专利名称：：Dna结合蛋白的定量方法及定量用试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种DNA结合蛋白的定量方法及定量用试剂盒。
背景技术：
：作为从生物试样那种含杂质的试样中定量靶DNA结合蛋白的方法，有EP1138781公开的方法。根据此方法，对使耙DNA结合蛋白特异性结合到探针的复合物进行分离，再用免疫学定量法或PCR法定量所得复合物。从试样分离出含有靶DNA结合蛋白和探针的复合物是一项很烦琐的操作过程。用免疫学定量法或PCR法定量复合物中所含靶DNA结合蛋白和DNA也同样费事。因此，运用EP1138781公开的方法获得定量结果需要很长时间。US2006166237中提出了一个利用荧光相关光谱法仅从含有若干蛋白质的试样中快速检测出靶DNA结合蛋白，不进行分离、洗涤操作的方法。根据US2006166237的实施例，用荧光标记DNA探针可以检测出生物试样的核提取物中的转录因子AP—l和NF—kB。在所用DNA结合探针与靶转录因子的结合反应中，转录因子的浓度与所测并进扩散时间有相关性。添加激活转录因子(AP—1)的刺激因子(TNF—a)与标记DNA探针转录因子复合物之间也显示有相关性。荧光相关光谱法是一种测定液态试样所含分子的布朗运动所花费的并进扩散时间的方法。根据US2006166237所述方法，通过延长探针和蛋白质形成复合物所需的并进扩散时间，检测与探针特异性结合的蛋白质。然而，液态试样中的分子的布朗运动易受溶液粘度的影响。在此，生物试样往往含有大量作为杂质的蛋白质等高分子物质。因此，即使生物试样中靶蛋白质与探针的复合物数量相同，也有可能受液体试样所含高分子物质的影响，导致所测扩散时间发生变化。另外，EP1835283公开了一种通过测定炎症细胞因子的转录因子，进行含败血症在内的全身性炎症症候群(SIRS)的辅助诊断的方法。SIRS每时每刻病情都在发生变化，需要根据病情实施治疗。因此，人们希望在一小时之内能够定量作为诊断依据的靶蛋白的量。需要分离、洗涤耙蛋白的定量方法可以用于体检那种不急的蛋白定量。而无法用于需要快速定量采自患者的试样中所含靶蛋白量这种病情变化的诊断。因此，需要用荧光相关光谱法等快速测定转录因子。如上所述，特别是在病情变化的诊断中，人们一直寻求一个用荧光相关光谱法更准确地定量作为DNA结合蛋白的NF—KB和AP—1等转录因子的方法。
发明内容本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节
发明内容的陈述所限。本发明的目的是提供一种用荧光相关光谱法准确定量诸如生物试样等含杂质的试样中所含靶DNA结合蛋白的方法及其定量用试剂盒。艮口，本发明提供一种定量液体试样中的耙DNA结合蛋白的方法，包括以下步骤混合第一测定用试剂和液体试样，制备第一混合液，测定第一混合液中的第一并进扩散时间，其中，第一测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白可结合到荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针；混合第二测定用试剂和液体试样，制备第二混合液，测定第二混合液中的第二并进扩散时间，其中，第二测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第二非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白不能结合到第二非标记核酸探针；及根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差，定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白。所述定量步骤是根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差以及表示靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白的。所述表示靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据是校准曲线，通过用荧光相关光谱法测定混合含荧光标记核酸探针的溶液和含一定量靶DNA结合蛋白的溶液制备的混合液中的并进扩散时间而获得。