 271-282) 基础上进行优化。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧节青霉素)； KT (Kinetin,激动素) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosringone, ZilitT#Sll ) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max (N6 大量元素 成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量 元素成分溶液)钼酸钠(Na2Mo04· 2H20)硫酸铜(CuSO4· 5H20)氯化钴(CoCl2· 6H20)
0. 025 克 0. 0025 克 0. 0025 克将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。7)2，4_D贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取2，4_D 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶 解完全后定容至100毫升，于室温下保存。8) 6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取6-BA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶 解完全后定容至100毫升，室温保存。9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取NAA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解 完全后定容至100毫升，4°c避光保存。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制秤取IAA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解 完全后定容至100毫升，4°c避光保存。11)葡萄糖贮存液(0. 5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制秤取AS 0. 392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1. 5毫升离心管内，_20°C保存13) IN氢氧化钾贮存液配制秤取氢氧化钾5. 6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基N6max母液(取已经制备好的IOX浓缩液，下同)100毫升N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升2，4_D贮存液(取上述制备好的)2. 5毫升脯氨酸(Proline)0. 3 克CH0.6 克蔗糖(Sucrose)30 克Phytagel(分开加，需加热溶解，下同)3克加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分 装到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121°C下灭菌15分钟， 下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。2)继代培养基N6max 母液(IOX)100 毫升
N6mix 母液(100X)10毫升
Fe2+EDTA 贮存液(100X)10 1■升
维生素贮存液(100X)10 _升
2，4-D贮存液2. 0 _升
脯氨酸0· 5克
CH0.6克
蔗糖30克
Phytagel3克0128] 加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分 装到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
3)预培养基(粳稻可以不做这-
涉) 12. 5毫升 1. 25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 75毫升
CH0. 15 克
蔗糖5克
琼脂粉(Agar)1. 75克
加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口，按上述方法灭菌。 使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒
N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2，4-D贮存液
入培养皿中(25毫升/皿)。
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
4)悬浮培养基 N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X)
5毫升 0.5毫升 0.5毫升 1毫升 0. 2毫升 0. 08 克 2克
0148] 加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5. 4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按 上述方法灭菌。
Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X)
0145]2，4_D 贮存液
0146]CH
0147]蔗糖
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。 5)共培养基
N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2，4-D贮存液
12. 5毫升 1. 25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 75毫升
110156]CH0.2 克
0157]蔗糖5克
0158]琼脂粉1.75克
0159]加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口，按上述方法灭菌。
0160]使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒
入培养皿中(25毫升/每皿)。
6)筛选培养基
N6fflax 母液(IOX)25毫升
N6mix 母液(100X)2. 5毫升
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2. 5毫升
维生素贮存液(100X)2. 5毫升
2，4-D贮存液0. 625毫升
CH0. 15 克
蔗糖7. 5克
琼脂粉1. 75 克
加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6. 0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (10克CN/36毫升水)分装倒入培养皿中(25毫升,/皿)。(注第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。
7)预分化培养基(粳稻可以不做这一步)
N6fflax 母液(IOX)25毫升
N6mix 母液(100X)2. 5毫升
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2. 5毫升
维生素贮存液(100X)2. 5毫升
6-BA贮存液0.5毫升
KT贮存液0.5毫升
NAA贮存液50微升
IAA贮存液50微升
CH0. 15 克
蔗糖7. 5克
琼脂粉1. 75 克
加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
8)分化培养基
N6fflax 母液(IOX)100毫升
N6mix 母液(100X)10毫升
Fe2+EDTA 贮存液(100X)10毫升
维生素贮存液(100X)10毫升
6-BA 贮存液KT贮存液NAA贮存液IAA贮存液CH
1克 30克 3克
0.2毫升 0.2毫升
