一种st2定量检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种ST2定量检测方法及试剂盒，属于临床诊断和生物科学领域。本发明的检测方法为竞争法胶乳增强比浊检测ST2，该方法使用胶乳偶联的ST2与样本中的ST2竞争结合ST2抗体从而引起浊度变化，推算ST2含量。本发明的试剂盒包括试剂1和试剂2，其中，试剂1中的组分包括缓冲液、ST2抗体、促凝剂、防腐剂。试剂2中的组分包括缓冲液、胶乳微球偶联的ST2、稳定剂、防腐剂。该方法及试剂盒灵敏度高，特异性强，反应速度高，可直接应用于全自动生化分析仪，有利于临床推广及应用。
【专利说明】
一种ST2定量检测方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于临床诊断和生物科学技术领域，具体的，本发明提供了一种ST2定量检 测试剂盒及其制备方法。本发明的方法及试剂盒测定简便，灵敏度高，特异性强，稳定性好， 为ST2检测的一种方便实用的检测方法。
【背景技术】
[0002] ST2是1989年由Tominaga等作为白介素-1受体家族的新成员被发现，参与多种病 理生理过程，具有免疫调节功能，尤其在各种炎症性和变态反应疾病中发挥重要作用。由于 当时未发现功能性配体，2005年以前一直认为是孤儿受体，2005年，Schmitz等发现IL-33作 为ST2的特异性功能配体，实际ST2是一种心肌蛋白，分泌后会阻断IL-33的作用，IL-33具有 抗心肌肥大和抗心肌纤维化的作用。ST2表达于肥大细胞、激活的辅助性T细胞2、巨噬细胞 和心肌细胞。ST2在心肌受到过度牵拉造成损失的过程中会大量产生，生成的ST2阻断IL-33 的作用，使心肌缺乏足够的IL-33的保护，从而加速心肌重构和心室功能障碍，最终导致死 亡风险增加。
[0003] ST2包括4种亚型：85了2、5了21^、5了2￥、5了21^。其中，85了2为分泌型5了2，可分泌到细胞 外，为IL-33的诱骗受体，抑制其信号传导。在PRIDE研究中，208名急性心衰患者sST2水平显 著增高，回顾分析1年后死亡患者血清sST2水平明显高于生存者，sST2与心衰患者的一年 后的死亡风险呈剂量依赖的关系，多因素分析sST2预测一年的死亡率价值高。Weinberg进 一步研究探讨了非缺血性心衰患者(ΝΥΗΑΙΠ-IV级;EF〈30%)发现，sST2是心衰两周后心脏 移植和死亡的独立预测因子。总之，血清sST2水平升高伴有病死率的升高，是心力衰竭预后 差的标志。
[0004] ST2作为一种新型心衰标志物，目前仅有日本SML公司有一个科研使用的ELISA方 法检测试剂盒，并未有成型的商品化的检测试剂应用于临床并获得相关药监部门批准。胶 乳免疫比浊法作为近年来发展迅速的生化检测方法，由于其操作简便，耗时较短，灵敏度大 幅度提高而受到各种项目检测的青睐。采用竞争胶乳比浊法检测ST2作为一种先进的诊断 方法对于临床应用有巨大的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种简便、准确、快速的ST2定量检测方法。
[0006] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中样本先与ST2抗体结合，与ST2免疫 原偶联的胶乳微球形成竞争结合的关系，随着样本中ST2浓度的增加，引起胶乳凝集度降 低。
[0007] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中，ST2抗原首先同胶乳微球偶联形成 致敏微球，ST2偶联的胶乳微球与抗体可形成本底的凝集反应;测定时，样本中的ST2先与抗 体反应形成复合物，从而竞争ST2欧联的胶乳微球与抗体的反应，可造成凝集反应的减少， 凝集度可通过全自动生化分析仪检测，并以数字的形式表示为吸光度变化A，可通过凝集度 的变化推算样本中ST2含量。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一个检测ST2的定量检测试剂盒。该试剂盒简便、灵 敏度高、重复性好、具有很好的临床应用前景。
[0009] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中该试剂盒包含试剂1，试剂2， 其特征在于样本来源于任何包含水的液态物质，优选地，样本为尿液或血液。
[0010] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂1为包含缓冲液、ST2抗体、促凝 剂和防腐剂的混合物。缓冲液为PH7.0-8.0的50mMTRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液或磷酸缓冲 液;ST2抗体为ST2免疫获得的高灵敏度的兔多克隆抗体或单克隆抗体，含量为10-100ug/ ml;促凝剂为含量为0.05%-3%的聚乙二醇6000。
[0011] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂2为包含缓冲液、ST2偶联的胶 乳微球、稳定剂和防腐剂的混合物。缓冲液为PH7.0-8.0的50mMTRI S缓冲液、甘氨酸缓冲液 或磷酸缓冲液;稳定剂为含量为〇. 1%_1%的牛血清白蛋白。