第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的量比第一测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多；第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的量比第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多。第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的浓度与第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的浓度相同。所述液体试样含核提取物。靶DNA结合蛋白为转录因子。转录因子是细胞因子的转录因子。荧光标记核酸探针的核酸序列与第一非标记核酸探针的核酸序列相同。荧光标记核酸探针、第一非标记核酸探针和第二非标记核酸探针的至少一个形成茎环结构。本发明还提供一种用荧光相关光谱法定量液体试样中耙DNA结合蛋白的试剂盒，包括含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针的第一测定用试剂；及含有荧光标记核酸探针和第二非标记核酸探针的第二测定用试剂；其中，靶DNA结合蛋白可与荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针结合，不能与第二非标记核酸探针结合。所述试剂盒中第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的量比第一测定用试剂所含荧光标记核酸探针多，第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的量比第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多。所述试剂盒中第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的浓度与第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的浓度相同。所述试剂盒中荧光标记核酸探针的核酸序列与第一非标记核酸探针的核酸序列相同。所述试剂盒中荧光标记核酸探针、第一非标记核酸探针和第二非标记核酸探针的至少一个形成茎环结构。所述液体试样含核提取物。所述靶DNA结合蛋白为转录因子。所述转录因子为细胞因子的转录因子。使用本发明的定量方法和定量用试剂盒，不必进行分离、提炼耙DNA结合蛋白等烦琐的操作，就可以快速、准确地定量耙DNA结合蛋白。因此，本发明的定量方法和定量用试剂盒可适用于病情变化的诊断。[图1]为表示NF—KB与并进扩散时间关系的校准曲线图。[图2]为用纯液体试样时的FCS测定结果一览图。[图3]为核提取物试样中NF—KB的FCS测定结果一览图。具体实施例方式[定量用试剂盒]首先就在本发明的DNA结合蛋白定量方法中使用的定量用试剂盒进行说明。本发明的DNA结合蛋白定量用试剂盒适用于运用荧光相关光谱法的测定。定量用试剂盒包含第一测定用试剂和第二测定用试剂。第一测定用试剂含有荧光标记核酸探针(PfW)和第一非标记核酸探针(Pw)。靶DNA结合蛋白可以分别结合到荧光标记核酸探针(P&)和第一非标记核酸探针(Pw)各自的核酸序列。第二测定用试剂含有荧光标记核酸探针(Pfw)和第二非标记核酸探针(Pn)。在此，靶DNA结合蛋白不能结合到第二非标记核酸探针(Pn)核酸序列。即，第二测定用试剂包括具有能与靶DNA结合蛋白结合的核酸序列的荧光标记核酸探针(Pb)和有不与靶DNA结合蛋白结合的核酸序列的非标记核酸探针(Pn)。所谓DNA结合蛋白是对DNA有亲和性、与DNA特异性或非特异性结合的蛋白质的总称。比如有与双链DNA结合的蛋白质、与单链DNA结合的蛋白质、参与保持染色体高层次结构的蛋白质、DNA依赖型ATP酶和DNA拓扑异构酶等。作为本发明测定目标的靶DNA结合蛋白以与双链DNA特异性结合的DNA结合蛋白为宜，调节基因表达的DNA结合蛋白尤佳。更具体地说，作为靶DNA结合蛋白可以举出转录因子等。作为转录因子最好是调节细胞因子转录的转录因子。作为细胞因子的转录因子有NF—kB、AP—1、NFAT、STAT家族、IRF家族、C/EBP、Spl和CREB等。其中尤以NF—kb为宜。耙DNA结合蛋白结合的核酸序列只要含靶DNA结合蛋白结合的共有序列(consensus序列(Wseq))即可，无特别限定。在此，核酸序列可根据耙DNA结合蛋白的种类适当选择。比如，当靶DNA结合蛋白为转录因子时，可选择参与转录因子表达的转录调节区域、特别是增强子区域作为核酸序列。本发明使用的荧光标记核酸探针(P&)是用后述荧光物质标记的、有耙DNA结合蛋白结合的共有序列(Wseq)的核酸探针。