专利名称：：细胞角蛋白18化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析及生物医学领域的一种细胞角蛋白18(CyK-18)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：在繁多的肿瘤标志物中有一类比较特殊的生物大分子细胞骨架蛋白。这一细胞成分曾一度被认为是一种细胞的支架结构，性质稳定，没有什么生物功能。但是，最近十几年的研究已使我们不得不重新认识这一重要的细胞成分:这个庞大的家族不仅支撑维持着细胞和组织的正常形态，而且还参与细胞组织的分化和发育，参与细胞和细胞、细胞和细胞外基质的相互作用(包括信号的传导)以及在对外界刺激产生反应，保护细胞免受机械，药物等的损害中发挥作用。肿瘤细胞在转化过程中，分化状态，细胞形态等多方面发生改变，也表现在细胞骨架成分的表达模式，分布位置等方面的改变。因而这一成分已广泛应用于肿瘤诊断，有的甚至可能用于肿瘤的治疗。临床上，这一细胞成分中细胞角蛋白(cytokeartins，cKs)应用最广泛:免疫组化上用于肿瘤细胞组织类型、来源、分化程度的判定；血清学上用于肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤的早期诊断，良恶性区分，临床分期，治疗效果监测，微小转移的早期发现和病人的随访。细胞角蛋白是细胞骨架成分一中间纤维丝家族中最复杂的一组蛋白，大约包括20个成员，分子量在40—60KDa之间，根据它们的等电点不同可以分为两型:I型(碱性角蛋白，CK1一CK8，PI:6.1—7.8)，ll型(酸性角蛋白，CK9一CK20，PI:4.9—5.7)。CYFRA21-1、TPAcyk、TPS是目前临床上应用较好的针对细胞角蛋白成分的免疫分析方法，它们分别针对细胞角蛋白19片段;细胸角蛋白8、18、19:细胞角蛋白18M3表位。CYFRA21-1应用于肺癌，尤其是鳞癌，它对肺癌总检出率为61%,对小细胞肺癌、鳞癌、腺癌的平均检出率分别为52%、79%、54%,与NSE联合应用可以作为小细胞肺癌和非小细肺癌鉴别诊断的依据，可以用于肺癌放化疗后的病情监测，复发的早期发现及存活时间预测，是目前非小细胞肺癌最有效的肿瘤标志物。TPS是由细胞角蛋白18抗体所识别的组织抗原的可溶性片段，上皮来源的恶性肿瘤和转移瘤有较高表达，尤其在肿瘤细胞增值活跃期间TPS高表达并大量入血，可以更好地体现肿瘤的生物学行为。郑有为等报道，肺癌患者血清中TPS阳性率为55.1%,而在支气管肺泡灌洗液中阳性率为100%,同时指出作为肺癌的标志物TPS比CEA更敏感。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附方法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，目前该方法已经得到广泛的应用。我们研制的细胞角蛋白18测定试剂盒(化学发光法)釆用的是双抗体夹心一步法反应模式，采用细胞角蛋白18单克隆抗体制备固相，特异性的单克隆抗体纯度高、无传染性，非特异结合反应小，不需特殊实验室就可以大批量生产。本发明的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。
发明内容本发明的目的是提供一种细胞角蛋白18(CyK-18)化学发光免疫分析定量测定试剂盒。本发明的另一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本发明的试剂盒包括1)酶标记的细胞角蛋白18的单克隆抗体；2)包被有细胞角蛋白18的单克隆抗体的载体；3)细胞角蛋白18校准品；以及4)上述酶所作用的化学发光底物。进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)用酶标记细胞角蛋白18的单克隆抗体；2)以细胞角蛋白18的单克隆抗体包被载体；3)以细胞角蛋白18纯品配制细胞角蛋白18校准品；4)分装上述细胞角蛋白18校准品、酶标记的细胞角蛋白18的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；以及5)组装为成品。在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述栽体可以为固相载体、优选微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。所述酶可以为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述化学发光底物可以为，鲁米诺或异鲁米诺，1，2-二氧乙烷类衍生物、其中包括(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基_4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。在根据本发明的方法中，其中所述包被栽体的步骤2)包括以下过程用1000mL包含7.30g的柠檬酸三钠和4.45g的柠檬酸的包被液，pH值为4.5~4.8的包被液与CyK-18的单克隆抗体混合后负载于固相载体上，生理盐水洗涤；用磷酸盐緩沖液进行封闭。所述封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2gNaH2PO4.2H20,2.9gNaH2P04.12H20、10gBSA、和lmLProclin300,pH值为7.0-7.5。具体的上述试剂盒可以包括CyK-18校准品、抗体包被板、酶标记物与化学发光底物液、20倍浓缩洗涤液等。其中，所述CyK-18校准品为标准级，纯度不低于卯％、抗体包被板为48或96孔的微孔板条、酶标记CyK-18单抗为偶联碱性磷酸酶或辣才艮过氧化物酶、化学发光底物液为AMPPD或鲁米诺、浓缩洗涤液为Tris-HCl。本发明"细胞角蛋白18化学发光免疫分析定量测定试剂盒"可以准确地定量检测出病人CyK-18的含量，可以根据CyK-18含量，对消化道、乳腺、泌尿生殖道、呼吸道等上皮来源的肿瘤的病情进行监测、疗效评价、复发的早期发现和预后的判断有重要意义。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。