[0012] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中ST2偶联的胶乳微球，选择的微球为 表面含有羧基的聚苯乙烯微球，粒径为110nm-200nm;通过碳化二亚胺活化后，加入10-100ug/ml的ST2混合反应3h形成可与ST2抗体形成凝集反应的致敏微球。
[0013] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中该试剂盒测定前需使用校准品进行 标定，该试剂盒选用的校准品为添加了 ST2纯品的人血清或其它类似血清基质的液体。优选 地，选择添加了 ST2纯品的牛血清白蛋白基质的液体。
【附图说明】
[0014] 图1 ST2试剂盒(实施例1)标准曲线； 图2 ST2试剂盒线性范围测定曲线。
【具体实施方式】
[0015] 实施实例一:ST2偶联的胶乳微球的制备 根据本发明目的，首先制备ST2偶联的胶乳微球，制备方法如下:a.将以下几种组分混 合对微球进行活化：1%的150nm羧基聚苯乙烯微球，50mMMES缓冲液，5mM碳化二亚胺，2mM NHS混合均匀，震荡活化30min; b. lOOOOrpm离心20min，除去活化剂；c. 50mM磷酸缓冲重悬， 并加入100ug/ml ST2蛋白，均勾混合3h;d. lOOOOrpm离心20min，除去未结合的蛋白；e.按 照终浓度0.1%的致敏颗粒含量加入PH7.4含0.1%牛血清白蛋白的50mM磷酸缓冲液作为稳定 剂制备成试剂2。
[0016] 实施实例二:试剂盒组成 本试剂盒包含以下几部分： 表1:试剂组成成分
实施实例三:测量程序确定 校准品选择含1%BSA的roS缓冲液稀释ST2蛋白，将浓度稀释为0.125、0.25、 1、2、4共5种浓度梯度使用全自动生化分析仪，选择600nm波长进行检测，按照试剂1:试 剂2:样本=180:60:25ul的参数进行检测，检测时，先加入试剂1和样本混合5分钟后，加入试 剂2混匀30秒后，读取吸光度1，4.5分钟后读取吸光度2,以这两点的差值为判断标准作标准 曲线，见图1。最终根据该标准曲线推算样本中ST2含量。
[0017] 实施实例四：试剂盒分析性能测定 试剂盒线性检测：另取高于线性范围的ST2蛋白样本和低值样本按照不同比例混合测 定，最终使用测定值与理论值进行曲线拟合，拟合后线性相关系数大于0.99,则说明线性较 好，具体数据见图2。
[0018] 试剂盒重复性检测：临床收集10个样本，用该试剂盒重复检测20次，求出均值，并 算出变异系数。变异系数小于15%时，则说明试剂盒具有较好的重复性。
[0019] 表2:试剂盒重复性检测
【主权项】
1. 一种ST2定量检测方法，样本先与ST2抗体结合，与ST2免疫原偶联的胶乳微球形成竞 争结合的关系，随着样本中ST2浓度的增加，引起胶乳凝集度降低。2. 根据权利要求1所述的ST2定量检测方法，其特征在于ST2偶联的胶乳微球与抗体可 形成本底的凝集反应，凝集度可通过全自动生化分析仪检测。3. 根据权利要求1所述的ST2定量检测方法，其特征在于使用时样本中ST2先与抗体反 应形成复合物，从而竞争ST2欧联的胶乳微球与抗体的反应，可造成凝集反应的减少，可通 过凝集度的变化推算样本中ST2含量。4. 一种ST2定量检测试剂盒，包含试剂1，试剂2。5. 根据权利要求4所述的ST2定量检测试剂盒，其特征在于试剂1为包含缓冲液、ST2抗 体、促凝剂和防腐剂的混合物。6. 根据权利要求5所述的ST2定量检测试剂盒试剂1，其特征在于缓冲液为提供抗原抗 体反应最适条件的缓冲液，可以为TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液或磷酸缓冲液；优选地， PH7.0-8.0的50mM磷酸缓冲液。7. 根据权利要求5所述的ST2定量检测试剂盒试剂1，其特征在于ST2抗体为ST2免疫获 得的高灵敏度的兔多克隆抗体或单克隆抗体，含量为l〇-l〇〇ug/ml，其含量低于可结合的 ST2含量。8. 根据权利要求5所述的ST2定量检测试剂盒试剂1，其特征在于促凝剂为促进免疫反 应的物质，为不同分子量聚乙二醇，优选地，聚乙二醇6000，含量为0.05%-3%。9. 根据权利要求4所述的ST2定量检测试剂盒，其特征在于试剂2为包含缓冲液、ST2偶 联的胶乳微球、稳定剂和防腐剂的混合物。10. 根据权利要求9所述的ST2定量检测试剂盒试剂2，其特征在于缓冲液为提供抗原抗 体反应最适条件的缓冲液，可以为TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液或磷酸缓冲液；优选地， PH7.0-8.0的50mM磷酸缓冲液。11. 根据权利要求9所述的ST2定量检测试剂盒试剂2,其特征在于ST2偶联的胶乳微球， 选择的微球为表面含有羧基的聚苯乙稀微球，粒径为1 l〇nm-200nm;通过碳化二亚胺活化 后，加入10-100ug/ml的ST2混合反应3h形成可与ST2抗体形成凝集反应的致敏微球。12. 根据权利要求9所述的ST2定量检测试剂盒试剂2,其特征在于稳定剂为BSA，含量为 0.1%-1%〇13. 根据权利要求4所述的ST2定量检测试剂盒，其特征在于，测定前需使用校准品进行 标定，该试剂盒选用的校准品为添加了 ST2纯品的人血清或其它类似血清基质的液体;优选 地，选择添加了 ST2纯品的牛血清白蛋白基质的液体。
【文档编号】G01N33/543GK106018789SQ201610627067
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月3日
【发明人】周建平
【申请人】北京德奥平生物技术有限公司