核酸探针可以由DNA、RNA和PNA构成。构成核酸的碱基可以使用腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及其修饰碱基。另外，当靶DNA结合蛋白与双链DNA结合时，作为荧光标记核酸探针(P&)最好是形成茎环结构的核酸探针。此种核酸探针可以用环结构的腺嘌呤或胸腺嘧啶架桥的形式形成含共有序列(Wseq)的双链DNA的有义链和反义链。荧光标记核酸探针(PfW)的碱基总数无特别限制，以4674为宜。作为标记所使用的荧光物质，只要是能够标记核酸探针的荧光物质即可，无特别限制。比如可以是TAMRA、RhodamineGreen、Alexa546、TMR、Alexa488、Alexa647等。特别以TAMRA、RhodamineGreen为宜。这些荧光物质已为众人周知，容易买到。本发明使用的第一非标记核酸探针(Pw)是没有被荧光物质标记的、有耙DNA结合蛋白结合的共有序列(Wseq)的核酸探针。第一非标记核酸探针(Pw)和荧光标记核酸探针(P^V)最好是同样的核酸序列。但是，共有序列(Wseq)以外的序列只要不影响DNA结合蛋白的结合，也可以有几个不同。当靶DNA结合蛋白结合在双链DNA时，第一非标记核酸探针(Pw)也最好是与上述荧光标记核酸探针(PfW)同样的形成茎环结构的核酸探针。本发明使用的第二非标记核酸探针(Pn)是未被荧光物质标记的、没有靶DNA结合蛋白结合的共有序列(Wseq)的核酸探针。第二非标记核酸探针(Pn)的碱基总数最好是与第一非标记核酸探针(Pw)相同的碱基数。.如果第一非标记核酸探针(Pw)形成茎环结构，则第二非标记核酸探针(Pn)也最好形成茎环结构。定量用试剂盒的第一测定用试剂中含有荧光标记核酸探针(P^v)和第一非标记核酸探针(Pw)。第一测定用试剂中含有的荧光标记核酸探针(P&)的量足以供待测试样中所含靶DNA结合蛋白充分结合。第一非标记核酸探针(Pw)在第一测定用试剂中的含量多于荧光标记核酸探针(P~)。在此，第一测定用试剂中所含第一非标记核酸探针(Pw)的量最好是荧光标记核酸探针(PfW)含量的10倍以上，尤以50倍以上为好。第一测定用试剂最好还含有聚(dl-dC)，以抑制对核酸探针的非特异性结合。作为第一测定用试剂的溶剂，应使用核酸探针和靶DNA结合蛋白能稳定存在、且能结合的溶剂。溶剂可根据靶DNA结合蛋白适当配制。比如，在Tris缓冲液、Hepes缓冲液和磷酸盐缓冲液等缓冲液中适当添加氯化钠、EDTA和DTT等制备的溶液。定量用试剂盒的第二测定用试剂中含有荧光标记核酸探针(P&)和第二非标记核酸探针(Pn)。第二测定用试剂除含有第二非标记核酸探针(Pn)取代第一非标记核酸探针(Pw)夕卜，其他均与第一测定用试剂相同。即第二测定用试剂的溶剂与第一测定用试剂的溶剂相同。第二测定用试剂含有与第一测定用试剂同样浓度的荧光标记核酸探针(P&)。第二测定用试剂含有大大超过Pfw含量的第二非标记核酸探针(Pn)。在此，第一测定用试剂的第一非标记核酸探针(Pw)与第二测定用试剂的第二非标记核酸探针(Pn)最好浓度相同。本发明的测定用试剂盒含有上述第一测定用试剂和第二測定用试剂。本测定用试剂盒最好还包括一部说明书，该说明书有表示耙DNA结合蛋白量与并进扩散时间的关系的数据。此数据最好是表示耙DNA结合蛋白量与并进扩散时间的关系的校准曲线。本发明的测定用试剂盒还可以含有根据上述数据从所测并进扩散时间值算出试样中靶DNA结合蛋白量的计算程序。计算程序可通过存储该程序的存储器和电路向本发明测定用试剂盒的使用者提供。作为存储器如有软盘(FD)、光盘(CD)、存储磁盘(DVD)等。校准曲线可以用实际上只含有荧光标记核酸探针(PfW)的校准用反应液和添加了已知含量的靶DNA结合蛋白质的校准用试样求得。即，制备二种以上添加不同量的靶DNA结合蛋白质的校准用试样。然后混合各校准用试样和校准用反应液。测定各混合液的并进扩散时间。以此从各校准用试样中的DNA结合蛋白量与所测并进扩散时间的关系求出校准曲线。最好用阶段稀释法制备浓度不同的数种校准用试样。用最小平方法求出表示在各校准用试样中DNA结合蛋白量与并进扩散时间的相关性的直线，即可获得校准线。用于校准用试样的溶剂虽然与上述第一测定用试剂基本成份相同，但最好不含聚(dl-dC)。[定量方法]下面就本发明的DNA结合蛋白的定量方法进行说明。本发明的DNA结合蛋白的定量方法是一种定量液体试样中的靶DNA结合蛋白的方法，包括第一测定步骤用荧光相关光谱法测定在混合上述第一测定用试剂和上述液体试样制备的第一混合液中的第一并进扩散时间(Ta);第二测定步骤用荧光相关光谱法测定在混合上述第二测定用试剂和上述液体试样制备的第二混合液中的第二并进扩散时间(Tb);及定量步骤根据第一并进扩散时间(Ta)和第二并进扩散时间(Tb)的差(|Ta—Tbl)，定量上述液体试样所含靶DNA结合蛋白。