高尔基体蛋白gp73定量测定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒，包括磁分离试剂的制备、酶反应物的制备、反应增强剂的配制、校准品稀释液的配制、校准品和质控品的配制、清洗浓缩液的配制和底物溶液的配制七个步骤。本实用新型高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式，对肝癌的早期诊断具有重要意义。
【专利说明】高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒，用于体外定量测定样品血清中的高尔基体蛋白GP73含量。
【背景技术】
[0002]肝癌发病率在全世界是位列第四位、中国位列第二的恶性肿瘤，且在世界范围内呈逐年上升趋势，现总发病率已超过56万。肝癌发病之初较为隐匿，临床难以检出，临床诊断检出一般多为晚期，治疗效果差，如若早期发现肝癌并且及时治疗可以提高患者的5年存活率，因此肝癌的早期发现具有重要的临床意义。
[0003]目前肝癌的检测手段包括肝超声影像分析和血清学标志物检测，其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白(AFP)，但是AFP在早期肝癌诊断中灵敏度不高，只有50%?60%的肝癌患者AFP呈阳性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此，临床需要一种更好地用于肝癌监测的标志物。
[0004]近年来，随着基因组学、蛋白质组学、肿瘤免疫等相关研究的飞速发展，研究者筛选出一些潜在的新的肿瘤标志物，而高尔基体不但参与蛋白加工，还参与细胞分化及细胞间信号的转导，并在细胞凋亡中扮演重要角色，其功能障碍可能与肿瘤的发生密切相关，其中，高尔基体糖蛋白73 (GP73)是最值得期待的血清标志物之一。已经有多个研究组验证了 GP73是一种新的肝癌标志物。在以往的研究中多使用免疫印迹方法，这种方法不仅灵敏度低、特异性弱，在操作上也比较复杂，无法在临床上普及应用。经专利检索，GP73的检测方法有多种包括ELISA、基因诊断等多种形式，但尚未见有将板式磁颗粒化学发光免疫分析技术应用到高尔基体蛋白GP73的检测中。
【发明内容】
[0005]本实用新型的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、操作简单的高尔基体蛋白GP73板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒。
[0006]本实用新型的目的是这样实现的:
[0007]—种高尔基体蛋白GP73板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有微孔板和位于盒体底部的支撑板，其中微孔板由48或96个微孔组成，支撑板上开有多个孔，所述孔内共放置有八个试剂瓶，所述八个试剂瓶内分别含有磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液，其中磁分离试剂含有高尔基体蛋白GP73单克隆抗体包被的磁颗粒。
[0008]与现有技术相比，本实用新型的有益效果是:
[0009]本实用新型高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式，对肝癌的早期诊断具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】[0010]图1为本实用新型闻尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒的结构不意图。
[0011]图2为图1去掉盒盖和微孔板后的俯视图。
[0012]图3为图1中微孔板的结构示意图。
[0013]其中:
[0014]盒体I
[0015]盒盖2
[0016]支撑板3
[0017]孔4
[0018]试剂瓶5
[0019]微孔板6
[0020]微孔7。
【具体实施方式】
[0021]参见图1-图3，本实用新型高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒，包括盒体I和盒体上方的盒盖2，所述盒体I内设有微孔板6和位于盒体I底部的由泡沫塑料制成的支撑板3，其中微孔板6由48或96个微孔7组成，支撑板3上开有多个孔4，所述孔4内共放置有八个试剂瓶5，所述八个试剂瓶5内分别含有磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液，其中磁分离试剂含有高尔基体蛋白GP73单克隆抗体包被的磁颗粒。
[0022]制备方法
[0023]步骤一、磁分离试剂的制备
[0024]一、磁珠缓冲液配制
[0025]1、称取 TRIS 4.58g和 NaC16.81g 于 IL 容器中，然后称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml容器中加适量水使其完全溶解后，再倒入上述IL容器中；
[0026]2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；
[0027]3、调节PH计测量其PH值，控制PH在7.95-8.05之间；
[0028]4、称取BSA 3g倒入上述IL容器中；
[0029]5、最后IL容器定容至1000ml,用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2_8°C冷库贮存。
[0030]二、磁分离试剂的制备
[0031]1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ulDMS0中，取2mg抗GP73单克隆抗体溶于PH 9.5的0.lmol/L的PB缓冲液中至总体积为Iml ；
[0032]2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述GP73单克隆抗体溶液中，置室温90min ；
[0033]3、然后将抗体溶液加入到Centricon-1O浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml ；