2毫升 2毫升蔗糖Phytagel加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到6. 0。煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到100毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口， 按上述方法灭菌。9)生根培养基加蒸馏水至900毫升，用IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述 方法灭菌。(4)农杆菌介导的遗传转化步骤3. 1愈伤诱导1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯 化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；2)用灭菌水洗种子4-5次；3)将8-10粒种子放在诱导培养基上；4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4-5周，温度26士 1°C。3. 2愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温 度 25 士 1°C。3. 3 预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度 26 士 1°C。3. 4农杆菌培养1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分 子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上划线预培养农杆菌 EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两大，温度28°C ；2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。3. 5农杆菌侵染1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；MSmax 母液(IOX)MSmix 母液(100X)Fe2+EDTA 贮存液(100X)维生素贮存液(100X)蔗糖Phytagel
50毫升 5毫升 5毫升 5毫升 20克 3克
2)调节农杆菌的悬浮液至0D6000. 8-1. 0 ；3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20 "C。3. 6愈伤洗涤和选择培养1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中摇30分钟；3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周至长出好的抗性愈伤。3. 7 分化1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，每瓶平均分布三个独立的愈伤，光照 下培养5周-6周至长出大的苗子，温度26°C。3. 8生根与炼苗1)剪掉分化时产生的老根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周至长出大的苗子后去掉封口膜 加部分自来水炼苗一周再移栽，温度26°C。3. 9 移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保 持水分湿润，等长势很壮再移栽至大田。本发明共获得独立转基因Over-expression T0代水稻植株37株，包括18株阳性 单株和19株阴性单株。所获得的T1代水稻植株以Z3-22家系为例；珍汕97启动子融合 H94编码区(ZpHc)独立转基因Ttl代水稻植株28株，包括18株阳性单株和10株阴性单株。 两种转基因水稻阳性和阴性植株的粒宽和粒重(图7)有差异显著(P < 0. 001)。根据转 基因Ttl代阳性超表达单株均表现出更宽的粒形(图6)，并且其T1代共分离检测发现，粒宽 和表达量正相关(表2)，证明了该唯一的候选基因就是GS5 QTL.另外，珍汕97B启动子融 合H94编码区的转基因和上述结果一致，均能增加粒宽和粒重这一表型(图7)，互补成功， 该QTL基因被成功克隆，并且说明启动子区是GS5遗传变异的原因。由于该基因超标达使 得种子变大，说明GS5是一个粒形和粒重的正调控因子，这和其控制粒形的基因(GS3，GW2， qSW5)不同，它们多是负调控种子大小(Fan 等，2006，Theor. Appl. Genet. 112 :1164_1171 ； Takano-Kai ^,2009, Genetics 182 1323-34 ；Song φ,2007, Nature Genetics 39 623-630 ；Shomura 等，2008，Nature Genetics 40 1023-1028 ；Weng 等，2008，CellRes. 18 1199-209)。同时也证明了这个基因可以通过遗传转化来改良水稻品种。2 GS5功能预测根据 InterProScan(http//www. ebi. ac. uk/InterProScan/)对蛋白质结构进行 预测，GS5基因(H94)编码的蛋白质由480个氨基酸组成，包含一个大的保守的PF00450 结构域。利用BLASTp对GS5基因编码的由480个氨基酸组成的蛋白质结构进行搜索，发 现该基因编码一丝氨酸羧肽酶，属于SlO蛋白家族，，以前的研究表明该酶家族参与种子的 萌发和发育、植株的生长与发育、植株次级代谢以及植物的生物和非生物胁迫反应(Degan等，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :8209_8213 ；Washio 等，1994，Plant Physiol. 105 1275-1280 ；Li 等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,5916-5921 ；Shirley 等，2003， J. Biol. Chem. 278 19870-19877 ；Mehta 等，1996，Plant Physiol. 110 ；883-892)。实施例5 比较测序确定GS5等位基因间的自然变异1序列测定两个大粒品种(珍汕97B和特青)和两个小粒品种(明恢63和H94)进行目标 区段的测序。利用10对PCR产物相互部分重叠的引物(表3)，采用高保真度的LA-Taq和 rTag (购自日本TakaRa公司)从这些品种的基因组中进行PCR扩增，然后按照美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)进行PCR测序。使用Sequencher 4. 5软件(美 国Gene Codes Corporation)拼接序列。该两个等位基因的DNA序列如SEQ ID N0:1(珍 汕 97B)和 SEQ ID NO :3(H94)所示。表2GS5转基因T1代共分离检测分析 2发生自然变异的序列比较目标区段间的序列比较分析在两个大粒品种(珍汕97B和特青)和两个小粒品种 (明恢63和H94)间进行(图8)，发现在3. 9kb的启动子和cDNA范围内大小粒品种间存在 20个共同的SNP和InDel差异，其中18个突变位于启动子区，4个突变位于编码区的第1、 第2和第9个外显子，导致了 5个氨基酸变异(图8)，还有4个突变位于内含子区。由于超 表达窄粒的等位基因可以使宽粒变得更宽，所以编码区的5个氨基酸替换不是等位基因变 异的原因，ZcHp转化片段进而说明了启动子区的变异是导致表达量变化的原因，进而导致 粒宽和千粒重的变异。表3用于本发明比较测序的引物 表4用于本发明图位克隆和基因功能分析的引物
权利要求
一种控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.如权利要求1所述的基因GS5，它的编码序列如序列表SEQID NO 1中第2001-3449 位对应的核苷酸所示。
3.如权利要求1所述的基因GS5的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO 3 所示。
4.如权利要求3所述的等位基因，它的编码序列如序列表SEQID NO :3中第2004-3446 位对应的核苷酸所示。
5.适用于权利要求1所述基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:1中 1-1834位对应的核苷酸所示。
6.适用于权利要求3所述基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:3中 1-1837位对应的核苷酸所示。
7.权利要求1或2所述的基因在作物遗传改良中的应用。
8.权利要求3或4所述的基因在作物遗传改良中的应用。
9.权利要求5所述的启动子在作物遗传改良中的应用。
10.权利要求6所述的启动子在作物遗传改良中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。公开了分离克隆的控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5，以及它的等位基因的DNA序列，所述序列如SEQ ID NO1(珍汕97B)和SEQ ID NO3(H94)所示，包含10个外显子。它们的氨基酸序列如SEQ ID NO2和SEQ IDNO4所示。利用水稻两个大粒品种和两个小粒品种比较测序，发现在约6.1kb范围内大、小粒品种间存在22个共同的碱基差异，其中18个突变位于启动子区，4个突变位于编码区，导致5个氨基酸变化。利用转基因技术获得了转GS5基因的水稻植株，转基因植株都表现出比对照粒宽和粒重显著提高。这些性状变化与珍汕97的GS5近等基因系两基因型的表现非常吻合。本发明还公开了近等基因系选育、基因克隆和转基因的方法即应用。
文档编号A01H5/00GK101880671SQ201010188458
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者何予卿, 张启发, 李一博, 范楚川, 邢永忠 申请人:华中农业大学