作为液体试样，只要是耙DNA结合蛋白在未与核酸结合的自由状态下存在的液体试样即可。本发明的定量方法可适用于含有杂质的液体试样。因此，本发明的定量方法可以较好地适用于采自患者的生物试样。在此，生物试样只要是从患者采集的含有细胞成份的试样即可，无特别限定。比如可以是血液、尿液、细支气管肺泡灌洗液、唾液、痰、脑骨髓液、关节液、浸润液、可溶解组织的生物试样等。有一些转录因子象NF—KB和NFAT等，在非活性状态下存在于细胞质，一旦被激活就局部存在于细胞核内。因此，在这种转录因子中，当定量活性转录因子的量时，最好以核提取物为试样。含有核提取物的生物试样可以用众所周知的方法制备。比如可以有以下方法以低张液处理细胞使之膨胀，用均质器或注射器破坏细胞膜。然后离心离析出核碎片。再用高张液或表面活性剂处理离析的核碎片，提取核蛋白质。离心分离核蛋白质的提取液，回收上清。此上清中含有从核提取的蛋白质。混合本发明定量用试剂盒的第一测定用试剂和上述液体试样，制备第一混合液。混合比率为液体试样中所含靶DNA结合蛋白能够充分与第一测定用试剂中所含荧光标记核酸探针(PfW)结合的比率。制备的第一混合液静置515分钟后，测定在第一混合液中的第一并进扩散时间(Ta)。静置515分钟可以形成核酸探针与DNA结合蛋白的复合物。此时间可根据靶DNA结合蛋白的种类和含量适当设定。在此，在第一混合液中，液体试样中所含耙DNA结合蛋白与第一测定用试剂所含荧光标记核酸探针(Pfw)和第一非标记核酸探针(Pw)结合。在此，第一测定用试剂中含有远远超过荧光标记核酸探针(P^v)量的非标记核酸探针Pw。因此，靶DNA结合蛋白优先与Pw结合。因此，第一混合液中可以认为含有荧光标记核酸探针(P^v)、非标记核酸探针Pw和耙DNA结合蛋白的复合物(Pw—蛋白复合体)以及非标记核酸探针(PW)。g卩，第一混合液中的荧光标记物可以认为是荧光标记核酸探针(PfW)。混合本发明测定用试剂盒的第二测定用试剂和上述液体试样，制备第二混合液。第二测定用试剂和上述液体试样的混合比率与上述第一混合液和液体试样的混合比率相同。测定在制备的第二混合液中的第二并进扩散时间(Tb)。第二混合液的静置时间与第一混合液的静置时间相同。在此，在第二混合液中，液体试样所含靶DNA结合蛋白只与第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针(PfW)结合。因为第二测定用试剂中大量含有的第二非标记核酸探针(Pn)实际上不与靶DNA结合蛋白结合。因此，第二混合液所含荧光标记物可以认为是荧光标记核酸探针(Pb)与靶DNA结合蛋白的复合物(PfW—靶蛋白复合物)和未反应的荧光标记核酸探针PfW。第一并进扩散时间(Ta)和第二并进扩散时间(Tb)可以分别向第一混合液和第二混合液照射共焦点激光，用荧光相关光谱(FCS)技术测定。根据所测第一并进扩散时间(Ta)和第二并进扩散时间(Tb)的差(|Ta—Tbl)，定量上述液体试样所含靶DNA结合蛋白。在此，第一混合液中的荧光标记物可以看作未形成复合物的核酸探针(P&)。因此，第一混合液的第一并进扩散时间(Ta)可以看作P^v的并进扩散时间。而第二混合液中的荧光标记物可以看作是PfW—靶蛋白复合物和未反应的荧光标记核酸探针PfW。因此，第二混合液的第二并进扩散时间(Tb)可以看作是Pfw—靶蛋白复合物和未反应的荧光标记核酸探针PfW的并进扩散时间。因此，第一并进扩散时间(Ta)和第二并进扩散时间(Tb)的差(|Ta—Tb|)可以认为相当于取决于有无PfW—耙蛋白复合物的并进扩散时间之差。液体试样所含靶DNA结合蛋白可以由表示上述靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据和第一并进扩散时间(Ta)与第二并进扩散时间(Tb)之差(|Ta—Tb|)来定量。比如数据如果是表示并进扩散时间与靶蛋白相关性的校准曲线，则求校准曲线斜率，用该斜率除以并进扩散时间差，即可算出蛋白量。在此，所谓荧光相关光谱(FCS)技术指测定溶液中的分子通过共焦点区域发出的荧光的方法。溶液中的分子由于布朗运动而自由移动。小分子运动快，快速通过共焦点区。因此，小分子的荧光信号强度变化快。而大分子运动速度慢，缓慢地通过共焦点区，因此，大分子的荧光强度变化慢。(所谓荧光相关光谱技术)就是用自相关法从这种荧光信号强度的变化速度上求出分子的运动速度(并进扩散时间)。利用FCS的测定会受溶液粘度的影响。因为溶液粘度会对分子的布朗运动产生影响。