一种NT-proBNP荧光免疫试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种NT-pr〇BNP荧光免疫试剂及其制备方法，属于医学检验测定技术 领域。
[0002] 本专利文件中所涉及之术语含义：
[0003] 0. 9% NaCl :表示配置完成后的溶液中每100mL含NaClO. 9g。
[0004] 类似格式均表示类似含义，本文另有说明的除外。
【背景技术】
[0005] 心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段，具有较高的死亡率，相当于一些恶性 肿瘤，研究显示心力衰竭的死亡率为43%，5年死亡率达90%，重度心力衰竭的死亡率更 高。脑利钠肽（BNP)由于心室受到牵拉刺激或者张力升高而分泌，能够早期反映整体甚 至局部心脏结构改变导致的功能变化。BNP来自心室肌细胞，最初合成的为前脑利钠肽原 (pre-proBNP)，是由134个氨基酸组成的多肽链。pre-proBNP在心肌细胞中裂解为脑利钠 肽原（proBNP，108个氨基酸）和信号肽（26个氨基酸）。proBNP进入血液后裂解为具有生 理活性的BNP和氨基端-脑利钠肽原（NT-proBNP)，理论上两者是I : 1的关系。
[0006] 相对于BNP，NT-proBNP具有更长的血浆半衰期（60-120分钟），BNP的血浆半衰期 只有20分钟。NT-proBNP在血液中的分泌和存在具有累积作用，实际存在比BNP的浓度更 高，更容易被检测到，即检测的敏感性提高，NT-proBNP更容易反映早期或者轻微心脏功能 的变化。NT-proBNP具有更低的个体差异，不受个体生理性节律的影响。体外存放稳定性 好，室温下可达3天，对标本运送、保存等非常重要。
[0007] NT-proBNP与临床心衰的严重程度成比例，心衰越严重，NT-proBNP就越高；而且 NT-proBNP能够区分轻度心衰和心功能正常者。鉴于NT-proBNP优于BNP对心力衰竭的诊 断特点，2000年左右，国际上已经认定是NT-proBNP测定心衰的一个划时代的具有特异性 的标志物。
[0008] 目前国内外已有商品化的NT-proBNP试剂盒，如美国罗氏生产的NT-proBNP免 疫检测试剂盒通过了美国FDA得认证，用于对充血性心衰的辅助诊断，使用了电化学发光 的方法，灵敏度和精密度，准确度都很好，但是试剂价格昂贵。国外另有一些公司生产的 NT-proBNP试剂盒利用酶联免疫技术开发。国内一些公司的N端脑钠肽原检测试剂采用了 胶体金的技术等，存在诸多缺点，如酶联免疫试剂不稳定，血清实验中的干扰严重，样品垫 对红细胞的拦截效果差，分辨率低，胶体金为定性检测或半定量检测等等。随着医学诊断技 术向微量，高灵敏度，高特异性方向发展，酶联免疫，胶体金等技术已经出现不适应倾向。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种可降低血清实验中 的干扰，使样品垫对红细胞的拦截效果好的NT-proBNP荧光免疫试剂。
[0010] 本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种NT-proBNP荧光免疫试剂，所述 NT-proBNP荧光免疫试剂包括标记用NT-proBNPl抗体、标记用羊抗鸡IgY抗体、包被用 NT-pr〇BNP2抗体、包被用鸡IgY抗体、粒子重悬液、样品垫处理液，其中各组分：
[0011] 标记用 NT-proBNPl 抗体：100-300 μ g/lmg 荧光粒子；
[0012] 标记用羊抗鸡IgY抗体：100-300 μ g/lmg荧光粒子；
[0013] NC膜上划线的包被用NT-proBNP2抗体：2-3mg/ml，划线量：1 μ Ι/cm ;
[0014] NC膜上划线的包被用鸡IgY抗体：2-3mg/ml，划线量：1 μ 1/cm ;
[0015] 粒子重悬液：含 100-200mM Tris 的 Tris-HCl 重悬液，pH 8-9 ;
[0016] 样品垫处理液：IOmM PBS，pH 7-8。
[0017] 在上述NT-proBNP荧光免疫试剂中，所述的Tris-HCl重悬液还含250-500 μ g/ml 鼠 IgG，1-5 %小牛血清，0· 1-0. 5 % Pluronic F68,0· 5-1 %酪蛋白，0· 9 % NaCl，0· 05 % NaN3。
[0018] 作为优选，所述的鼠 IgG、小牛血清在加入粒子重悬液前均先在55_60°C下处理 IOmin0
[0019] 在上述NT-proBNP荧光免疫试剂中，所述的PBS还含0. lmg/ml-0. 5mg/ml植物凝 集素。
[0020] -种上述的NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法，所述的制备方法包括粒子标 记、样品垫预处理、抗体在NC膜上的包被、以及试纸组装，其中，粒子标记为在粒子中同时 加入EDC、NHS、BSA，以及NT-proBNPl抗体或羊抗鸡IgY抗体，在 45-55°C下交联反应2h;交 联后先清洗、乙醇胺封闭，然后用粒子重悬液重悬分别得NT-proBNPl抗体标记的荧光粒子 或羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒子，最后将NT-proBNPl抗体标记的荧光粒子和羊抗鸡IgY 抗体标记的焚光粒子混合得到粒子浓度分别为0. 1-0. 5mg/ml和0. 001-0. 01mg/ml的粒子 混合液。