[0034]4、取0.5ml磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；[0035]5、每次加入1.5ml PH9.5的0.lmol/L的PB缓冲液，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；
[0036]6、加入 0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分钟；
[0037]7、每次加入1.5ml PH7.2的0.lmol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30
秒，上架，去上清，重复操作3次；
[0038]8、用IOOml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05%的GP73磁分离试剂；
[0039]磁珠保存液配方为0.1% 854，0.05%吐温-20，0.02%似吧，20%乙醇，41:保存。
[0040]9、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得本实用新型试剂盒中磁分离试剂。
[0041]步骤二、酶反应物的制备
[0042]一、酶反应物稀释液的配制
[0043]1、取Tris 4.846g、HCl 2847 μ I于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解；
[0044]2、调 PH,控制 PH 在 7.35-7.45 ；
[0045]3、称取BSA 4g倒入上述烧杯中；
[0046]4、最后烧杯定容至400ml,用0.2um滤器过滤即得。
[0047]二、辣根过氧化物酶(HRP)与GP73抗原的偶联
[0048]1、取GP73-3-cmo-BSA抗原Img放置于Iml玻璃管中；
[0049]2、取200ul DMSO溶解抗原使抗原的终浓度到达5mg/ml，然后充分混匀；
[0050]3、按照Imol抗原加入IOmol的辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比例加辛二酸二琥珀酰亚胺酯到上述2溶液中，37°C恒温箱中反应1.5小时；
[0051]4、按照3mol抗原加入Imol的(HRP)的摩尔比往上述3的溶液中添加(HRP)，然后加入Iml的PH为7.4浓度为0.1M的PB缓冲液，置于37度恒温箱中反应3小时；
[0052]5、将上述4的溶液用ro-ΙΟ柱纯化，收集纯化液，按照1:3000的体积添加获得的酶反应物稀释液，混合均匀即得酶反应物。
[0053]步骤三、反应增强剂的配制
[0054]1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于IL容器中；用移液器将Proclin-300量取
0.2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
[0055]2、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌直至完全溶解，然后调PH值，控制PH在7.35-7.45之间；
[0056]3、称取Mak33 0.9g于上述IL容器中；最后定容至1000ml,完全溶解后,用0.2um滤器过滤。
[0057]步骤四、校准品稀释液的配制
[0058]1、称取 Tris 7.268g 和 Hcl 4270 μ I 于 IL 的容器中，定容至 600ml ;
[0059]2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，校准品稀释液备用。
[0060]步骤五、校准品的配制
[0061]校准品浓度分别为50，130，300，450ng/ml。
[0062]步骤六、清洗浓缩液的配制[0063]1、称取 Kcl 4g、NaC140g、蔗糖 IOg 于 IL 容器中；
[0064]2、称取0.225g Tween-20于IOOml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL
容器中；
[0065]3、用移液器将Proclin-300量取0.225ml于盛有15ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；
[0066]4、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌直至完全溶解；
[0067]5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；
[0068]6、最后定容至1000ml,完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
[0069]步骤七、底物溶液的配制
[0070]一、底物溶液A的配制步骤
[0071]1、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于IL烧杯中；
[0072]2、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.95-8.05之间；
[0073]3、用0.2um滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至500ml,混勻后即得。
[0074]二、底物溶液B的配制
[0075]1、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、过氧化脲0.1g和PC300 250ul于IL烧杯中；
[0076]2、用量筒量取400ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH控制其范围在7.95-8.05之间；
[0077]3、用0.2um滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至500ml,混勻后即得。
[0078]所得的产品分装即为半成品，抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成高尔基体蛋白GP73微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
