G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，是用荧光染料也可标记的VP1单克隆抗体，所述的VP1单克隆抗体，是利用G种肠道病毒的VP1蛋白，采用杂交瘤单抗制备技术获得；所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。既可用于临床快速诊断G种肠道病毒感染，也可用于G种肠道病毒抗原在组织中的定位与鉴定；直接免疫荧光检测时间短，40分钟内即可报告结果；特异性强，仅与G种肠道病毒反应；重复性好，准确性高，与间接免疫荧光方法的符合率为90%以上，可用于G种肠道病毒感染的快速诊断。
【专利说明】
G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及检测G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂 盒，适于G种肠道病毒感染的诊断及组织或细胞中羊肠道病毒抗原的定位与鉴定。
【背景技术】
[0002] 羊G种肠道病毒(CEV)，属于小RNA病毒科肠道病毒属。羊肠道病毒感染是目前国内 外新发的一种临床上以消化道和呼吸道为主要特征的疫病，给养羊业带来严重威胁。申请 人于2014年从吉林多地爆发的一种临床上以严重腹泻，高发病率和高致死率为主要特征的 不明疫病中的山羊体内分离到G种肠道病毒CEV-JL14,经过序列测定与分析发现，所分离的 毒株是一种新的肠道病毒。目前，针对该类病毒或该类疫病尚没有特异性的检测与诊断方 法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为解决羊G种肠道病毒尚没有特异性的检测与诊断方法提供一种 检测G种肠道病毒的直接免疫荧光检测荧光试剂及其试剂盒。
[0004] 检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂，是用FITC标记(但不仅限于FITC，其他荧光染 料也可）的VP1单克隆抗体，所述的VP1单克隆抗体，是利用G种肠道病毒的VP1蛋白，采用杂 交瘤单抗制备技术获得;所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示； 所述的VP1蛋白是由碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的G种肠道病毒基因表达 的。所述的G种肠道病毒基因 ΚΡΛ可采用PCR技术，以G种肠道病毒基因组cDNA为模板扩增获 得，也可人工合成； G种肠道病毒直接免疫荧光检测试剂盒，免疫荧光试剂为上述检测G种肠道病毒的免疫 焚光试剂。
[0005] 本发明提供了检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，是应用本发明 的检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂建立的直接免疫荧光检测方法，既可用于临床快速诊 断G种肠道病毒感染，也可用于G种肠道病毒抗原在组织中的定位与鉴定。直接免疫荧光检 测时间短，40分钟内即可报告结果;特异性强，仅与G种肠道病毒反应;重复性好，准确性高， 与间接免疫荧光方法的符合率为90%以上，可用于G种肠道病毒感染的快速诊断。
[0006] 本发明的优点 1、 应用本发明试剂建立的直接免疫荧光方法，可用于临床快速诊断G种肠道病毒感染， 也可用于G种肠道病毒抗原在组织细胞中的定位与鉴定； 2、 直接免疫荧光方法特异性强、灵敏度高、具有很好的重复性。40分钟内报告结果，可 用于G种肠道病毒的快速诊断； 3、 具有生物安全性，试剂盒所用的抗G种肠道病毒VP1的单克隆抗体为原核载体表达的 重组蛋白诱导BALB/c小鼠产生，不含活的肠道病毒，因此不存在散毒危险； 4、 敏感性高，制备单克隆抗体具有很高的免疫效价，从而确保异硫氰酸荧光素(FITC) 标记后试剂的敏感性； 5、 特异性强，制备的免疫荧光试剂与其他病原体无交叉反应，只检出G种肠道病毒，具 有很尚特异性； 6、 稳定性好，荧光试剂4°C保存6个月，检测结果与常规方法无明显差异，具有很好的稳 定性。
【附图说明】
[0007] 图1 PGEX-4T-1-VP1重组质粒酶切鉴定结果（泳道M:DNA分子marker;泳道1 :pGEX-4T-1-VP1 EcoRI/XhoI双酶切；泳道2:pGEX-4T-1-VPl EcoRI单酶切）； 图2重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果(泳道Μ:蛋白质分子量marker;泳道1 : pGEX-4T-1-VP1重组菌未诱导总蛋白；泳道2:pGEX-4T-1-VPl重组菌诱导后总蛋白；泳道3:纯化后的 重组VP1蛋白）； 图3杂交瘤细胞染色体计数； 图4.直接免疫荧光检测结果。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1 G种肠道病毒结构蛋白VP1原核表达重组质粒的构建 1、 引物设计 根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增阶_7基因，上下游分别含有EcoRI、Xho頂每 切位点。引物序列如下： 上游引物：5' TTGAATTCCAGGCTGGGTATGTGACT 3'（EcoRI) 下游引物：5' TCTCGAGTTAATGAAAATCACTGAGGGGTT 3'（Xhol) 2、 基因扩增 常规Trizol法提取G种肠道病毒的基因组RNA，采用市售常规反转录试剂盒，按照说明 操作获得cDNA，并以其为模板扩增基因，PCR反应体系：
