专利名称：一种细胞骨架结合蛋白wdr1基因敲除模型的建立及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因技术领域，更具体地涉及一种细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型的建立和用途。
背景技术：
WDRl基因编码的蛋白是WD重复蛋白，属于WD40重复结构域蛋白家族。WD40重复序列是由大约30-40个氨基酸组成的结构基序，包含几个保守的的氨基酸残基，主要是包括位于碳末端的色氨酸和天冬氨酸残基(W-D)。WD重复蛋白是包含4-16个WD重复序列的一类蛋白质，是存在于所有真核生物中一个蛋白家族。这一家族内成员的基本的功能是作为蛋白之间连接的脚手架，在多蛋白复合体的组装过程中发挥协调作用。研究表明WDRl蛋白能够和切丝蛋白/肌动蛋白复合体结合；切丝蛋白是真核生物中肌动蛋白细胞骨架的重要调节器，它在细胞运动，极化，内吞作用，形态发生等许多过程中起调节细胞骨架反应的作用；另一方面，WDRl还可以促进微丝的切割，解体，促使已存在的微丝的解体和新的微丝的产生，从而促进微丝的循环。此外，Wdrl能够与切丝蛋白/肌动蛋白复合体结合，进而调节切丝蛋白的活性。研究表明，WDRl能增强切丝蛋白切割肌动蛋白的活性，在酵母，爪蟾， 果蝇，线虫，拟南芥，黏菌等物种中突变了 Aipl，将会导致细胞骨架的行为中断。因此Wdrl/ Aipl对于维持细胞形态，细胞运动，胞质环流，细胞分裂，细胞的胞吞作用和胞吐作用等过程中具有很重要生物学意义。至今为止，WDRl在低等生物中的功能已经被人们广泛揭示，然而这一重要的活性蛋白质再高等哺乳动物中到底起着怎样的作用，以及它是否与某种疾病相互关联等等一些问题仍然没有被解决。因此，本领域迫切需要提供一种WDRl基因敲除的高等哺乳动物模型，它可以为深入了解细胞骨架结合蛋白WDRl的生物学和病理学功能提供有效地研究途径和方法，并由此提供其应用。
发明内容
本发明旨在提供一种细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型。本发明的另一个目的是提供上述细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型的用途。在本发明的第一方面，提供了一种产生细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型的方法，它包括步骤a)提供一种线性化的基因打靶载体构建物，该构建物从5’到3’依次含有WDRl打靶左臂、正选择基因、自杀负筛选基因、WDRl打靶右臂；b)通过体外转染胚胎干细胞(ES细胞)、筛选与打靶载体发生同源重组的阳性ES 细胞克隆，经显微注射技术导入非人哺乳动物囊胚中；c)将步骤b得到的囊胚植入假孕的非人哺乳动物的子宫；
d)产生细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型。在另一优选例中，还包括步骤e)对步骤d获得的WDRl基因敲除动物进行鉴定。在另一优选例中，还包括步骤f)使获得的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物进行交配建系，获得子代。在另一优选例中，所述的正选择基因是Neo、hph、或gpt。在另一优选例中，所述的自杀负筛选基因是HSV-tk、胞嘧啶脱氨酶基因、或 VIV-tko在另一优选例中，所述的非人哺乳动物模型是小鼠、大鼠、兔或猴。在另一优选例中，所述的转基因构建物基因剔除外显子。在另一优选例中，所述的转基因构建物不含启动子。在另一优选例中，所产生的细胞骨架结合蛋白WDRl编码第77位至606位氨基酸缺失的非人哺乳动物在本发明的第二方面，提供了一种用上述方法产生的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型。在本发明的第三方面，提供了一种用上述方法产生的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型的用途，所述的动物模型可用于筛选预防或者治疗心脏肥大的药物。在本发明的第四方面，提供了一种细胞骨架结合蛋白WDRl的用途，它可用于制备治疗心脏肥大的药物。在另一优选例中，可以将细胞骨架结合蛋白WDRl及其所在的上、下游信号转导通路作为治疗心脏肥大的药物干预靶点。据此，本发明提供了一种细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除模型，有效地揭示了其在高等哺乳动物中的生物学功能，并由此提供了细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型及细胞骨架结合蛋白WDRl的用途。
图1是细胞骨架结合蛋白WDRl打靶载体构建策略示意2显示了细胞骨架结合蛋WDRl基因敲除ES细胞基因型Southern (DNA印记杂交)鉴定；其中G9、C9以及B6为+/_基因型，表示该细胞系为基因敲除杂合子。图3显示了初生WDRl敲除小鼠心脏外观情况以及石蜡切片苏木精-伊红染色结果。
其中左侧为野生型对照小鼠，右侧为WDRl基因缺陷型小鼠。 具体实施方案发明人经过广发而深入的研究，建立了细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除小鼠模型，通过对该模型的表型分析，意外的发现，细胞骨架结合蛋白WDRl敲除小鼠全部在出生后两周左右时死亡。此外敲除小鼠的心脏明显比野生对照组鼠的大，心脏重量/身体重量也比野生对照组大。这些实验结果有效地显示了细胞骨架结合蛋白WDRl的生物学功能。细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型的建立本发明通过本领域成熟的基因打靶技术建立了细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型，可用于本发明的负筛选自杀基因没有特别的限制，可以选用本领域常规使用的各种自杀基因。代表性的例子包括(但并不限于)hsv-tk、胞嘧啶脱氨酶(CD)、VIV-tk寸。