[0079]工作原理:
[0080]本实用新型为双抗体夹心法化学发光免疫分析法与磁微粒分离技术相结合的一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标GP73抗原、结合着磁性微粒的GP73单克隆抗体及稳定增强剂。37°C孵育后，酶标GP73抗原与标本、校准品和质控品中GP73竞争的与结合着磁性微粒的GP73单克隆抗体发生特异性结合。在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，反应的发光强度与样本中的GP73浓度成反比。
[0081]使用方法
[0082](I)样品的前处理:
[0083]使用本试剂盒进行实验前，需先取出辣根过氧化物酶标记的GP73抗体、校准品/待测样品、GP73抗体磁颗粒、发光底物液和洗涤液，在室温放置15-30min，使它们平衡到室温；之后，将恒温箱或者水浴锅调至37°C;准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否工作正常。
[0084](2)操作步骤:
[0085]1、加50 μ I GP73校准品、质控品、待测标本至对应微孔底部；[0086]2、加50 μ I酶反应物至每一微孔中；
[0087]3、加50 μ I反应增强剂至每一微孔中；
[0088]4、加50 μ I磁分离试剂至每一微孔中；
[0089]5、用塑料薄膜覆盖微孔，多管混匀器轻轻振荡微孔板30s后，置37°C水浴30分钟；
[0090]6、微孔板放至磁分离器上，确保每个微孔都与分离器表面接触，沉淀2分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；
[0091]7、清洗浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200 μ I稀释后的清洗液至每一微孔中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s ;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出，且混匀要彻底；
[0092]8、重复步骤6、7、6 —遍；
[0093]9、加100 μ I底物溶液至微孔中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；
[0094]10、如遇到高值HOOK样本，为了避免出现高值HOOK效应，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
[0095]以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘制出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的GP73的浓度，其中纵坐标为发光强度，横坐标为GP73浓度( 单位为ng/ml)。
[0096]性能指标
[0097]I)准确性:试剂盒校准品与国家校准品同时测定，两条剂量-反应曲线不显著偏离平行。以国家校准品为对照品，试剂盒校准品试剂盒的实际值与标示值之比应该在
0.90-1.10的范围内
[0098]2)剂量-反应曲线的线性:用双对数数学模型拟合，在50_500ng/ml浓度范围内，剂量-反应曲线的相关系数(r)的绝度值不低于0.9900
[0099]3)精密性:CV ^ 15% ;重复性:CV ^ 10%
[0100]4)最低检出量-.(20ng/ml
[0101]5)质控血清测定值:应在质控范围内
[0102]6)特异性:交叉反应率应小于0.2%
[0103]7)稳定性:将试剂盒37°C放置3天，测定结果应符合上述I)~5)项要求
[0104]本实用新型具有以下优点:
[0105]1、本实用新型将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强。
[0106]2、本实用新型对所用的原材料进行筛选实验和质量检定，包括包被抗体的活性，磁颗粒的吸附性能和变异大小，(HRP)的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等，对于(HRP)的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比试验最终找到了简单、产率高、成本低、质量可靠的标记方法。
[0107]3、本实用新型采用一种新的专用稳定增强剂以及清洗浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本。[0108]4、试剂盒中的磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品，清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
[0109]5、本实用新型采用微孔板磁颗粒整合了两种技术，主要体现在:(1)利用磁颗粒在相同体积的情况下表面积最大的原理，能够结合更多的抗体，从而使得反应的灵敏度更高，线性范围更宽；(2)可以同时批量测量，适合大批量血清筛查。
【权利要求】
1.一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒，包括盒体(I)和盒体上方的盒盖(2)，其特征是:所述盒体(I)内设有微孔板(6)和位于盒体(I)底部的支撑板(3)，其中微孔板(6)由48或96个微孔(7)组成，支撑板(3)上开有多个孔(4)，所述孔(4)内共放置有八个试剂瓶(5)，所述八个试剂瓶(5)内分别含有磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液，其中磁分离试剂含有高尔基体蛋白GP73单克隆抗体包被的磁颗粒。
【文档编号】G01N33/68GK203479809SQ201320597351
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】奚伟红, 王布强, 王京, 严子禾, 高淑舫, 高磊 申请人:江苏福隆生物技术有限公司