即，分子量以外的原因也可能导致并进扩散时间迟缓。更具体而言，即使液体试样中含有同量的P^—靶蛋白复合物，杂质少的液体试样的并进扩散时间和生物试样的并进扩散时间之间有微妙不同。一般来说，生物试样含有大量蛋白质等高分子化合物，粘性高。因此，生物试样中的复合物的运动受到阻碍，并进扩散时间有延长倾向。然而，根据本发明的定量方法，在第一混合液和第二混合液中P^v一耙蛋白复合物的布朗运动的阻碍条件相同，因此，在第一混合液的第一并进扩散时间(Ta)与第二混合液的第二并进扩散时间(Tb)之差(ITa一Tbi)中，受液体试样所含杂质影响而产生的并进扩散时间延迟被抵消。因此，根据ITa—Tbl可以正确地定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白。如此，本发明的定量方法可以抵消并进扩散时间受液体试样所含杂质影响而产生的延迟。因此，即使是生物试样中的靶DNA结合蛋白也可以正确定量。运用本发明的定量方法可以在30分钟之内测定第一并进扩散时间(Ta)和第二并进扩散时间(Tb)。如果使用含有上述计算程序的本发明测定用试剂盒，可以在30分钟之内定量靶DNA结合蛋白。举例[实施例][核酸探针](O有荧光标记的共有序列(Wseq)的核酸探针(PfW)该核酸探针是将TAMRA(Sigma~GenosyS公司)作为荧光素结合到以4个碱基的腺嘌呤为环形成茎环结构的下述碱基序列的核酸5'末端。下述序列中Wseq为5'末端起第817的区域。[化l]5，TAMRA—agttgaggggactttcccaggcaaaagcctgggaaagtcccctcaact3，PfW为用10mMTris-HCI溶液溶解Sigma"Genosys公司合成的寡核苷酸(冷冻干燥品)，将PfW浓度调整到10(VM后，95-C放置10分钟，65°C放置30分钟，使之变为单链后，再放回常温下，形成茎环结构后供使用。(2)有非标记结合序列(Wseq)的核酸探针(Pw)是一种除荧光素没有结合外，具有与Pfw同样碱基序列(下述序列)的核酸探针。[化2]5，agttgaggggactttcccaggcaaaagcctgggaaagtcccctcaact3,Pw与PfW同样，先通过热变性变为单链后，再放回常温下，形成茎环结构后供使用。(3)非标记、无结合的非特异性核酸探针(Pn)是一种下述碱基序列的核酸探针，形成以4个碱基的腺嘌呤为环部分的茎环结构。[化3]5'caggcgcgttttgaccatcttaaaaaagatggtcaaaacgcgcctg3'Pn也与Pfw同样，热变性为单链后，再放回常温下，形成茎环结构后供使用。[试剂、试样](1)FCS缓冲剂是一种制备FCS测定溶液而使用的溶剂，具有以下成份<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)重组NF-xB用一定稀释液稀释Promega公司的市场出售品使用。稀释液使用的是由50mMNaCl、5mMDTT、20mMHEPES(pH7,9)、0.1%NP—40和100/0葡萄糖组成的溶液。(3)来自采集血液的末梢血单核细胞的核提取物在真空采血管采集的血液中加入等量的生理盐水，稀释到2倍后，重层于作为分离单个核细胞用淋巴细胞分层液的Ficoll(安玛西亚生命科学公司)上，离心分离出红细胞、末梢血单核细胞和血浆成份。回收末梢血单核细胞分层，用生理盐水洗涤后，离心操作，弃上清，得细胞团。从细胞团制备核提取物使用的是Novagen公司的蛋白质提取试剂盒NucBuster(注册商标)。即，用75^il试剂l分散细胞团，用涡动搅拌器(Vortex)均质化15秒，冰上静置5分钟。然后，再用涡动搅拌器均质化15秒，以15000rpm、4'C离心5分钟，回收作为细胞质片段的上清。在所得细胞团中添加DTT、蛋白酶抑制剂和试剂2的混合液(混合比例1:1:75)40pl，用涡动搅拌器均质化15秒，冰上静置5分钟。再用涡动搅拌器均质化15秒，以15000rpm、4'C离心5分钟，取所得上清作为核提取物使用。(4)HeLa细胞的核提取物HeLa细胞培养液以190g离心5分钟，用lml冰镇磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗回收的HeLa细胞，得细胞团。由细胞团配制核提取物使用的是Novagen公司的蛋白质提取试剂盒NucBuster(注册商标)。艮卩，用150pl试剂l分散细胞团，用涡动搅拌器均质化15秒，冰上静置5分钟。然后，再用涡动搅拌器均质化15秒，以15000rpm、4T:离心5分钟，回收作为细胞质片段的上清。