PCR 运行条件：94°C 预变性 3min;94°C 变性 1.5min、54°C 退火 40sec、72°C 延伸 40sec，共 35个循环;72°C再延伸6min。反应结束后，取lyL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0009] 3、目标基因与PGEX-4T-1的连接、转化 采用分子生物学领域中的常规酶切、连接等技术，构建重组质粒PGEX-4T-1-VP1，并采 用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态中。利用含1〇〇 yg/mL氨苄霉素的LB培养平 板筛选阳性克隆，并进行常规增菌培养，收获菌体，提取质粒，进行EcoRI/XhoI双酶切鉴定， 如图1所示。
[0010] 实施例2 VP1重组蛋白的表达及纯化 将鉴定的阳性重组质粒PGEX-4T-1-VP1转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后，涂板， 37°C培养过夜，挑取单个菌落接种到3 mL含有100 yg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中培养 过夜，然后取1 mL上述培养物接种到200 mL含有100 yg/rnL氨苄霉素的LB液体培养基中37 。(:振摇培养至对数生长期（0D6qq=0 · 6)，加入IPTG(终浓度1 mmo 1/L)，20 °C诱导培养3 h，经 SDS-PAGE检测，获得了重组目标蛋白VP1，如图2所示(泳道2)。离心沉淀菌体，超声破碎后 以1.5M尿素洗涤3次后获得高纯度的重组蛋白，如图2所示(泳道3)。
[0011] 实施例3抗G种肠道病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备 1、动物免疫:选择6-8周龄健康BALB/c小鼠，以弗氏完全佐剂乳化纯化的VP1蛋白，每只 小鼠腹腔注射l〇〇tig，14d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白腹腔注射lOOyg，最后一次加强免疫 时直接腹腔注射l〇〇yg纯化的蛋白，融合前3~4d尾静脉注射5(?^纯化的蛋白。
[0012] 2、细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内，以300Xg离心10 min，弃去上清，振荡细胞，使两种细胞尽量混合均匀，然后60s内缓慢滴加预热的PEG-^OO 溶液，再缓慢加入无血清的 1640 培养基终止融合，静置后再以 1 000 r/min 离心 10 min，弃去上清后加入HAT培养基，使细胞混匀悬浮，于96孔培养板中培养，第14d开始换 液，并检测杂交瘤细胞。
[0013] 3、杂交瘤细胞克隆的筛选:采用间接ELI SA方法，即用纯化的VP 1蛋白作为包被抗 原，包被反应板，加入杂交瘤细胞的培养上清进行ELISA检测;对ELISA阳性的杂交瘤细胞进 行克隆，直至所有孔都为阳性。通过3次细胞克隆，获得20株杂交瘤细胞，其中用人工合成 VP1基因表达的VP1蛋白免疫，取免疫小鼠的脾细胞进行杂交，获得杂交瘤细胞12株;PCR方 法获得的基因，获得杂交瘤细胞8株； 按上述方法，经多次重复，均获得了筛选到了多株杂交瘤。
[0014] 4、单克隆抗体制备:取高压灭菌的石蜡油0.5 mL，注射到小鼠腹腔，7d后腹腔注入 1〇6个杂交瘤细胞，一周后抽取腹水，置37°c 24 h后4°C过夜，然后离心腹水，上清56°C灭活 30 min备用。
[0015] 5、单克隆抗体纯化：用4倍体积醋酸缓冲液稀释腹水，调至pH4.5，缓慢滴加3.3 % 的正辛酸，搅拌30 min，离心取上清，加入1/10体积的10倍roS，调至pH7.4,4°C预冷后用45 %饱和硫酸铵沉淀，离心后将沉淀以PBS溶解后移入透析袋，在50倍体积PBS中透析，透析期 间每6小时换液1次，透析结束后，以紫外分光光度计测定蛋白浓度并分装冻存。
[0016] 6、单克隆抗体特性鉴定 ⑴腹水效价确定。以间接ELISA方法测定。细胞培养上清与腹水以10X进行倍比稀释， 同时以SP2/0细胞培养上清和未接肿瘤细胞健康小鼠的腹水作为对照。检测确定出单抗的 腹水效价为6.4X105。
[0017] (2)抗VP1蛋白单克隆抗体IgG亚类鉴定。按小鼠 mAblgG亚类检测试剂盒说明书进 行。具体方法是将纯化的每株单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板，每孔100 tiL，37°C孵育 1 h，洗涤后每孔加入1000倍稀释的抗体亚类试剂100 tiL，37°C孵育1 h，洗涤3遍后，加入羊 抗小鼠 IgG酶标二抗，37°C孵育1 h，确定单克隆抗体的亚类为IgGl。
[0018] (3)杂交瘤细胞株染色体的分析采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分 析，结果显示杂交瘤细胞的染色体数目为86-90条。