该CyK-18测定试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到酶联免疫分析法。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的CyK-18单抗与栽体上包被的CyK-18单抗和被测样品的CyK-18抗原形成"双抗体夹心"结构，因此本发明采用的"双抗体夹心一步法"反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为消化道、乳腺、泌尿生殖道、呼吸道等上皮来源的肿瘤的病情进行监测、疗效评价、复发的早期发现和预后的判断提供更为特异、快速、可靠的依据。在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、酶的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被緩冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心一步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。图l试剂盒校准曲线图，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，其中线性方程为Log(Y)=3.7578+1,3117Log(X)，r=0.9972。具体实施例方式实施例1Cyk-18碱性磷酸酶标记单抗的制备CyK-18单抗用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，-2(TC以下保存。实施例2Cyk-18辣根过氧化物酶标记单抗的制备用过砩酸钠氧化法标记Cyk-18单克隆抗体。标记过程如下称取5mgHRP溶解于lml双蒸水中。于上液中加入0.2ml新配的0.lMNal04溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对lmMpH4.4的醋酸钠緩冲液透析，4。C过夜。加20^10.2MpH9.5碳酸盐緩冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg抗体在lml0.01M碳酸盐緩沖液中，室温避光轻轻搅拌2小时。力。0.lml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4'C2小时。将上述液装入透析袋中，对O.15MpH7.4PBS透析，4'C过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4。C1小时。3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15MpH7.4的PB緩冲盐水透析，去除铵离子后，10，000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等量优质丙三醇，分装后，-20。C保存。实施例3制备本发明的CyK-18定量测定试剂盒一、碱性磷酸酶标抗体制备酶标单抗稀释液配制称量12.12g的Tris，5gBSA和lmLProclin300，将上述试剂称量好^L入洁净容器中，加双蒸水至1L,溶解混匀。用酶标单抗稀释液稀释酶标抗体不同比例，采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度大于1:4000。二、CyK-l8校准品的制备用CyK-18纯品配制，分装0、25、50、100、200、400U/L共6瓶。三、固相包被板的制备(1)包被称量7.30g的柠檬酸三钠和4.45g的柠檬酸于1L的洁净容器中，加入1L的双蒸水溶解混匀后，PH为4.8,加入适量CyK-18单抗混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔130pL,4°C24h。(2)洗涤用生理盐水洗三次。(3)封闭称量0.2g的NaH2P04■2H20，2.9g的NaH2P04.12H20、lOgBSA、和lmLProclin300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，测定pH值为7.0。每孔分别加入封闭液300fxL,室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿千燥24小时。立即进行封袋。贴签后置2~8'C保存。四、化学发光底物液称量24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHC1、200mL3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷和lmLProclin300,将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L,溶解混匀。五、2Q倍洗涤液称量24gTris,160gNaCl，4gKC1和15mlHC1于洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混勻，调整PH至7,4六、半成品及成品纟且成上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成细胞角蛋白18定量测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。实施例4制备本发明的CyK-18定量测定试剂盒除以辣根过氧化物酶标记CyK-18单抗作为酶标抗体，以鲁米诺为发光底物外，所述的化学发光底物包括A液和B液，其中，基于lOOOmL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.0-10.0;基于lOOOmL所述化学发光底物B液，包括0J29g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04.12H20、8.74gNaH2P04'2H20,其pH值为7.0—7.6。A液是在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成O.IMpH为8.5的Tris-HCl緩冲液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对石爽苯酚。