在所得细胞团中添加DTT、蛋白酶抑制剂和试剂2的混合液(混合比例1:1:75)80pl，用涡动搅拌器均质化15秒，冰上静置5分钟。再用涡动搅拌器均质化15秒，以15000rpm、4'C离心5分钟，将所得上清作为核提取物使用。[校准曲线的绘制]将1h1的重組NF-kB(Promega公司)与39pl的稀释液(50mMNaCl、5mMDTT、20mMHEPES(pH7.9)、0.1%NP—40和10。/。葡萄糖)混合，配制重组NF-kb浓度6ng/nl的酶校准品原液。混合4nl的FCS缓冲液、0.2i!l的100nM荧光标记核酸探针P^v(最终浓度lnM)、8.8pl的水和5nl的试剂2，配制校准用反应液。将酶校准品原液的稀释液混入校准用反应液，制备重组NF-kb浓度分别为1.5ng/)il、0.8ng4d、0.2ng/nl的校准品。室温反应10分钟后，用MF20(奥林帕斯公司)测定各校准品的并进扩散时间。对相当于重组NF-KB浓度为0ng4il的稀释液和校准用反应液的混合液也与上述样准品一样测定并进扩散时间。以重组NF-KB的浓度为X轴，以并进扩散时间为Y轴，在能获得直线性的浓度范围内用最小平方法绘制校准曲线。所得校准曲线如图1所示。[纯液体试样中的蛋白一探针复合物的并进扩散时间](1)FCS测定用试样的制备使用重組NF-kB的0.6ng4il溶液作为纯试样。在5iil的此纯液体试样中如表2所示混入FCS缓冲液、水和核酸探针，制备测定用试样15。作为质控品，使用的是不含纯液体试样、仅用荧光标记核酸探针P^v作为核酸探针的试样。作为参考，还使用了又添加了抗p50抗体的试样。在各试样中，反应时间均设定为10分钟。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>含量单位均为w各试样的()内浓度为最终浓度(2)FCS测定关于上述制备的试样15、质控品和参考例，用奥林帕斯公司的MF20测定并进扩散时间。结果如图2所示。与表示基于荧光标记核酸探针P^v的并进扩散时间(478.2psec)的质控品相比，试样l的并进扩散时间(969.3psec)由于形成NF-KB和荧光标记核酸探针P^v的复合物(简述为PfW—NF复合物)而延长了。试样2由于含有竞争探针Pw，也许是Pfw—NF复合物形成的比例相应减少，并进扩散时间(868pSeC)虽然比质控品的并进扩散时间长，但短于试样l的并进扩散时间。Pw量为50倍的试样3的扩散时间(495.8psec)几乎与质控品一样，可以说，NF-KB的大部分与Pw形成复合物，荧光物质Pfw以不形成复合物的状态存在。试样4、5在含有NP-KB不结合的核酸探针的情况下，并进扩散时间均与试样l基本相同。由此得知，在试样4、5中，荧光物质为P^v-NF复合物。另外，在参考例中，抗p50抗体分子量比核酸探针PfW大，因此，该抗体与NF-KB的复合物比PfW-NF复合物大，扩散时间也长。[HeLa细胞核提取物的蛋白一探针复合物的并进扩散时间](1)FCS测定用试样的制备作为含有杂质的生物试样，使用的是人宫颈癌的细胞株HeLa细胞的核提取物，定量活性NF-kB(移到核内的NF-kB)作为DNA结合蛋白。为了从培养细胞的状态获得活性NF-KB，即为了使NF-KB移入核内，在HeLa细胞培养基中添加TNF-a后，制备核提取物，如表3所示，混合核提取物、FCS测定用溶剂、聚(dldC)、核酸探针，制备试样10—13。反应时间设为5分钟。关于试样IO，使用不添加TNF-a制备的核提取物。质控品未添加核提取物。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表中各试样含量的单位为W，〇内数值表示最终浓度。关于TOF-a和核提取物，用"+"表示添加，用"一"表示无添加。(2)FCS测定对于试样1013和质控品，用奥林帕斯公司的MF20测定并进扩散时间。结果如图3所示。试样10和试样11的不同在于有无刺激NF-kb为活性NF-kb。添加了TNF-a的试样ll的并进扩散时间比无添加的试样10的并进扩散时间长，可以确认，荧光标记核酸探针PfW与NF-kb形成了复合物(PfW-NF复合物)。并且得知，要使NF-kB移入核内，就要添加TNF-a。试样10原则上可以认为几乎不含活性NF-kb，因此荧光物质可以认为是荧光标记核酸探针PfW单体，但试样10的并进扩散时间(610.8psec)比质控品的并进扩散时间(566.7psec)长。这是因为试样10在不用TNF-a刺激的状态下核内也含有少量NF-kb，或试样10的溶液试样与不含核提取物的质控品相比，溶液粘性提高，因此，荧光标记核酸探针PfW的布朗运动的自由度受到一些阻碍。