[0019] (4)抗VP1单克隆抗体特异性鉴定。将所获单克隆抗体分别与口蹄疫病毒(FMDV)、 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛细小病毒(BPV)进行间接ELISA，结果显示，制备的单克隆抗体 与其它病毒病均无交叉反应性，鉴定结果见表1
。
[0020] 实施例4免疫荧光抗体的制备 1、抗体稀释:将VP1单克隆抗体以碳酸盐缓冲液(0.025 M pH9.2 CBS)稀释为蛋白浓度 为10 mg/mL，装入透析袋中备用。
[0021] 2、荧光素溶液制备：称取异硫氰酸荧光素(FITC)，用0.025 M pH9.2 CBS配制成 0.1 mg/mL，磁力搅拌避光溶解。
[0022] 3、抗体标记:将抗体和荧光色素混合，加入到透析袋4°C避光标记24 h。
[0023] 4、焚光标记抗体的纯化:取出透析袋中的标记抗体，1000 r/min离心3 min，取上 清液过SephandxG-50层析柱，用灭菌0.01 M pH7.2 PBS洗脱，除去游离的荧光素和盐;分管 收集第一峰，适当浓缩，测定其工作浓度后分装，保存于_20°C备用，即为牛肠道病毒免疫荧 光诊断试剂。
[0024] 实施例5直接免疫荧光试验方法的建立 1、CEV感染细胞的制备:将G种肠道病毒(CEV)接种于已长成单层的96孔RAW264.7细胞 培养板，同时设正常RAW264.7细胞为阴性对照;于37°C 5% C02条件下培养至细胞病变达30 %左右时，弃上清液，以无菌PBS或生理盐水洗涤1，每孔加入冷甲醇100 tiL，4°C固定30 min，弃去固定液同前洗涤1次，-20 °C冻存备用。
[0025] 2、直接免疫荧光试验操作方法:取CEV感染细胞板，加入适量经1 % BSA- PBS稀释 的上述免疫荧光试剂工作液，置于湿盒内，37°C感作30 min，用roS或生理盐水洗涤3次后， 每孔加30 uL抗荧光衰减封片剂(50 %甘油-PBS)，置倒置荧光显微镜下观察，以出现亮绿色 荧光病灶判定阳性结果，拍照保存。同时设未接种病毒的正常细胞孔作为阴性对照。
[0026]实施例6免疫荧光试剂特性鉴定 1、荧光试剂工作浓度的确定:取实施例5中制备的感染细胞板和阴性细胞板作为对照， 每孔分别加入预先经1 % BSA-PBS系列稀释的免疫荧光试剂，进行直接免疫荧光试验，以出 现清晰、明亮、特异性荧光的稀释倍数为试剂的最大稀释倍数。结果显示，荧光试剂的最高 稀释倍数为1:1000。为保证试剂的敏感性和荧光强度，确定工作浓度为1:500。
[0027] 2、焚光试剂的特异性检测：将焚光抗体适当稀释后，分别与FMDV、BVDV和BPV感染 的细胞感作，同时设阴性对照，每孔加1:500稀释的荧光试剂30 uL，进行直接免疫荧光试验 试验。结果显示，在荧光显微镜下仅CEV感染细胞孔出现亮绿色荧光病灶，呈阳性反应，直接 免疫荧光试验的荧光特性与IFA相同；而其它病毒感染细胞及正常RAW264.7细胞均无交叉 反应。表明制备的免疫荧光试剂特异性好，可用于CEV感染细胞的鉴定，见表2。
[0028] 3、免疫荧光试剂的重复性和稳定性检测:在96孔细胞培养板中进行，将抗VP1荧光试剂 分装后分别置-20 °C保存1、2、3、4、5和6个月后，对CEV感染细胞进行直接免疫荧光试验试 验，测定试剂保存期和批内批间重复性。结果显示，在-20°C保存至6个月荧光效价不变，因 此其保存期为6个月；同时，批内和批间重复性较好，质量稳定。
[0029]实施例7其他颜色荧光染料标记 采用红色荧光料PE，按照实施例4操作，标记抗G种病毒VP1单克隆抗体获得的免疫荧光 试剂，其检测效果与FITC标记的免疫荧光试剂相似。
【主权项】
1. 检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于:是用荧光染料也可标记的VP1单克 隆抗体，所述的VP1单克隆抗体，是利用G种肠道病毒的VP1蛋白，采用杂交瘤单抗制备技术 获得;所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2. 根据权利要求1所述的检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于:所述的VP1蛋 白是由碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的G种肠道病毒基因表达的。3. 根据权利要求2所述的检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于:所述的G种肠 道病毒基因为人工合成。4. 根据权利要求1、2或3所述的检测G种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于:所述的 荧光染料FITC标记。 5. G种肠道病毒直接免疫荧光检测试剂盒，免疫荧光试剂为权利要求1所述的检测G种 肠道病毒的免疫焚光试剂。
【文档编号】G01N33/577GK105974119SQ201610444162
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】王新平, 鲁海冰, 郭昌明, 王明月, 刘亚静, 张群, 朱利塞, 王芳
【申请人】吉林大学