B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和拧檬酸，配制成0.1MpH值为4.6的柠檬酸緩沖液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。其余均以与实施例l相同的方法制备CyK-18定量测定试剂盒。实施例5~6制备本发明的CyK-18定量测定试剂盒除分别以塑料珠，塑料管作为载体、封闭液的pH值为7.5外，其余均以与实施例1和4相同的方法制备CyK-18定量测定试剂盒。实施例7制备本发明的CyK-18定量测定试剂盒除以磁性颗粒作为载体，用戊二醛将CyK-18的包被单抗与磁颗粒偶联外，其余均以与实施例1和4相同的方法制备CyK-18定量测定定剂盒。实施例8本发明的试剂盒的使用方法以上实施例1制备的CyK-18定量测定试剂盒的具体操作如下表1:1)自4'C冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。2)取出包被板条，插入板架上。表lCyk-18加样测定程序表单位juL<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的CyK-18的浓度。实施例9本发明的试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，(1)试剂盒灵敏度实验以S0校准品进行10孔重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度，其灵敏度为10.6U/L。(2)试剂盒特异性实验与其类似物作交叉反应实验，交叉反应率<0.01%。(3)试剂盒精密性实验批内变异取低、中、高三份质控血清样品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值)和标准差(s)。按公式CV-s/7xioo。/。计算变异系数，批内变异系数CV分别为6.3%，4.9%，4.1%。批间变异选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数(CV%),批间变异CV在7.21~9.5%之间。(4)试剂盒准确性实验将高浓度的校准品原料，用正常人血清稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5孔平行实验，分别计算回收率在91-108°/。范围内。(5)试剂盒稳定性实验试剂盒保存温度为2-8。C，经过15个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行37。C7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。说明"细胞角蛋白18化学发光免疫分析定量测定试剂盒"的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。权利要求1、一种细胞角蛋白18(CyK-18)定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标记的CyK-18的单克隆抗体；包被有CyK-18的单克隆抗体的载体；CyK-18校准品和洗涤液；以及上述酶所作用的化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述栽体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)酶标记CyK-18的单克隆抗体；2)以CyK-18的单克隆抗体包被载体；3)以CyK-18纯品配制CyK-18校准品；4)分装上述CyK-18校准品、酶标记的CyK-18的单克隆抗体、和该酶所作用的化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺和洗涤液；以及5)组装为成品。6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述包被载体的步骤2)包括以下过程用0.046MpH值为4.5~4.8的柠檬酸包被液，与CyK-18的单克隆抗体混合后负载于固相载体上，生理盐水洗涤；用pH值为7.0-7.5的磷酸盐进行封闭。7、如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物的配制方法为24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金刚烷)-4墨曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、lmLProclin300、lOOOmL双蒸水。或者，所述的化学发光底物包括A液和B液，其中，基于lOOOmL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.0-10.0;基于lOOOmL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P042H20,其pH值为7.0—7.6。全文摘要本发明公开了一种涉及免疫分析及生物医学领域的细胞角蛋白18化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒包括细胞角蛋白18的单克隆抗体酶标记物；细胞角蛋白18的单克隆抗体包被载体和细胞角蛋白18校准品。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下过程以细胞角蛋白18纯品配制校准品；以细胞角蛋白18的单克隆抗体包被载体。本发明的试剂盒能同时快速检测大批样品；主要试剂均以工作液的形式提供，具有简便快速、灵敏度高、准确等优点。在临床诊断中，具有很大的应用价值。文档编号G01N21/76GK101545911SQ200810102669公开日2009年9月30日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者于尚永,唐宝军,宋胜利,应希堂,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司