可用于本发明的正选择基因没有特别限制，可以选用本领域常规使用的各种正选择基因。代表性的例子包括(但并不限于):Ne0、hph、gpt等。本发明利用Cre重组酶将正选择基因Neo最终从基因组中去除，避免其对小鼠表型的可能影响。细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型本发明所建立的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型中所敲除的可以使其基因组结构中的任一段外显子，优选敲除编码细胞骨架结合蛋白WDRl第77位至606位氨基酸的外显子。本发明的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除基因长度可以使1-201Λ，优选3-61Λ， 更优选3-41Λ。细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物模型的用途本发明提供的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物的表型分析显示了存活率低、心脏肥大等状况。本发明的一个优选例中，利用该模型筛选预防或者治疗心脏肥大的化合物，方法如下1)在测试组中，给细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物服用待筛选的候选物，并检测心脏肥大情况；2)若步骤(1)测试组中心脏肥大程度的改善在统计学上高于(更优选明显高于) 对照组(未服用候选物组)中心脏肥大情况，就表明该候选物是可抑制心脏肥大的化合物。本发明揭示了细胞骨架结合蛋白WDRl的生物学功能，在本发明的一个优选例中提供了一种制备预防或者治疗心脏肥大的药物的方法，就是加入治疗有效量的细胞骨架结合蛋白WDRl及药学上可接受的载体。可以制成各种剂型，包括(但不限于)片剂、胶囊、 注射剂等。本发明的主要优点在于1.首次建立了细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除动物；2.首次运用该模型揭示了细胞骨架结合蛋白WDRl在非人哺乳动物中的生物学功能，可以将细胞骨架结合蛋白及其上下游生物传导通路作为药物治疗心脏肥大的作用靶点。
3.运用该模型有效地进行针对性的药物筛选。下面将结合具体是实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和分数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范只用。实施例1建立细胞骨架结合蛋白基因敲除模型1.通过构建基因打靶载体，见图1 ；2.将上述载体转染胚胎肝细胞(EQ，通过Southern印记杂交筛选同源重组的ES 细胞克隆，见图2;3.将步骤( 获得的同源重组的ES细胞进行囊胚注射后、植入假孕小鼠子宫，待子鼠出生后得到嵌合小鼠；4.嵌合鼠进一步交配后得到细胞骨架结合蛋白WDRl的基因敲除小鼠。实施例2细胞骨架结合蛋白基因敲除小鼠的表型分析实施例1获得的WDRl基因缺陷小鼠出生时无明显异常，在出生后第14天时全部死亡；与野生型对照小鼠相比，WDRl基因敲除小鼠的心脏重量/身体重量比值显著增大；组织切片染色分析结果显示，WDRl基因敲除小鼠的心脏比野生型对照小鼠的心脏明显肥大， 见图3以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何让人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
1.一种产生细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型的方法，其特征在于， 它包括步骤a.提供一线性化的基因打靶载体构建物，该构建物从5’至3’依次含有WDRl打靶左臂、正选择基因、自杀负筛选基因、WDRl打靶右臂；b.通过体外转染胚胎干细胞(ES细胞)、筛选与打靶载体发生同源重组的阳性ES细胞克隆，经显微注射技术导入非人哺乳动物囊胚中；c.将囊胚植入假孕的非人哺乳动物子宫内；d.产生细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正选择基因是Neo、hph、或者gpt。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的自杀负筛选基因是HSV-tk、细胞嘧啶脱氨酶基因、或者Viv-tk。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人动物是小鼠、大鼠、兔或猴。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转基因构建物基因剔除外显子。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，产生的细胞骨架结合蛋白WDRl编码第77位至606位氨基酸缺失的非人哺乳动物。
7.一种用权利要求1-5中任一项所述的方法产生的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型。
8.一种用权利要求1-5中任一项所述的方法产生的细胞骨架结合蛋白WDRl基因敲除非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，所述的动物模型用于筛选预防或者治疗心脏肥大的药物。
9.一种细胞骨架结合蛋白WDRl的用途，其特征在于，用于制备预防或者治疗心脏肥大的药物。
全文摘要
本发明公开了一种细胞骨架结合蛋白WDR1基因敲除非人哺乳动物模型的制备方法及其应用。本发明还公开了利用所述的细胞骨架结合蛋白WDR1基因敲除非人哺乳动物模型筛选预防或者治疗心脏肥大的化合物的方法，以及将WDR1及其所在上、下游生物信号转导通路作为药物干预靶点治疗心脏肥大的用途。
文档编号A01K67/027GK102477444SQ201010555040
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者万萍, 张力军, 袁白银, 陈炯 申请人:南京大学