试样12由于竞争探针的共存，大部分NF-KB与非标记核酸探针Pw形成复合物，荧光物质可以认为成为荧光标记核酸探针P^v单体。试样12的并进扩散时间基本与试样10的并进扩散时间相同，由此可以认为，试样IO几乎未包含NF-kB。试样13的并进扩散时间几乎与试样11的并进扩散时间相等。在试样13中，共存的非标记核酸探针Pn是NF-KB不形成复合物的探针，因此，试样13中的荧光物质可以认为是PfW-NF复合物。因此，形成P^v-NF复合物造成的并进扩散时间的延长不仅可以从取决于有无NF-KB的试样10的并进扩散时间与试样ll的并进扩散时间的不同而得知，也可以从竞争探针的共存有无形成PfW-NF复合物从而造成试样12的并进扩散时间与试样13的并进扩散时间之差而得知。质控品的并进扩散时间差和试样10的并进扩散时间差可能是因为溶液粘度增高使荧光标记核酸探针P^v的布朗运动自由度受到一定影响。[核提取物中的NF-kB定量用添加回收实验进行验证](1)FCS测定用试样的制备及用FCS进行的测定在由人单核细胞系细胞株U937制备的核提取物10ng中混入重组NF-kB，使浓度达至lJ0.4ng/ti1，再如表4所示混合核酸探针(PfW、Pw、Pn)、FCS缓冲液、试剂2、Poly(dldC)和水，制备测定用试样21、22、23。对上述方法制备的各测定用试样21、22、23分别用FCS测定三次荧光物质的并进扩散时间，求平均并进扩散时间。各测定用试样的成份和平均并进扩散时间见表4。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表中的各试样含量的单位是w，()内数值表示最终浓度。(2)含量的计算及其验证根据图l所示校准曲线，从并进扩散时间计算出NF-KB含量。由试样21的并进扩散时间(650.7pisec)与在绘制校准曲线时使用的质控品NF-kb浓度为Ong/Vl的并进扩散时间(533psec)之差算出的NF-kB含量为0.50ng/nl。这从在试样中添加的NF-KB量来看，回收率相当于124%。另一方面，从试样22的并进扩散时间与试样23的并进扩散时间之差算出的NF-KB含量为0.42ng/jil。这从在试样中添加的NF-KB量来看，回收率相当于105%。因此，本发明的定量方法是利用了非标记核酸探针(Pw、Pn)的竞争测定性，采用本定量方法，试样所含杂质的影响被抵消，可以准确知道基于与荧光标记核酸探针形成复合物而造成的并进扩散时间延迟，可以确认，本定量方法由校准曲线算出的含量可信度高、精度高。前述的详细说明及附图是通过文字解释和图示来进行的，其耙不在于限定权利要求的保护范围。本说明书中的具体实施方式的各个变种对于普通技术人员来说显而易见，并处于权利要求及其等同技术的保护范围内。序列表<110〉希森美康株式会社<120>DNA结合蛋白的定量方法及定量用试剂盒<160>2<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211>48<212>賺<213>人工序列<220〉<223〉探针<220><221〉stem—loop<222〉(1)..(48)<223〉<400〉1agttgaggggactttcccsggcaaaagcctgggaaagtcccctcaact48<210〉2<211〉46<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉探针<220><221>stem—loop<222>(1)..(48)<223〉<400>2caggcgcgttttgaccatcttaaa333gatggtcsaaacgcgcctg4权利要求1.一种定量液体试样中的靶DNA结合蛋白的方法，包括以下步骤混合第一测定用试剂和液体试样，制备第一混合液，测定第一混合液中的第一并进扩散时间，其中，第一测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白可结合到荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针；混合第二测定用试剂和液体试样，制备第二混合液，测定第二混合液中的第二并进扩散时间，其中，第二测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第二非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白不能结合到第二非标记核酸探针；及根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差，定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白。