[0021] 本发明NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法生产方便，在粒子标记时可以同时加 入EDC、NHS、BSA，以及NT-proBNPl抗体或羊抗鸡IgY抗体。与现有技术中37°C左右交联相 比，本发明在45-55Γ下交联反应标记的粒子更加稳定，受血清干扰物质干扰相对较少。
[0022] 在上述NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法中，在粒子标记中，交联反应前 NT-proBNPl抗体、羊抗鸡IgY抗体均分别在45-55°C水浴中孵育24-48小时。通过不断试 验发现，将NT-proBNPl抗体、羊抗鸡IgY抗体在交联反应前先进过上述处理后抗体相对稳 定，检测结果也会相对稳定，血清相关性也会有所提尚。
[0023] 在上述NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法中，在粒子标记中，加入少量BSA可以 降低试剂本底。
[0024] 进一步的，粒子标记的具体步骤为：
[0025] 在 Img 粒子中同时加入 0· 5mg_lmg EDC、0. 5mg_lmg NHS，10-20 μ g BSA，以及 100-300 μ g NT-proBNPl抗体或100-300 μ g羊抗鸡IgY抗体，在45-55°C下交联反应2h ;
[0026] 交联后先用IOmM PBS pH 7. 4清洗，再用40mM乙醇胺37度封闭1小时，接着用 粒子重悬液重悬分别得NT-proBNPl抗体标记的荧光粒子和羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒 子；
[0027] 将NT-proBNPl抗体标记的焚光粒子和羊抗鸡IgY抗体标记的焚光粒子混合在一 起，得到粒子浓度分别为0.卜〇. 5mg/ml和0. 001-0. 01mg/ml的粒子混合液。
[0028] 与现有技术相比，本发明NT-proBNP荧光免疫试剂的组分配方合理有效，通过将 荧光粒子分别与NT-proBNPl抗体、羊抗鸡IgY抗体进行稳定简单有效率的交联，再将交联 后的两种荧光粒子用特定的粒子重悬液重悬处理混合，同时采用含植物凝集素的样品垫处 理液处理样品，使制得的NT-proBNP荧光免疫试剂灵敏度较高、应用范围广泛，可降低血清 实验中的干扰，对红细胞具有更好的拦截效果。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明试纸的结构示意图。
[0030] 图2为本发明实施例6中试剂的实际检测浓度平均值与理论浓度的线性回归分析 图。
[0031] 图3为本发明实施例6中的试剂与对比例1中的试剂比对临床血清样品的相关性 分析图。
[0032] 图4为对比例1中的试剂与对比例2中的试剂比对临床血清样品的相关性分析 图。
[0033] 图5为本发明实施例6中的试剂与对比例3中的试剂比对临床全血样品的滤血效 果图（箭头所指为样品垫和NC膜交界处）。
[0034] 附图标记列表：1、PVC胶板；2、样品垫；3、醋酸纤维膜；4、吸水纸。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图和【具体实施方式】，进一步阐明本发明，应理解下述【具体实施方式】仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下面描述中使用的词语"前"、 "后"、"左"、"右"、"上"和"下"指的是附图中的方向，词语"内"和"外"分别指的是朝向或 远离特定部件几何中心的方向。
[0036] 如图1所示，所述的试纸包括样品垫2、醋酸纤维膜3、吸水纸4和PVC胶板1，所述 样品垫2、醋酸纤维膜3、吸水纸4和PVC胶板1均为长条形，所述样品垫2、醋酸纤维膜3和 吸水纸4均设置在PVC胶板1的表面，所述样品垫2、醋酸纤维膜3和吸水纸4顺次由PVC 胶板1 一端向PVC胶板1另一端设置。
[0037] 进一步优选，所述样品垫2与醋酸纤维膜3相邻端、醋酸纤维膜3与吸水纸4相邻 端重叠，重叠部分宽度均为2_，所述样品垫2与醋酸纤维膜3相邻端为样品垫2叠放在醋 酸纤维膜3上，所述醋酸纤维膜3与吸水纸4相邻端为醋酸纤维膜3叠放在吸水纸4上。通 过叠放部分形成不同结构间良好的桥接作用，便于展开剂展开并且与介质充分接触，提高 试纸响应速度、改善检测效果和检测稳定性。
[0038] 再进一步优选，所述样品垫2、醋酸纤维膜3、吸水纸4和PVC胶板1均为等宽长条 开多，宽度为4mm，所述样品垫2的长度为20mm，醋酸纤维膜3的长度为25mm，吸水纸4的长度 为19mm。如此不仅规格整齐，还可以保证试纸具有稳定的结构便于保存，同时能够保证在稳 定的尺寸下，保证层析过程具有良好的稳定性和显示平滑性。
[0039] 实施例1
[0040] -种NT-proBNP荧光免疫试剂，所述NT-proBNP荧光免疫试剂包括标记用 NT-proBNPl抗体、标记用羊抗鸡IgY抗体、包被用NT-proBNP2抗体、包被用鸡IgY抗体、 粒子重悬液、样品垫处理液，其中粒子重悬液：含250 μ g/ml鼠 IgG，l %小牛血清，0. 1% Pluronic F68,0. 6%酪蛋白，0· 9% NaCl，0. 05% NaN3, IOOmM Tris 的 Tris-HCl 重悬液，pH 8 ;其中，所述的鼠 IgG、小牛血清在加入粒子重悬液前均先在55°C下处理IOmin ;样品垫处 理液：10mM PBS (含0· lmg/ml植物凝集素 ），pH 7。
[0041] 实施例2
[0042] -种NT-proBNP荧光免疫试剂，所述NT-proBNP荧光免疫试剂包括标记用 NT-proBNPl抗体、标记用羊抗鸡IgY抗体、包被用NT-proBNP2抗体、包被用鸡IgY抗体