2.权利要求l所述方法，其特征在于定量步骤是根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差以及表示靶.DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白的。3.权利要求2所述方法，其特征在于表示靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据是校准曲线，通过用荧光相关光谱法测定混合含荧光标记核酸探针的溶液和含一定量靶DNA结合蛋白的溶液制备的混合液中的并进扩散时间而获得。4.权利要求1所述方法，其特征在于第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的量比第一测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多；第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的量比第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多。5.权利要求l所述方法，其特征在于第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的浓度与第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的浓度相同。6.权利要求l所述方法，其特征在于液体试样含核提取物。7.权利要求l所述方法，其特征在于靶DNA结合蛋白为转录因子。8.权利要求7所述方法，其特征在于转录因子是细胞因子的转录因子。9.权利要求l所述方法，其特征在于荧光标记核酸探针的核酸序列与第一非标记核酸探针的核酸序列相同。10.权利要求1所述方法，其特征在于荧光标记核酸探针、第一非标记核酸探针和第二非标记核酸探针的至少一个形成茎环结构。11.一种用荧光相关光谱法定量液体试样中靶DNA结合蛋白的试剂盒，包括含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针的第一测定用试剂；及含有荧光标记核酸探针和第二非标记核酸探针的第二测定用试剂；其中，靶DNA结合蛋白可与荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针结合，不能与第二非标记核酸探针结合。12.权利要求ll所述试剂盒，其特征在于第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的量比第一测定用试剂所含荧光标记核酸探针多，第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的量比第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多。13.权利要求ll所述试剂盒，其特征在于第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的浓度与第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的浓度相同。14.权利要求ll所述试剂盒，其特征在于荧光标记核酸探针的核酸序列与第一非标记核酸探针的核酸序列相同。15.权利要求ll所述试剂盒，其特征在于荧光标记核酸探针、第一非标记核酸探针和第二非标记核酸探针的至少一个形成茎环结构。16.权利要求ll所述试剂盒，其特征在于液体试样含核提取物。17.权利要求ll所述试剂盒，其特征在于靶DNA结合蛋白为转录因子。18.权利要求17所述试剂盒，其特征在于转录因子为细胞因子的转录因子。全文摘要本发明提供一种定量液体试样中靶DNA结合蛋白的方法及其定量试剂盒，包括以下步骤混合第一测定用试剂和液体试样，制备第一混合液，测定第一混合液中的第一并进扩散时间；混合第二测定用试剂和液体试样，制备第二混合液，测定第二混合液中的第二并进扩散时间；根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差，定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白。文档编号G01N33/68GK101334412SQ200810126518公开日2008年12月31日申请日期2008年6月24日优先权日2007年6月29日发明者山形浩一,阿部滋树申请人:希森美康株式会社